降纤酶对缺血再灌注脑组织内肿瘤坏死因子-α表达的影响
【摘要】 目的 观察降纤酶对大鼠缺血再灌注损伤脑组织内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。方法 将60只大鼠随机分为A、B两组，制作脑缺血再灌注动物模型。A组给予降纤酶，B组给予生理盐水。然后应用ELISA方法，测定不同时间点时两组大鼠脑梗死灶内显(P>0.05)。缺血3h再灌注3h，6h，24h，72h时，两组大鼠缺血侧脑组织内的TNF-α均呈高水平表达，但A组鼠脑组织内的TNF-α表达低于B组的，差异具有显著性(P<0.05)。结论降纤酶不影响正常脑组织内低水平的TNF-α的表达，但能抑制缺血再灌注损伤脑组织内高水平的TNF-α的表达，对脑组织具有一定的保护作用。
关键词 降纤酶 缺血再灌注损伤 TNF-α表达 影响
【文献标识码】 【文章编号】 1680-077X(2004)06-0494-03
The influence of fibrinolytic agent on the expression of tumor
, 百拇医药
neucrosis factor-αin the cerebral tissue of ischemic-reperfusion
Li Huimian，Bai Rong，Liu Yumei，et al.
Cadre Ward，The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou450003.
【Abstract】 Objective To observe the influence of fibrinolytic agent on the expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α)in rats cerebral tissue of undergoing ischemia-reperfusion.Methods We randomly devided the60rats into A groupand B group，made the models of cerebral ischemia-reperfusion，administered fibrinolytic agent to A group of rats and normal saline liquid to B group of rats，then，at various time points，measured the quantities of TNF-αin cerebral tissue of the two groups of rats by using ELISA method.Results Before cerebral ischemia，the expresˉsion of TNF-αin cerebral tissue of the two groups of rats was low level，the difference had no significance when comˉparing between A group and B group(P>0.05).At reperfusion for3h，6h，24h and72h fallowing ischemia for3h，the expression of TNF-αin the brain tissue of the two groups of rats was high level，but the expression of TNF-αin A group was dropped when comparing with that of B group(P<0.05).Conclusion The fibrinolytic agent does not inˉfluence the low-level expression of TNF-αin normal brain tissue，but can significantly restrain the high-level exˉpression of TNF-1in cerebral tissue of ischemia-reperfusion injury，it has protective effect on the brain tissue.
, 百拇医药
Key words fibrinolytic agent ischemia-reperfusion injury tumor necrosis factor-α expression influˉence
临床上降纤酶是治疗缺血性脑血管病常用的药物，它能够溶解血栓，使血管再通，改善脑血流，缩小脑梗死灶体积，保护神经细胞。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一种炎性介质，其被认为与急性脑血管病的发生、发展及预后密切相关。但在脑缺血再灌注损伤中，降纤酶与TNF-α之间有何关系，尚未见报道。为此，我们进行动物实验，观察降纤酶对脑梗死组织内TNF-α表达的影响，进而探讨降纤酶对神经组织的保护作用。
1 资料与方法
1.1 实验动物及分组 60只成年雄性SD大鼠，体重250～300g，由河南省实验动物中心提供。随机分为两大组:A组与B组。每大组再按不同时间点分为不栓塞无缺血(即缺血前)、缺血3h再灌注3h、6h、24h、72h时5个小组，每小组6只动物。
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1.2 动物模型制作及给药方式 采用改良的Longa [1] 线栓塞法制备脑缺血再灌注动物模型。在拔除栓塞线即刻经腹腔给药。无缺血鼠仅分离颈内、外动脉，不栓塞，分离完颈内、外动脉后即刻给药。A组给予降纤酶8U/kg(降纤酶由长春海王制药厂生产)。给药前先将降纤酶5U溶解于3ml生理盐水中，B组给予等体积的生理盐水。
1.3 标本制备与TNF-α测定 在各设定时间点将大鼠断头取脑，取1cm 3 缺血侧纹状区脑组织置于5倍体积Buffer悬浮液中，制成匀浆，于4℃，5000r/min，离心10min，取上清液保存于-70℃冰箱。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)，使用TNF-α检测试剂盒(深圳晶美公司提供)，721分光光度计OD值(波长450nm)。
1.4 统计学方法 全部资料采用SPSS软件分析系统，进行统计学处理，对研究资料进行t检验或方差分析。
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2 结果
2.1 各组鼠脑组织TNF-α检测结果 见表1。表1显示:①脑缺血前(无栓塞时)，A、B两组鼠脑内仅有低水平的TNF-α表达，两组相比，差异无显著性(P>0.05)。②脑缺血再灌注后(栓塞后)，在各时间点A、B两组鼠病变的脑组织内TNF-α的表达均明显增高，与缺血前(无栓塞)鼠的相比，差异有显著性(P<0.05)。③但A组鼠脑组织内的TNF-α水平的增高低于B组鼠的。两组相比，在缺血3h再灌注3h时，差异无显著性(P>0.05)。在再灌注6h、24h、72h 时，差异有显著性(P<0.05)。
表1 不同时间点各组鼠脑匀浆中TNF-α水平
3 讨论
缺血性脑血管病的本质 [2] 是脑血管受阻使局部脑组织血流下降或终止，导致神经细胞功能障碍或(及)形态破坏。因此，使阻塞的血管再通及时恢复脑血液循环，即缺血脑组织再灌注，尽量减少缺血所致的神经细胞病变程度及范围是治疗的关键。降纤酶能溶解血栓，是临床应用较多的使血管再通的药物。但实验研究及临床均发现缺血脑组织恢复血流后，在某一段时间内反而引起原有病变的加重，即再灌注损伤 [2] ，其机制尚未完全阐明。目前许多研究报道认为炎症反应机制尤以细胞因子的参与和中性粒细胞的聚集在再灌注损伤中起重要作用。
, 百拇医药
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种细胞因子，具有广泛的生物学功能，是神经免疫系统的共同介质，参与机体免疫应答和炎症反应，近年来它在脑缺血再灌注损伤中的作用引起越来越多的关注。TNF-α主要由巨噬细胞分泌，正常情况下中枢神经系统(CNS)只有神经元产生低水平的TNF-α，外周巨噬细胞分泌的TNF-α不能通过血脑屏障(BBB)进入中枢神经系统(CNS)。但在缺血、外伤、炎症等CNS疾病过程中，由于BBB受伤，TNF-α可进入CNS。而且，此时病变的脑组织局部的胶质细胞、神经元或浸润的淋巴细胞受到病理性刺激也可产生TNF-α [3] ，使脑细胞TNF-α的表达显著增加。TNF-α具有神经毒性作用 [4] ，其表达增加可加速神经细胞死亡 [5] 。Buttini [6] 、Uno [7] 及张莉莉等 [8] 所做的缺血再灌注损伤的动物实验显示:于再灌注2h，大鼠脑内TNF-α表达已有明显升高，24h达高峰，其后逐渐减少，至再灌注72h已基本恢复到基础水平。而Liu [9] 的实验显示大脑中动脉闭塞后1h，缺血皮层中TNF-αmRNA开始表达，3h后上升，12h达高峰，闭塞5天后其表达仍明显增高。王涛等 [10] 报道，全脑缺血10min再灌注1天后，脑组织内TNF-α含量明显升高，再灌注1天后达峰值，并持续至再灌注5天仍处于较高水平。从Liu与王涛两人的实验结果看，在脑缺血后TNF-αmRNA的表达与TNF-α的升高是一致的。1998年Yang等 [11] 实验发现，拮抗TNF-α可减少脑缺血再灌注损伤，并降低细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达。
, 百拇医药
1999年刘清和等 [12] 在大鼠局灶性脑缺血6h再灌注后，立即给股动脉注射抗TNF-α单克隆抗体，发现白细胞聚集、粘附减少，脑梗死体积缩小。以上的研究提示:降低TNF-α表达，能减少神经组织损伤，对缺血再灌注脑组织具有保护作用。我们的实验结果显示:(1)两组大鼠不栓塞(缺血前)正常的脑组织内有低水平的TNF-α表达，A组与B组相比， 差异不明显，P>0.05。说明降纤酶不影响正常脑组织内低水平的TNF-α表达。(2)在缺血3h再灌注3h、6h，24h，72h时，两组鼠脑组织内TNF-α均呈高水平表达，与缺血前相比，差异有显著性(P<0.05)。此点与Liu和王涛的实验结果相近。提示TNF-α与脑缺血再灌注损伤有关，可能参与了损伤和(或)修复全过程。(3)在缺血再灌注3h，6h，24h，72h时间点，A组鼠脑组织内TNF-α表达较B组明显下降，差异有显著性(P<0.05)。由此说明，降纤酶可显著降低缺血再灌注脑内TNF-α表达，其机制尚不清楚。推测这种作用可能与降纤酶能增加纤溶酶原激动剂的释放，从而降低血液中纤维蛋白原水平，促进t-PA释放，降低血粘度，降低血管阻力，使脑血流增加，改善脑的缺血，减轻神经细胞损害，因而神经细胞分泌TNF-α的量减少有关。因此，我们认为国产降纤酶对脑组织的保护作用可能是从多个环节实现的，其中降低缺血再灌注损伤脑组织内高水平的TNF-α表达，可能是降纤酶实现脑保护作用的一个环节。
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但是在缺血再灌注后，应用降纤酶使脑内TNF-α表达降低是其直接作用的结果还是间接作用的结果，尚不清楚。近年研究认为，TNF-α在缺血再灌注损伤中还具有正面作用，它具有神经保护和促进损伤修复的作用。因此，TNF-α表达增加或降低的确切意义是什么，降纤酶为什么对正常脑组织内低水平的TNF-α表达没有影响，但可降低缺血再灌注损伤的脑组织内的TNF-α表达，这些问题有待今后进一步研究讨论。
参考文献
1 Zea-longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cereˉbralartery occlusion without cranietomy in rats.Stroke，1989，20:84-91.
2 蒲能强，吴卫国，郎森阳.脑血管病学，北京:人民军医出版社，1999，260-286.
, 百拇医药
3 Connor TJ，Song C，Leonard BE，et al.An assessment of the effects of central interlenkin-1beta，-2，-6，and tumor necrosis factor-alpha administration on some hehavioural，neurochemical，endocrine and imˉmune parameters in the rat.Neuroscience，1998，84(3):923-933.
4 DownewM，Amaral TD，Hua LL，et al.Neuronal death in cytobine-acˉtivated primary human brain cell culture:role of tumor necrosis factor-alpha.Glia，1999，28(2):114-127.
, 百拇医药
5 Suzumura A，Ito A，Yoshikowa M，et al.Ibudilast suppresses TNT-alˉpha production by glial cells functioning mainly as typeⅢphosphodiˉesterast inhibitorin the CNS.Brain Res，1999，837(1-2):203-212.
6 Buttini M，Appel K，Sauter A，et al.Expression of Tumor necrosis factor-alpha after focal cerebral ischemia inthe rat.Neuroscience，1996，71:1-16.
7 Uno H，Matsuvama T，Akita H，et al.Induction of tumor necrosis factor-alpha in the mouse hippocampus following transient forebrain ischemiˉa.J Cereb Blood FlowMetab，1997，17(5):491-499.
, 百拇医药
8 张莉莉，王景周，周华东，等.肿瘤坏死因子-α在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用机制.中华老年医学杂志，2003，22(2):102-104.
9 Liu T，Clar K，Mcdonnel PC，et al.Tumor necrosis factor-αexpressionin ischemic neurons.Stroke，1994，25:1481-1488.
10 王涛，文亮，李大江.全脑缺血再灌注损伤后炎性细胞因子的变化及意义.中国危重急救医学，2000，12(5):290-292.
11 Yang GY，Gong C，Qin Z，et al.Inhibition ofTNF-αattenuates infarct volume and ICAM-1expression in ischimic mouse brain.Neuroreˉport，1998，9(9):2131-2134.
12 刘清和，曾庆杏，余绍祖，等.抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体对缺血再灌注大鼠脑损伤影响的实验研究.中风与神经疾病杂志，1999，16(4):208-210.
作者单位:450003郑州大学第二附属医院干部病房
450052郑州铁路局中心医院神经内科
(收稿日期:2004-02-03)
(编辑罗 彬), http://www.100md.com
关键词 降纤酶 缺血再灌注损伤 TNF-α表达 影响
【文献标识码】 【文章编号】 1680-077X(2004)06-0494-03
The influence of fibrinolytic agent on the expression of tumor
, 百拇医药
neucrosis factor-αin the cerebral tissue of ischemic-reperfusion
Li Huimian，Bai Rong，Liu Yumei，et al.
Cadre Ward，The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou450003.
【Abstract】 Objective To observe the influence of fibrinolytic agent on the expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α)in rats cerebral tissue of undergoing ischemia-reperfusion.Methods We randomly devided the60rats into A groupand B group，made the models of cerebral ischemia-reperfusion，administered fibrinolytic agent to A group of rats and normal saline liquid to B group of rats，then，at various time points，measured the quantities of TNF-αin cerebral tissue of the two groups of rats by using ELISA method.Results Before cerebral ischemia，the expresˉsion of TNF-αin cerebral tissue of the two groups of rats was low level，the difference had no significance when comˉparing between A group and B group(P>0.05).At reperfusion for3h，6h，24h and72h fallowing ischemia for3h，the expression of TNF-αin the brain tissue of the two groups of rats was high level，but the expression of TNF-αin A group was dropped when comparing with that of B group(P<0.05).Conclusion The fibrinolytic agent does not inˉfluence the low-level expression of TNF-αin normal brain tissue，but can significantly restrain the high-level exˉpression of TNF-1in cerebral tissue of ischemia-reperfusion injury，it has protective effect on the brain tissue.
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Key words fibrinolytic agent ischemia-reperfusion injury tumor necrosis factor-α expression influˉence
临床上降纤酶是治疗缺血性脑血管病常用的药物，它能够溶解血栓，使血管再通，改善脑血流，缩小脑梗死灶体积，保护神经细胞。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一种炎性介质，其被认为与急性脑血管病的发生、发展及预后密切相关。但在脑缺血再灌注损伤中，降纤酶与TNF-α之间有何关系，尚未见报道。为此，我们进行动物实验，观察降纤酶对脑梗死组织内TNF-α表达的影响，进而探讨降纤酶对神经组织的保护作用。
1 资料与方法
1.1 实验动物及分组 60只成年雄性SD大鼠，体重250～300g，由河南省实验动物中心提供。随机分为两大组:A组与B组。每大组再按不同时间点分为不栓塞无缺血(即缺血前)、缺血3h再灌注3h、6h、24h、72h时5个小组，每小组6只动物。
, http://www.100md.com
1.2 动物模型制作及给药方式 采用改良的Longa [1] 线栓塞法制备脑缺血再灌注动物模型。在拔除栓塞线即刻经腹腔给药。无缺血鼠仅分离颈内、外动脉，不栓塞，分离完颈内、外动脉后即刻给药。A组给予降纤酶8U/kg(降纤酶由长春海王制药厂生产)。给药前先将降纤酶5U溶解于3ml生理盐水中，B组给予等体积的生理盐水。
1.3 标本制备与TNF-α测定 在各设定时间点将大鼠断头取脑，取1cm 3 缺血侧纹状区脑组织置于5倍体积Buffer悬浮液中，制成匀浆，于4℃，5000r/min，离心10min，取上清液保存于-70℃冰箱。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)，使用TNF-α检测试剂盒(深圳晶美公司提供)，721分光光度计OD值(波长450nm)。
1.4 统计学方法 全部资料采用SPSS软件分析系统，进行统计学处理，对研究资料进行t检验或方差分析。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 各组鼠脑组织TNF-α检测结果 见表1。表1显示:①脑缺血前(无栓塞时)，A、B两组鼠脑内仅有低水平的TNF-α表达，两组相比，差异无显著性(P>0.05)。②脑缺血再灌注后(栓塞后)，在各时间点A、B两组鼠病变的脑组织内TNF-α的表达均明显增高，与缺血前(无栓塞)鼠的相比，差异有显著性(P<0.05)。③但A组鼠脑组织内的TNF-α水平的增高低于B组鼠的。两组相比，在缺血3h再灌注3h时，差异无显著性(P>0.05)。在再灌注6h、24h、72h 时，差异有显著性(P<0.05)。
表1 不同时间点各组鼠脑匀浆中TNF-α水平
3 讨论
缺血性脑血管病的本质 [2] 是脑血管受阻使局部脑组织血流下降或终止，导致神经细胞功能障碍或(及)形态破坏。因此，使阻塞的血管再通及时恢复脑血液循环，即缺血脑组织再灌注，尽量减少缺血所致的神经细胞病变程度及范围是治疗的关键。降纤酶能溶解血栓，是临床应用较多的使血管再通的药物。但实验研究及临床均发现缺血脑组织恢复血流后，在某一段时间内反而引起原有病变的加重，即再灌注损伤 [2] ，其机制尚未完全阐明。目前许多研究报道认为炎症反应机制尤以细胞因子的参与和中性粒细胞的聚集在再灌注损伤中起重要作用。
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肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种细胞因子，具有广泛的生物学功能，是神经免疫系统的共同介质，参与机体免疫应答和炎症反应，近年来它在脑缺血再灌注损伤中的作用引起越来越多的关注。TNF-α主要由巨噬细胞分泌，正常情况下中枢神经系统(CNS)只有神经元产生低水平的TNF-α，外周巨噬细胞分泌的TNF-α不能通过血脑屏障(BBB)进入中枢神经系统(CNS)。但在缺血、外伤、炎症等CNS疾病过程中，由于BBB受伤，TNF-α可进入CNS。而且，此时病变的脑组织局部的胶质细胞、神经元或浸润的淋巴细胞受到病理性刺激也可产生TNF-α [3] ，使脑细胞TNF-α的表达显著增加。TNF-α具有神经毒性作用 [4] ，其表达增加可加速神经细胞死亡 [5] 。Buttini [6] 、Uno [7] 及张莉莉等 [8] 所做的缺血再灌注损伤的动物实验显示:于再灌注2h，大鼠脑内TNF-α表达已有明显升高，24h达高峰，其后逐渐减少，至再灌注72h已基本恢复到基础水平。而Liu [9] 的实验显示大脑中动脉闭塞后1h，缺血皮层中TNF-αmRNA开始表达，3h后上升，12h达高峰，闭塞5天后其表达仍明显增高。王涛等 [10] 报道，全脑缺血10min再灌注1天后，脑组织内TNF-α含量明显升高，再灌注1天后达峰值，并持续至再灌注5天仍处于较高水平。从Liu与王涛两人的实验结果看，在脑缺血后TNF-αmRNA的表达与TNF-α的升高是一致的。1998年Yang等 [11] 实验发现，拮抗TNF-α可减少脑缺血再灌注损伤，并降低细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达。
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1999年刘清和等 [12] 在大鼠局灶性脑缺血6h再灌注后，立即给股动脉注射抗TNF-α单克隆抗体，发现白细胞聚集、粘附减少，脑梗死体积缩小。以上的研究提示:降低TNF-α表达，能减少神经组织损伤，对缺血再灌注脑组织具有保护作用。我们的实验结果显示:(1)两组大鼠不栓塞(缺血前)正常的脑组织内有低水平的TNF-α表达，A组与B组相比， 差异不明显，P>0.05。说明降纤酶不影响正常脑组织内低水平的TNF-α表达。(2)在缺血3h再灌注3h、6h，24h，72h时，两组鼠脑组织内TNF-α均呈高水平表达，与缺血前相比，差异有显著性(P<0.05)。此点与Liu和王涛的实验结果相近。提示TNF-α与脑缺血再灌注损伤有关，可能参与了损伤和(或)修复全过程。(3)在缺血再灌注3h，6h，24h，72h时间点，A组鼠脑组织内TNF-α表达较B组明显下降，差异有显著性(P<0.05)。由此说明，降纤酶可显著降低缺血再灌注脑内TNF-α表达，其机制尚不清楚。推测这种作用可能与降纤酶能增加纤溶酶原激动剂的释放，从而降低血液中纤维蛋白原水平，促进t-PA释放，降低血粘度，降低血管阻力，使脑血流增加，改善脑的缺血，减轻神经细胞损害，因而神经细胞分泌TNF-α的量减少有关。因此，我们认为国产降纤酶对脑组织的保护作用可能是从多个环节实现的，其中降低缺血再灌注损伤脑组织内高水平的TNF-α表达，可能是降纤酶实现脑保护作用的一个环节。
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但是在缺血再灌注后，应用降纤酶使脑内TNF-α表达降低是其直接作用的结果还是间接作用的结果，尚不清楚。近年研究认为，TNF-α在缺血再灌注损伤中还具有正面作用，它具有神经保护和促进损伤修复的作用。因此，TNF-α表达增加或降低的确切意义是什么，降纤酶为什么对正常脑组织内低水平的TNF-α表达没有影响，但可降低缺血再灌注损伤的脑组织内的TNF-α表达，这些问题有待今后进一步研究讨论。
参考文献
1 Zea-longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cereˉbralartery occlusion without cranietomy in rats.Stroke，1989，20:84-91.
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6 Buttini M，Appel K，Sauter A，et al.Expression of Tumor necrosis factor-alpha after focal cerebral ischemia inthe rat.Neuroscience，1996，71:1-16.
7 Uno H，Matsuvama T，Akita H，et al.Induction of tumor necrosis factor-alpha in the mouse hippocampus following transient forebrain ischemiˉa.J Cereb Blood FlowMetab，1997，17(5):491-499.
, 百拇医药
8 张莉莉，王景周，周华东，等.肿瘤坏死因子-α在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用机制.中华老年医学杂志，2003，22(2):102-104.
9 Liu T，Clar K，Mcdonnel PC，et al.Tumor necrosis factor-αexpressionin ischemic neurons.Stroke，1994，25:1481-1488.
10 王涛，文亮，李大江.全脑缺血再灌注损伤后炎性细胞因子的变化及意义.中国危重急救医学，2000，12(5):290-292.
11 Yang GY，Gong C，Qin Z，et al.Inhibition ofTNF-αattenuates infarct volume and ICAM-1expression in ischimic mouse brain.Neuroreˉport，1998，9(9):2131-2134.
12 刘清和，曾庆杏，余绍祖，等.抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体对缺血再灌注大鼠脑损伤影响的实验研究.中风与神经疾病杂志，1999，16(4):208-210.
作者单位:450003郑州大学第二附属医院干部病房
450052郑州铁路局中心医院神经内科
(收稿日期:2004-02-03)
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