拉米夫定治疗后乙型肝炎病毒YMDD变异及分析
【摘要】 目的 了解泉州地区慢性乙型肝炎患者在长期拉米夫定治疗中HBV YMDD变异的情况，并探讨其相关影响因素。方法 采用UniArray法对130例服用拉米夫定1年的慢性乙型肝炎感染者进行YMDD变异的检测，并分析性别、年龄、用药前的HBV DNA含量、ALT水平、血清学模式等因素与变异发生的相关性。结果 130例服用拉米夫定1年的慢性乙型肝炎感染者YMDD变异率为13.8%。男性组(13.1%)与女性组(17.4%)的变异率差异无显著性(P>0.05);HBeAg阳性组变异率(15%)与HBeAg阴性组(10%)相比差异无显著性(P>0.05);不同年龄组之间差异无显著性(P>0.05)。YMDD无变异者治疗前ALT水平[(232.50±108.83)U/L]显著高于变异者[(117.72±74.25)U/L](P<0.01);而YMDD变异者治疗前HBV DNA含量(8.7772±0.6114)显著高于无变异者(6.9958±1.9931)(P<0.05)。结论 HBV多聚酶基因YMDD变异可能与患者治疗前ALT水平和HBV DNA含量有一定关系，而与患者的性别、年龄和血清HBeAg状态无关。
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关键词 乙型肝炎病毒 拉米夫定 多聚酶基因 变异
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)07-0963-03
Detection and relation analysis of hepatitis B virus YMDD mutation after lamivudine therapy
Zhang Zhishan，Su Fengshan，Su Zhijun，et al.
Quanzhou First Hospital，Fujian362000.
【Abstract】 Objective To study YMDD mutation rate of chronic hepatitis B patients and related factors. Methods Sera of130patients with chronic hepatitis B treated with lamivudine for one year were detected by UniArray method. The relationships between YMDD mutations and sex，age，the levels of HBV DNA，ALT and serological pattern before therapy were explored. Results YMDD mutation rate of130patients treated with lamivudine for one year was13.8%.The mutation rate of male group was13.1%and that of female was 17.4%，so there was no significant difference between two groups. The rate of YMDD mutation in HBeAg-positive group was15%，which was not significantly different compared to HBeAg-negative group(10%).The differences of rates in different age groups were negligible. Serum ALT levels before therapy of patients without YMDD mutation[232.50±108.83(U/L)]were higher than that of patients with YMDD mutation[117.72±74.25(U/L)](P<0.01).Whereas HBV DNA levels of pretreatment were much higher in YMDD-mutation patients compared to patients without YMDD mutation[(8.7772±0.6114)vs(6.9958±1.9931)，P<0.05].Conclusion HBV polymerase gene YMDD mutation may be related with ALT and HBV DNA levels before treatment， but there were no correlations between mutations and sex，age and HBeAg.
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Key words hepatitis B virus lamivudine polymerase gene mutation
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染遍布全球，全世界有3.5亿的HBV慢性感染者，其中相当一部分的转归不良，可发展为肝硬化和肝癌[1]。因此如何清除HBV慢性感染是全世界共同关注的医学问题。拉米夫定是新一代抗病毒核苷类似物，它能有效的抑制HBV复制，在治疗慢性乙型肝炎中显示出令人鼓舞的疗效。但是长期的拉米夫定治疗易出现耐药性，原因是HBV基因发生了变异，使得对拉米夫定的敏感率大大降低[2]。与拉米夫定耐药相关的因素是多方面的，目前只有疗程与变异的发生呈正相关这一观点普遍为人所接受，而有关其他因素与变异发生相关性的研究不多见，报道也不尽相同。本课题对可能与拉米夫定相关的各种因素(性别、年龄、治疗前的ALT水平、HBV DNA含量、血清学标志)进行分析，旨在找出与拉米夫定耐药密切相关的影响因素，这将对指导合理用药以及如何减少变异的发生提供有效的证据。
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1 资料与方法
1.1 病例选择 选择本院就诊，用拉米夫定(100mg/d)服用1年的慢性乙型肝炎感染者130例。其中HBeAg阳性者100例，HBeAg阴性者30例;男107例，女23例;年龄10～50岁，平均年龄(27.78±9.06)岁;测定治疗前的ALT水平、HBVDNA含量、HBVM。拉米夫定治疗1年后分别测定HBV DNA含量，ALT水平，HBVM。HBV DNA阳性者进行YMDD变异的检测。
1.2 方法
1.2.1 HBV血清标志及核酸定量 HBVM用微粒酶免分析方法检测(Axsym，Abbott，USA)，HBV DNA定量采用达尔安生物工程有限公司的乙型肝炎核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒。ALT检测采用贝克曼CX-9型全自动生化分析仪及贝克曼ALT kit测定。
1.2.2 YMDD变异的检测 采用上海基达基因技术有限公司的UniArray乙型肝炎病毒拉米夫定耐药荧光检测试剂盒。(1)血清HBV DNA的提取:血清样本、质控品Ⅰ、质控品Ⅴ各50μl，分别加入50μl核酸提取液A。振荡混匀15s。12000rpm离心10min，弃上清。加入核酸提取液B50μl，振荡混匀，100℃水浴10min，12000rpm离心2min。取上清供PCR反应用。(2)取PCR缓冲液30μl，反应液7μl(内参照检测孔加入反应液A，YIDD检测孔加反应液B，YVDD检测孔加反应液C)，Taq酶3μl，荧光探针5μl，待检核酸样品5μl，加入0.2ml进口薄壁离心管中，盖紧反应管，低速离心数秒，转移至检测区。按如下程度进行PCR扩增:50℃2min1Cycle;94℃5min1Cycle;94℃20s，62℃40s，40Cycle。(3)结果判定:以YIDD或YVDD引物孔的Ct值与内参照引物Ct值(基准值)之差的△Ct大小作为突变是否发生的依据。△Ct≤3(包括<0)判定为突变型，△Ct>3判定为野生型。
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1.2.3 统计学方法 采用SPSS统计软件进行统计学分析。HBeAg阳性和HBeAg阴性感染者YMDD变异率差异，性别、不同年龄组YMDD变异率的差异采用χ2检验进行处理;YMDD变异者和无变异者治疗前的ALT水平、HBV DNA含量的差异分别采用t检验进行统计学分析。
2 结果
2.1 YMDD变异率及变异类型 130例服用拉米夫定1年的慢性HBV感染者中，检出YMDD变异18例，变异率为13.8%(18/130)。其中11例为YVDD型，4例为YIDD型，3例为YIDD/YVDD型。
2.2 YMDD变异的相关分析
2.2.1 YMDD变异与患者性别的关系 见表1。
表1 YMDD变异与患者性别的关系 例(略) 注:χ 2=0.044，P=0.834
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2.2.2 YMDD变异与患者年龄的关系 见表2。表2 YMDD变异与患者年龄的关系 例(略)注:χ 2 =0.155，P=0.427
2.2.3 YMDD变异与患者HBeAg状态的关系 见表3。
2.2.4 YMDD变异与患者治疗前ALT水平的关系 见表4。
2.2.5 YMDD变异与患者治疗前HBV DNA水平的关系 见表5。
由于HBV DNA含量的分布呈正偏态分布，先将其转换成对数使其呈正态分布再进行t检验。
表3 YMDD变异与患者HBeAg状态的关系 例(略) 注:χ 2=0.155，P=0.694
表4 YMDD变异与患者治疗前ALT水平的关系 (x±s)(略)注:t=3.443，P=0.002
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表5 YMDD变异与患者治疗前HBV DNA水平的关系 (lgx±s)(略)注:t=-3.003，P=0.011
3 讨论
拉米夫定是核苷类抗病毒药物，临床试验表明，拉米夫定(100mg/d)可有效地抑制HBV DNA的复制，同时伴有ALT正常，改善肝组织病变[3]。本次研究发现，慢性乙型肝炎感染者服用拉米夫定1年后，HBV DNA转阴率可达76.9%(100/130)，HBeAg血清学转换率为24%(24/100)。这些数字表明拉米夫定在治疗慢性乙型肝炎感染中显示出良好的疗效。但是长期的治疗中，部分患者多聚酶基因发生变异，导致HBV对拉米夫定耐药。据国内外研究报道，拉米夫定治疗1年后YMDD变异的发生率大约为15%[3]，用药2年变异发生率大约为38%[4]，用药4年的变异率大约为67%[5]。表明疗程与变异的发生呈正相关。拉米夫定耐药常于治疗6～9个月后出现[6]，且发生率随疗程的延长而增加。本研究结果显示，泉州地区拉米夫定治疗1年的慢性乙型肝炎患者YMDD的变异率为13.8%，且以YVDD变异为主要类型。本地区的YMDD变异率与文献报道相似。
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本研究中，YMDD变异者治疗前的HBV DNA水平明显高于YMDD无变异者，表明用药前血清HBV DNA水平与变异的发生呈正相关。这与Santantonio[7]等的报道一致。张欣欣[8]等认为YMDD变异者治疗前的ALT水平高于无变异者，但本次研究却显示出截然相反的结果，即YMDD无变异者治疗前的ALT水平明显高于变异者，也就是治疗前的ALT水平与变异的发生呈现出负的相关性。由于慢性乙型肝炎患者ALT水平升高属于T细胞介导的肝细胞溶解反应[9]，故ALT水平也就反应了T细胞对HBV的免疫反应情况，对于那些HBV已开始产生免疫反应的患者，用抗病毒药拉米夫定治疗的效果较好。这可能是治疗前ALT水平较高的患者不容易产生变异的原因。其机制有待进一步研究。
Da Silva[10]等提出HBeAg阳性较HBeAg阴性患者YMDD变异率高，但Lok[11]认为HBeAg阳性和HBeAg阴性感染者YMDD变异率是一样的。本文结果支持了后者的观点。本次结果还显示，不同性别、不同年龄组之间YMDD变异的发生率是一样的。
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综上所述，在诸多因素中，治疗前的ALT水平，HBV DNA含量与YMDD变异的发生最有相关性，治疗前的HBV DNA含量与变异的发生呈正相关，而治疗前的ALT水平则与变异的发生呈负相关。性别、年龄、血清学模式(大三阳或小三阳)与变异的发生无相关性。这将有助于用药时机的选择及指导合理用药。YMDD变异者治疗前后的ALT水平无显著变化，但是HBV DNA则明显降低，这为发生变异的慢性乙型肝炎患者继续使用拉米夫定治疗提供证据。
参考文献
1 Galan MV，Boyce D，Gordon SC.Current pharmacotherapy for hepatitis B infection. Expert Opin Pharmacother，2001，2(8):1289-1298.
2 Honkoop P，Niesters H，De Man R，et al.Lamivudine resistance in immunocompetent chronic hepatitis B incidence and patterns.J Hepatol，1997，26:1393.
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3 Lai CL，Chien RN，Leung NW，et al.A one-year trial of lamivudine for chronic hepatitis B.N Eng1J Med，1998，339:61-68.
4 Liaw YF，Leung NW，Chang TT，et al.Effects of extented lamivudine therepy in impact of YMDD mutations during lamivudine therapy in paˉtients with chronid hepatitis B.Antivir Chemother，2001，12(1):67-71.
5 Liaw YF，Chien RN，Yeh CT，et al.Acute exacerbation and hepatitis B virus clearance after emergence of YMDD mutation during lamivudine therapy.Hepatology，1999，30:567-572.
, 百拇医药
6 钱健帮，孙南雄，杜绍才，等.使用/未用拉米夫定HBV慢性感染者中YMDD基序变异的检测.江苏医药杂志，2002，28(6):408-410.
7 Santantonio T，Volpes R，Pastore G，et al.Efficacy of lamivudine in patients Beantigen-negative/hepatitis B virus DNA-positive(precore mutant)chronic hepatitis B.Precore Mutant Study Group.Hepatology，1999，29:889-896.
8 张欣欣，韩永年，陆志檬，等.乙型肝炎病毒多聚酶变异与拉米夫定治疗反应.中华传染病杂志，2001，19(1):15-17.
9 LiawYF，Tasi S L.Pathogenesis and clinal significance of actue exacerbations and remissions in patients with chronic hepatitis B virus infection.Viral Hep Rev，1997，3:143.
, http://www.100md.com
10 Da Sliva LC，Da Fonseca LE，Carrilho FJ，et al.Predictive factors for response to lamivudine in chronic hepatitis B.Rev Inst Med Trop Sao Paulo，2000，42:189-196.
11 Lok AS，Hussian M，Cursano C，et al.Evoluation of hepatitis B virus polymerase gene mutations in hepatitis B e antigen-negative patients receving lamivudine therapy.Hepatology，2000，32(5):1145-1153.
作者单位:362000福建省泉州市第一医院
(收稿日期:2003-09-30) (编辑:海涛), 百拇医药
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关键词 乙型肝炎病毒 拉米夫定 多聚酶基因 变异
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)07-0963-03
Detection and relation analysis of hepatitis B virus YMDD mutation after lamivudine therapy
Zhang Zhishan，Su Fengshan，Su Zhijun，et al.
Quanzhou First Hospital，Fujian362000.
【Abstract】 Objective To study YMDD mutation rate of chronic hepatitis B patients and related factors. Methods Sera of130patients with chronic hepatitis B treated with lamivudine for one year were detected by UniArray method. The relationships between YMDD mutations and sex，age，the levels of HBV DNA，ALT and serological pattern before therapy were explored. Results YMDD mutation rate of130patients treated with lamivudine for one year was13.8%.The mutation rate of male group was13.1%and that of female was 17.4%，so there was no significant difference between two groups. The rate of YMDD mutation in HBeAg-positive group was15%，which was not significantly different compared to HBeAg-negative group(10%).The differences of rates in different age groups were negligible. Serum ALT levels before therapy of patients without YMDD mutation[232.50±108.83(U/L)]were higher than that of patients with YMDD mutation[117.72±74.25(U/L)](P<0.01).Whereas HBV DNA levels of pretreatment were much higher in YMDD-mutation patients compared to patients without YMDD mutation[(8.7772±0.6114)vs(6.9958±1.9931)，P<0.05].Conclusion HBV polymerase gene YMDD mutation may be related with ALT and HBV DNA levels before treatment， but there were no correlations between mutations and sex，age and HBeAg.
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Key words hepatitis B virus lamivudine polymerase gene mutation
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染遍布全球，全世界有3.5亿的HBV慢性感染者，其中相当一部分的转归不良，可发展为肝硬化和肝癌[1]。因此如何清除HBV慢性感染是全世界共同关注的医学问题。拉米夫定是新一代抗病毒核苷类似物，它能有效的抑制HBV复制，在治疗慢性乙型肝炎中显示出令人鼓舞的疗效。但是长期的拉米夫定治疗易出现耐药性，原因是HBV基因发生了变异，使得对拉米夫定的敏感率大大降低[2]。与拉米夫定耐药相关的因素是多方面的，目前只有疗程与变异的发生呈正相关这一观点普遍为人所接受，而有关其他因素与变异发生相关性的研究不多见，报道也不尽相同。本课题对可能与拉米夫定相关的各种因素(性别、年龄、治疗前的ALT水平、HBV DNA含量、血清学标志)进行分析，旨在找出与拉米夫定耐药密切相关的影响因素，这将对指导合理用药以及如何减少变异的发生提供有效的证据。
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1 资料与方法
1.1 病例选择 选择本院就诊，用拉米夫定(100mg/d)服用1年的慢性乙型肝炎感染者130例。其中HBeAg阳性者100例，HBeAg阴性者30例;男107例，女23例;年龄10～50岁，平均年龄(27.78±9.06)岁;测定治疗前的ALT水平、HBVDNA含量、HBVM。拉米夫定治疗1年后分别测定HBV DNA含量，ALT水平，HBVM。HBV DNA阳性者进行YMDD变异的检测。
1.2 方法
1.2.1 HBV血清标志及核酸定量 HBVM用微粒酶免分析方法检测(Axsym，Abbott，USA)，HBV DNA定量采用达尔安生物工程有限公司的乙型肝炎核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒。ALT检测采用贝克曼CX-9型全自动生化分析仪及贝克曼ALT kit测定。
1.2.2 YMDD变异的检测 采用上海基达基因技术有限公司的UniArray乙型肝炎病毒拉米夫定耐药荧光检测试剂盒。(1)血清HBV DNA的提取:血清样本、质控品Ⅰ、质控品Ⅴ各50μl，分别加入50μl核酸提取液A。振荡混匀15s。12000rpm离心10min，弃上清。加入核酸提取液B50μl，振荡混匀，100℃水浴10min，12000rpm离心2min。取上清供PCR反应用。(2)取PCR缓冲液30μl，反应液7μl(内参照检测孔加入反应液A，YIDD检测孔加反应液B，YVDD检测孔加反应液C)，Taq酶3μl，荧光探针5μl，待检核酸样品5μl，加入0.2ml进口薄壁离心管中，盖紧反应管，低速离心数秒，转移至检测区。按如下程度进行PCR扩增:50℃2min1Cycle;94℃5min1Cycle;94℃20s，62℃40s，40Cycle。(3)结果判定:以YIDD或YVDD引物孔的Ct值与内参照引物Ct值(基准值)之差的△Ct大小作为突变是否发生的依据。△Ct≤3(包括<0)判定为突变型，△Ct>3判定为野生型。
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1.2.3 统计学方法 采用SPSS统计软件进行统计学分析。HBeAg阳性和HBeAg阴性感染者YMDD变异率差异，性别、不同年龄组YMDD变异率的差异采用χ2检验进行处理;YMDD变异者和无变异者治疗前的ALT水平、HBV DNA含量的差异分别采用t检验进行统计学分析。
2 结果
2.1 YMDD变异率及变异类型 130例服用拉米夫定1年的慢性HBV感染者中，检出YMDD变异18例，变异率为13.8%(18/130)。其中11例为YVDD型，4例为YIDD型，3例为YIDD/YVDD型。
2.2 YMDD变异的相关分析
2.2.1 YMDD变异与患者性别的关系 见表1。
表1 YMDD变异与患者性别的关系 例(略) 注:χ 2=0.044，P=0.834
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2.2.2 YMDD变异与患者年龄的关系 见表2。表2 YMDD变异与患者年龄的关系 例(略)注:χ 2 =0.155，P=0.427
2.2.3 YMDD变异与患者HBeAg状态的关系 见表3。
2.2.4 YMDD变异与患者治疗前ALT水平的关系 见表4。
2.2.5 YMDD变异与患者治疗前HBV DNA水平的关系 见表5。
由于HBV DNA含量的分布呈正偏态分布，先将其转换成对数使其呈正态分布再进行t检验。
表3 YMDD变异与患者HBeAg状态的关系 例(略) 注:χ 2=0.155，P=0.694
表4 YMDD变异与患者治疗前ALT水平的关系 (x±s)(略)注:t=3.443，P=0.002
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表5 YMDD变异与患者治疗前HBV DNA水平的关系 (lgx±s)(略)注:t=-3.003，P=0.011
3 讨论
拉米夫定是核苷类抗病毒药物，临床试验表明，拉米夫定(100mg/d)可有效地抑制HBV DNA的复制，同时伴有ALT正常，改善肝组织病变[3]。本次研究发现，慢性乙型肝炎感染者服用拉米夫定1年后，HBV DNA转阴率可达76.9%(100/130)，HBeAg血清学转换率为24%(24/100)。这些数字表明拉米夫定在治疗慢性乙型肝炎感染中显示出良好的疗效。但是长期的治疗中，部分患者多聚酶基因发生变异，导致HBV对拉米夫定耐药。据国内外研究报道，拉米夫定治疗1年后YMDD变异的发生率大约为15%[3]，用药2年变异发生率大约为38%[4]，用药4年的变异率大约为67%[5]。表明疗程与变异的发生呈正相关。拉米夫定耐药常于治疗6～9个月后出现[6]，且发生率随疗程的延长而增加。本研究结果显示，泉州地区拉米夫定治疗1年的慢性乙型肝炎患者YMDD的变异率为13.8%，且以YVDD变异为主要类型。本地区的YMDD变异率与文献报道相似。
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本研究中，YMDD变异者治疗前的HBV DNA水平明显高于YMDD无变异者，表明用药前血清HBV DNA水平与变异的发生呈正相关。这与Santantonio[7]等的报道一致。张欣欣[8]等认为YMDD变异者治疗前的ALT水平高于无变异者，但本次研究却显示出截然相反的结果，即YMDD无变异者治疗前的ALT水平明显高于变异者，也就是治疗前的ALT水平与变异的发生呈现出负的相关性。由于慢性乙型肝炎患者ALT水平升高属于T细胞介导的肝细胞溶解反应[9]，故ALT水平也就反应了T细胞对HBV的免疫反应情况，对于那些HBV已开始产生免疫反应的患者，用抗病毒药拉米夫定治疗的效果较好。这可能是治疗前ALT水平较高的患者不容易产生变异的原因。其机制有待进一步研究。
Da Silva[10]等提出HBeAg阳性较HBeAg阴性患者YMDD变异率高，但Lok[11]认为HBeAg阳性和HBeAg阴性感染者YMDD变异率是一样的。本文结果支持了后者的观点。本次结果还显示，不同性别、不同年龄组之间YMDD变异的发生率是一样的。
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综上所述，在诸多因素中，治疗前的ALT水平，HBV DNA含量与YMDD变异的发生最有相关性，治疗前的HBV DNA含量与变异的发生呈正相关，而治疗前的ALT水平则与变异的发生呈负相关。性别、年龄、血清学模式(大三阳或小三阳)与变异的发生无相关性。这将有助于用药时机的选择及指导合理用药。YMDD变异者治疗前后的ALT水平无显著变化，但是HBV DNA则明显降低，这为发生变异的慢性乙型肝炎患者继续使用拉米夫定治疗提供证据。
参考文献
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5 Liaw YF，Chien RN，Yeh CT，et al.Acute exacerbation and hepatitis B virus clearance after emergence of YMDD mutation during lamivudine therapy.Hepatology，1999，30:567-572.
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6 钱健帮，孙南雄，杜绍才，等.使用/未用拉米夫定HBV慢性感染者中YMDD基序变异的检测.江苏医药杂志，2002，28(6):408-410.
7 Santantonio T，Volpes R，Pastore G，et al.Efficacy of lamivudine in patients Beantigen-negative/hepatitis B virus DNA-positive(precore mutant)chronic hepatitis B.Precore Mutant Study Group.Hepatology，1999，29:889-896.
8 张欣欣，韩永年，陆志檬，等.乙型肝炎病毒多聚酶变异与拉米夫定治疗反应.中华传染病杂志，2001，19(1):15-17.
9 LiawYF，Tasi S L.Pathogenesis and clinal significance of actue exacerbations and remissions in patients with chronic hepatitis B virus infection.Viral Hep Rev，1997，3:143.
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作者单位:362000福建省泉州市第一医院
(收稿日期:2003-09-30) (编辑:海涛), 百拇医药