甘桔汤总皂苷抗炎作用机理研究
【摘要】 目的 探讨甘桔汤总皂苷抗炎作用的机理。方法 通过采用多种非特异性炎症模型进行实验探讨。结果 甘桔汤总皂苷抗炎作用不依赖于垂体-肾上腺皮质系统，但与其抑制多种组织源性炎症介质密切相关。如明显抑制炎症组织中的组胺的释放;降低炎症渗出液中PLA 2 及PGE 2 活性或含量;降低致炎性细胞因子IL-1及TNF的活性等。结论 抑制多种组织源性炎症介质，这是甘桔汤总皂苷抗炎的重要机制。
关键词 甘桔汤总皂苷 炎症 PLA 2 PGE 2 IL-1 TNF
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)06-0873-03
Mechanism of ganjietang total saponins on anti-inflammation effects
, 百拇医药
Qi Yun，Shen Yingjun，Wang Wenkui，et al.
Department of Pharmacology，Institute of Medicinal Plant Development，CAMS and PUMC，Beijing100094.
【Abstract】 Objective The aim of experiment was to study on the mechanism of Ganjietang total saponins(simply called as GJTTS)on anti-inflammation effects.Methods Various non-specific inflammation models were used in this experiment.Results The results indicated that its anti-inflammation effects don’t depend on the system of hypophysis-adrenocortical.The anti-inflammation effects of GJTTSare concern in inhibiting inflammation medium of rooting in tissue.For example，GJTTS could obviously decrease the release of histamin(His)and prostagland in E2 (PGE 2 )in inflammatory tissue，inhibit the activity of PLA 2 in inflammatory area，antagonize the abnormal increase of cytokine such as interleukin-1(IL-1)and tumor necrosis factor(TNF)in the body or in the inflammatory rat’s modˉel.Conclusion The mechanism of ganjietang total saponins on anti-inflammation effects lies in inhibiting inflammaˉtion medium of rooting in tissue.
, 百拇医药
Key words ganjietang total saponins(GJTTS) inflammation PLA 2 PGE 2 IL-1TNF
甘桔汤原名桔梗汤，出于汉代张仲景《伤寒论》，主要用于治疗少阴咽痛。该方后世多称甘桔汤，为中医临床治疗咽喉肿痛的祖方，后代以此为基础方加味化裁的方剂不胜枚举。而从现代医学的角度审视，咽喉肿痛多与咽喉部急慢性炎症直接关联，通过实验研究，发现其抗炎作用明显 [1] 。本文对其如何发挥抗炎作用作如下探讨。
1 材料
1.1 实验药物 甘桔汤总皂苷制备同文献 [1] 。
1.2 动物 昆明种雄性小鼠，体重18～22g或23～25g，SD雄性大鼠，体重160～200g，国家医药管理局四川抗生素工业研究所提供，动物合格号为川实动物管第83号。
, 百拇医药
1.3 试剂与仪器 角叉菜胶、rIL-1、rTNF、重组人细胞因子标准品、MTT(四甲基偶氮唑盐)、ADM(放线菌D)均为Sigma公司产品，RPMI-1640细胞培养液及FCS(胎牛血清)公司，购自GIBCO鼠用皮质酮测定药盒，为DPC(Diagnostic Products Corporation)产品， 3 H-TdR( 3 H标记胸腺嘧啶核苷)为上海原子核研究所产品，磷酸组织胺，中国科学院上海生物化学研究所。其他试剂均为国产分析纯。FJ-2008r计数器，西安二六二厂，RF-510荧光分光光度计，日本岛津，PH S -3C精密pH计(数显)，上海雷磁仪器厂，酶标免疫检测仪，华东电子管厂。6000IC液体闪烁计数仪，Beckman公司。
2 方法与结果
2.1 对摘除肾上腺小鼠的抗炎作用 [2] (组织胺致足肿胀法) 雄性小鼠常规喂养2天，第三天行双侧肾上腺摘除术，术后给予糖盐水(0.9%NaCl，5%葡萄糖)并肌注青霉素3天以抗感染，从术后第四天，按体重随机分为5组(分组见表1)，每组动物连续灌胃给药5天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。末次给药后30min在每小鼠左后足跖皮下注射0.2%磷酸组织胺0.3ml，4h后沿踝关节上的观察致炎前后标记线剪下左右后足，以左右足重量差为足肿胀度，结果见表1。
, http://www.100md.com
2.2 对大鼠胸腺及肾上腺重量及肾上腺中维生素C及胆固醇含量的影响 雄性SD大鼠按体重随机分为4组(分组见表2)，每组动物连续灌胃给药8天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。末次给药后1h，断头(采血备用)处死动物，取胸腺、双侧肾上腺称重，计算相应的胸腺指数及肾上腺指数，其中取右侧肾上腺以5%三氯乙酸匀浆，按文献方法 [3] 测定肾上腺中所含维生素C及胆固醇含量。结果见表2。
2.3 对大鼠血清皮质酮含量的影响 [3] 取2.2实验中NS组、甘桔汤总皂苷小剂量组及大剂量组动物血清，按试剂盒固相放免的方法进行大鼠血清皮质酮含量测定，测定数据经RIA分析软件四参数质量作用模型进行分析处理，结果见表3。
表1 甘桔汤总皂苷对组织胺致摘除肾上腺小鼠足肿胀的影响
注:与对照组比较， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01，以下同
, 百拇医药
表2 甘桔汤总皂苷对大鼠胸腺及肾上腺重量及肾上腺中维生素C及胆固醇含量的影响
表3 甘桔汤总皂苷对大鼠血清皮质酮含量的影响
2.4 对小鼠炎症组织中组织胺含量的影响 雄性小鼠按体重随机分为5组(分组见表4)，每组动物连续灌胃给药5天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。末次给药后60min后在小鼠左足跖皮下注射1%角叉菜胶0.03ml，4h后沿踝关节上的标记线剪下左足称重后，剪碎浸泡1.5ml生理盐水中，30min后缓缓加入25%(W/V)三氯乙酸0.5ml，充分混匀，4000rpm10min，取上清液1.6ml按文献荧光测定方法 [4] 测定组织胺含量，结果见表4。
表4 甘桔汤总皂苷对小鼠炎症组织中组织胺含量的影响
2.5 对大鼠胸膜炎渗出液中PGE 2 及PLA 2 的影响取健康雄性大鼠38只，按体重随机分为5组(分组见表5)，每组运动连续给药7天，正常组及模型组给予等体积生理盐水，于末次给药30min后，模型组及各给药组动物分别用乙醚轻度麻醉后，向右胸膜腔内注入1%角叉菜胶0.2ml/100g体重，正常对照组注入等体积生理盐水，致炎后4h各组动物灌胃给予相应药物或生理盐水。8h后断头处死，用吸管将胸膜腔内全部渗出液吸出，再以无钙镁Hank液2ml冲洗胸腔，冲洗液与渗出液合并离心，取上清液0.3ml加0.5mol/L KOH-甲醇溶液2ml。在50℃下异构化20min，用甲醇稀释至4ml，于751紫外分光光度计波长278nm处测定其吸光度值代表PGE 2 含量 [5] ，取上清液按酸碱滴定法 [6] 测定PLA 2 活性，以所消耗盐酸量代表酶活性，结果见表5。
, 百拇医药
表5 甘桔汤总皂苷对大鼠胸膜炎渗出液中PGE 2 及PLA 2 的影响
2.6 对大鼠腹腔巨噬细胞IL-1活性的影响 [7] 在无菌条件下取2.5实验大鼠腹腔液(以5ml无菌无钙镁Hank’s液冲洗腹腔，收集冲洗液)，进行巨噬细胞中IL-1活性测定，测定方法如下:无菌条件下取大鼠腹腔液，用Hank’s液洗涤2次，无血清RPMI1640洗涤1次，用5%FCS-RPMI1640调制成4×10 6 /ml细胞悬液，取1ml于康氏管中，37℃，95%O 2 ，5%CO 2 条件下培养72h，反复冻融，4℃保存，取C 57 小鼠，在无菌条件下取胸腺细胞，用5%FCS-RPMI1640调制成2×10 6 /ml细胞悬液，取胸腺细胞悬液和冻融上清各100μl加入96孔平底细胞培养板，每份样品作三复孔，同时作不同稀释度标准品rIL-1和培养液对照，然后加入ConA2ng/孔，平板置37℃95%O 2 、5%CO 2 条件下培养72h，终止培养前14h加入3H-TDR，1μCi/孔，用多细胞收集仪收集细胞，用液体闪烁计数仪测cpm值，按公式计算IL-1活性。结果见表6。
, 百拇医药
表6 甘桔汤总皂苷对大鼠腹腔巨噬细胞IL-1活性的影响
2.7 对大鼠胸膜炎模型渗出液中TNF活性的影响 在无菌条件下取2.5实验大鼠胸腔渗出液按MTT法测定渗出液中TNF活性 [8] ，测定方法如下:取对数生长期TNF杀伤敏感细胞L 929 ，用5%FCS-RPMI1640调制成1×10 6 /ml细胞悬液，在96孔平底细胞培养板中加入L 929 细胞悬液50μl/孔，培养上清液40μl/孔，AMD10μl/孔，置37℃95%O 2 、5%CO 2 条件下培养2h，再加入胸腔渗出液100μl/孔，每份样品作三复孔，同时作不同稀释度标准品rTNF和培养液对照，37℃95%O 2 、5%CO 2 条件下培养24h，终止培养前6h离心，去上清液110μl/孔，加入MTT10μl/孔，培养结束时加入20%SDS、50%DMF溶解液100μl/孔，3h后在酶标仪上测定OD570nm和0D630nm，按公式计算TNF活性。结果见表7。
, 百拇医药
3 讨论
甘桔汤有着悠久的应用历史，自张仲景《伤寒论》以之治疗“少阴咽痛”以来，该方成为治疗咽喉肿痛的祖剂，后世
表7 甘桔汤总皂苷对大鼠腹腔巨噬细胞TNF活性的影响
以此方为基础进行加味化裁的处方不胜枚举。通过我们以前的研究表明，甘桔汤抗炎作用明显。这可能是其成为治疗咽喉肿痛的祖剂的现代药理学基础，但甘桔汤总皂苷抗炎作用是通过哪些环节发挥的作用。通过研究，发现其抗炎作用不依赖于垂体-肾上腺皮质系统，但与甘桔汤总皂苷抑制多种组织源性炎症介质密切相关。如明显抑制炎症组织中的组胺的释放;降低炎症渗出液中PLA 2 及PGE 2 活性或含量;降低致炎性细胞因子IL-1及TNF的活性等，是甘桔汤总皂苷抗炎的重要机制。
参考文献
, http://www.100md.com
1 齐云，沈映君，王文魁，等.甘桔汤总皂苷抗炎作用研究:待发表.
2 徐淑云，卞如谦，陈修.药理实验方法学.第二版.北京:人民卫生出版社，1994，715.
3 徐叔云，卞如濂.药理实验方法学.北京:人民卫生出版社，1982，970.
4 向军俭，陈华粹.组胺的荧光测定法研究.中国医学科学院学报，1981，3(3):183.
5 陈奇.中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版社，1993，303.
6 陈思锋，吴中立.体液和组织磷脂酶A 2 简便快速测定法.第二军医大学学报，1989，10(3):254.
7 杨四旬，李晓玉.一种简便实用的IL-1测定方法.上海免疫学杂志，1989，9(6):363.
8 虞冠华，龙娜.MTT法快速测定TNF活性.细胞生物学杂志，1994，(1):48.
作者单位:100094北京中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所药理室
成都中医药大学
山西农业大学
(收稿日期:2004-03-07)
(编辑秋 实), http://www.100md.com
关键词 甘桔汤总皂苷 炎症 PLA 2 PGE 2 IL-1 TNF
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)06-0873-03
Mechanism of ganjietang total saponins on anti-inflammation effects
, 百拇医药
Qi Yun，Shen Yingjun，Wang Wenkui，et al.
Department of Pharmacology，Institute of Medicinal Plant Development，CAMS and PUMC，Beijing100094.
【Abstract】 Objective The aim of experiment was to study on the mechanism of Ganjietang total saponins(simply called as GJTTS)on anti-inflammation effects.Methods Various non-specific inflammation models were used in this experiment.Results The results indicated that its anti-inflammation effects don’t depend on the system of hypophysis-adrenocortical.The anti-inflammation effects of GJTTSare concern in inhibiting inflammation medium of rooting in tissue.For example，GJTTS could obviously decrease the release of histamin(His)and prostagland in E2 (PGE 2 )in inflammatory tissue，inhibit the activity of PLA 2 in inflammatory area，antagonize the abnormal increase of cytokine such as interleukin-1(IL-1)and tumor necrosis factor(TNF)in the body or in the inflammatory rat’s modˉel.Conclusion The mechanism of ganjietang total saponins on anti-inflammation effects lies in inhibiting inflammaˉtion medium of rooting in tissue.
, 百拇医药
Key words ganjietang total saponins(GJTTS) inflammation PLA 2 PGE 2 IL-1TNF
甘桔汤原名桔梗汤，出于汉代张仲景《伤寒论》，主要用于治疗少阴咽痛。该方后世多称甘桔汤，为中医临床治疗咽喉肿痛的祖方，后代以此为基础方加味化裁的方剂不胜枚举。而从现代医学的角度审视，咽喉肿痛多与咽喉部急慢性炎症直接关联，通过实验研究，发现其抗炎作用明显 [1] 。本文对其如何发挥抗炎作用作如下探讨。
1 材料
1.1 实验药物 甘桔汤总皂苷制备同文献 [1] 。
1.2 动物 昆明种雄性小鼠，体重18～22g或23～25g，SD雄性大鼠，体重160～200g，国家医药管理局四川抗生素工业研究所提供，动物合格号为川实动物管第83号。
, 百拇医药
1.3 试剂与仪器 角叉菜胶、rIL-1、rTNF、重组人细胞因子标准品、MTT(四甲基偶氮唑盐)、ADM(放线菌D)均为Sigma公司产品，RPMI-1640细胞培养液及FCS(胎牛血清)公司，购自GIBCO鼠用皮质酮测定药盒，为DPC(Diagnostic Products Corporation)产品， 3 H-TdR( 3 H标记胸腺嘧啶核苷)为上海原子核研究所产品，磷酸组织胺，中国科学院上海生物化学研究所。其他试剂均为国产分析纯。FJ-2008r计数器，西安二六二厂，RF-510荧光分光光度计，日本岛津，PH S -3C精密pH计(数显)，上海雷磁仪器厂，酶标免疫检测仪，华东电子管厂。6000IC液体闪烁计数仪，Beckman公司。
2 方法与结果
2.1 对摘除肾上腺小鼠的抗炎作用 [2] (组织胺致足肿胀法) 雄性小鼠常规喂养2天，第三天行双侧肾上腺摘除术，术后给予糖盐水(0.9%NaCl，5%葡萄糖)并肌注青霉素3天以抗感染，从术后第四天，按体重随机分为5组(分组见表1)，每组动物连续灌胃给药5天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。末次给药后30min在每小鼠左后足跖皮下注射0.2%磷酸组织胺0.3ml，4h后沿踝关节上的观察致炎前后标记线剪下左右后足，以左右足重量差为足肿胀度，结果见表1。
, http://www.100md.com
2.2 对大鼠胸腺及肾上腺重量及肾上腺中维生素C及胆固醇含量的影响 雄性SD大鼠按体重随机分为4组(分组见表2)，每组动物连续灌胃给药8天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。末次给药后1h，断头(采血备用)处死动物，取胸腺、双侧肾上腺称重，计算相应的胸腺指数及肾上腺指数，其中取右侧肾上腺以5%三氯乙酸匀浆，按文献方法 [3] 测定肾上腺中所含维生素C及胆固醇含量。结果见表2。
2.3 对大鼠血清皮质酮含量的影响 [3] 取2.2实验中NS组、甘桔汤总皂苷小剂量组及大剂量组动物血清，按试剂盒固相放免的方法进行大鼠血清皮质酮含量测定，测定数据经RIA分析软件四参数质量作用模型进行分析处理，结果见表3。
表1 甘桔汤总皂苷对组织胺致摘除肾上腺小鼠足肿胀的影响
注:与对照组比较， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01，以下同
, 百拇医药
表2 甘桔汤总皂苷对大鼠胸腺及肾上腺重量及肾上腺中维生素C及胆固醇含量的影响
表3 甘桔汤总皂苷对大鼠血清皮质酮含量的影响
2.4 对小鼠炎症组织中组织胺含量的影响 雄性小鼠按体重随机分为5组(分组见表4)，每组动物连续灌胃给药5天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。末次给药后60min后在小鼠左足跖皮下注射1%角叉菜胶0.03ml，4h后沿踝关节上的标记线剪下左足称重后，剪碎浸泡1.5ml生理盐水中，30min后缓缓加入25%(W/V)三氯乙酸0.5ml，充分混匀，4000rpm10min，取上清液1.6ml按文献荧光测定方法 [4] 测定组织胺含量，结果见表4。
表4 甘桔汤总皂苷对小鼠炎症组织中组织胺含量的影响
2.5 对大鼠胸膜炎渗出液中PGE 2 及PLA 2 的影响取健康雄性大鼠38只，按体重随机分为5组(分组见表5)，每组运动连续给药7天，正常组及模型组给予等体积生理盐水，于末次给药30min后，模型组及各给药组动物分别用乙醚轻度麻醉后，向右胸膜腔内注入1%角叉菜胶0.2ml/100g体重，正常对照组注入等体积生理盐水，致炎后4h各组动物灌胃给予相应药物或生理盐水。8h后断头处死，用吸管将胸膜腔内全部渗出液吸出，再以无钙镁Hank液2ml冲洗胸腔，冲洗液与渗出液合并离心，取上清液0.3ml加0.5mol/L KOH-甲醇溶液2ml。在50℃下异构化20min，用甲醇稀释至4ml，于751紫外分光光度计波长278nm处测定其吸光度值代表PGE 2 含量 [5] ，取上清液按酸碱滴定法 [6] 测定PLA 2 活性，以所消耗盐酸量代表酶活性，结果见表5。
, 百拇医药
表5 甘桔汤总皂苷对大鼠胸膜炎渗出液中PGE 2 及PLA 2 的影响
2.6 对大鼠腹腔巨噬细胞IL-1活性的影响 [7] 在无菌条件下取2.5实验大鼠腹腔液(以5ml无菌无钙镁Hank’s液冲洗腹腔，收集冲洗液)，进行巨噬细胞中IL-1活性测定，测定方法如下:无菌条件下取大鼠腹腔液，用Hank’s液洗涤2次，无血清RPMI1640洗涤1次，用5%FCS-RPMI1640调制成4×10 6 /ml细胞悬液，取1ml于康氏管中，37℃，95%O 2 ，5%CO 2 条件下培养72h，反复冻融，4℃保存，取C 57 小鼠，在无菌条件下取胸腺细胞，用5%FCS-RPMI1640调制成2×10 6 /ml细胞悬液，取胸腺细胞悬液和冻融上清各100μl加入96孔平底细胞培养板，每份样品作三复孔，同时作不同稀释度标准品rIL-1和培养液对照，然后加入ConA2ng/孔，平板置37℃95%O 2 、5%CO 2 条件下培养72h，终止培养前14h加入3H-TDR，1μCi/孔，用多细胞收集仪收集细胞，用液体闪烁计数仪测cpm值，按公式计算IL-1活性。结果见表6。
, 百拇医药
表6 甘桔汤总皂苷对大鼠腹腔巨噬细胞IL-1活性的影响
2.7 对大鼠胸膜炎模型渗出液中TNF活性的影响 在无菌条件下取2.5实验大鼠胸腔渗出液按MTT法测定渗出液中TNF活性 [8] ，测定方法如下:取对数生长期TNF杀伤敏感细胞L 929 ，用5%FCS-RPMI1640调制成1×10 6 /ml细胞悬液，在96孔平底细胞培养板中加入L 929 细胞悬液50μl/孔，培养上清液40μl/孔，AMD10μl/孔，置37℃95%O 2 、5%CO 2 条件下培养2h，再加入胸腔渗出液100μl/孔，每份样品作三复孔，同时作不同稀释度标准品rTNF和培养液对照，37℃95%O 2 、5%CO 2 条件下培养24h，终止培养前6h离心，去上清液110μl/孔，加入MTT10μl/孔，培养结束时加入20%SDS、50%DMF溶解液100μl/孔，3h后在酶标仪上测定OD570nm和0D630nm，按公式计算TNF活性。结果见表7。
, 百拇医药
3 讨论
甘桔汤有着悠久的应用历史，自张仲景《伤寒论》以之治疗“少阴咽痛”以来，该方成为治疗咽喉肿痛的祖剂，后世
表7 甘桔汤总皂苷对大鼠腹腔巨噬细胞TNF活性的影响
以此方为基础进行加味化裁的处方不胜枚举。通过我们以前的研究表明，甘桔汤抗炎作用明显。这可能是其成为治疗咽喉肿痛的祖剂的现代药理学基础，但甘桔汤总皂苷抗炎作用是通过哪些环节发挥的作用。通过研究，发现其抗炎作用不依赖于垂体-肾上腺皮质系统，但与甘桔汤总皂苷抑制多种组织源性炎症介质密切相关。如明显抑制炎症组织中的组胺的释放;降低炎症渗出液中PLA 2 及PGE 2 活性或含量;降低致炎性细胞因子IL-1及TNF的活性等，是甘桔汤总皂苷抗炎的重要机制。
参考文献
, http://www.100md.com
1 齐云，沈映君，王文魁，等.甘桔汤总皂苷抗炎作用研究:待发表.
2 徐淑云，卞如谦，陈修.药理实验方法学.第二版.北京:人民卫生出版社，1994，715.
3 徐叔云，卞如濂.药理实验方法学.北京:人民卫生出版社，1982，970.
4 向军俭，陈华粹.组胺的荧光测定法研究.中国医学科学院学报，1981，3(3):183.
5 陈奇.中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版社，1993，303.
6 陈思锋，吴中立.体液和组织磷脂酶A 2 简便快速测定法.第二军医大学学报，1989，10(3):254.
7 杨四旬，李晓玉.一种简便实用的IL-1测定方法.上海免疫学杂志，1989，9(6):363.
8 虞冠华，龙娜.MTT法快速测定TNF活性.细胞生物学杂志，1994，(1):48.
作者单位:100094北京中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所药理室
成都中医药大学
山西农业大学
(收稿日期:2004-03-07)
(编辑秋 实), http://www.100md.com