血小板聚集检测方法新进展--剪切诱导血小板聚集测定法
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2004年8月20日
2004-8-12 17:22:50 中国血液流变学杂志2000年第10卷第1期
血小板聚集功能在生理性止血和病理性血栓形成中均占重要地位。有关血小板聚集功能的检测始于60年代，最初由Born采用透光浊度法测定[1]。该方法主要用于测定各种血小板聚集诱导剂在低剪切率下诱导的血小板聚集。近年来，剪切诱导的血小板聚集(Shear-induced platelet aggregation,SIPA)受到医学界重视，本文将简介其原理与应用。
1 测定原理
一般认为血小板的聚集始于各种诱导剂与血小板膜受体之间的相互作用。这种相互作用通过膜的传递而激活血小板，使其膜表面另一个受体糖蛋白IIb/IIIa(glucoprotein IIb/IIIa,GPIIb/IIIa)活化，再与血浆中的纤维蛋白原结合，中介血小板聚集。这种典型的聚集常用血小板聚集仪来评价。
, 百拇医药
然而，近年研究发现如果血小板受到高剪切力作用，在无诱导剂的情况下也会产生不可逆的聚集。高剪切与低剪切诱导血小板聚集是有区别的，其聚集配体不同。在常规低剪切环境下发生的聚集，是由血浆中的纤维蛋白原中介的；而高剪切环境下的聚集，是vWF中介的。vWF能在高剪切环境的作用是与它独特的分子结构有关。在高剪切力作用下，vWF伸展其巨大的丝状物，这种大多聚体上重复的亚单位提供了一个以多价形式结合于血小板受体的可能性，增加了结合点的数量与相互作用力，使血小板聚集体能有效地对抗流体剪切力的血小板解聚作用。
尽管剪切诱导血小板聚集的分子机制还不十分清楚，但研究发现至少有以下因素参与[2-4]：(1)血浆vWF (2)血小板膜糖蛋白GPIb、GPIIb/IIIa (3)一定浓度的血浆钙离子和ADP。其中，钙离子是诱导剂诱导血小板聚集所必须的。作为诱导剂的ADP在高剪切环境下，可由少数血细胞破坏而得到，但在高剪切下ADP不是诱导血小板聚集的主要因素，vWF和GPIb才是关键所在。研究发现，血小板受到超过60-80dyn/cm2的剪切作用时，GPIb与vWF结合，并导致了血小板的跨膜钙离子内流，使胞浆内钙离子浓度升高2-3倍，同时血小板发生聚集。阻断vWF与GPIb的结合能抑制钙内流，并阻断GPIIb/IIIa与vWF结合，从而抑制血小板聚集。GPIIb/IIIa不参与剪切力对血小板的活化，但中介了血小板的聚集。另外，还发现vWF上与GPIb结合区的基因重组分子(445-733残基)能抑制vWF的所有作用，但它本身不能促使胞浆内钙离子浓度升高。
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2 测定装置
此类实验多采用旋转式锥—板粘度计，把富血小板血浆(PRP)置于相对运动的板和旋转的锥之间，由转速来控制剪切力。当剪应力超过60-80dyn/cm2时，血小板就会产生稳定的聚集。另外，当血小板快速通过微孔或毛细管，使之受到短暂的高剪切力，也观察到血小板聚集现象。最常用的还是旋转式锥—板剪切装置，一般有两种方式：
(1)直接采用具有高剪切条件的旋转式锥—板粘度计，例如剪切率可达到5000s-1以上的旋转式锥—板粘度计。采集血液并制备富血小板血浆，用血小板计数法调节其浓度至一定水平。该血浆在锥—板粘度计的高剪切条件下剪切一定时间后，再次计血小板数。由自由血小板数的减少可算出血小板聚集率。
(2)实验室专用装置：采用旋转式锥—板粘度计的基本结构，锥—板部件则用光学玻璃制造，并用透射或散射光方式实时监测血小板聚集。文献报道的此类装置始于80年代，我们实验室也研制了剪切诱导血小板聚集的激光测定装置[5]，其结构见附图2。
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上述两种方法均可采用，第一种方式属于终点法，第二种方式则可记录血小板聚集的全过程。目前还没有采用第二种方式的商品化的仪器，这也是一个遗憾。
该装置采用光学玻璃制造的锥—板，下部为激光源，上部为散射光探测器。板的旋转与散射光强的测定均由计算机控制。血小板未聚集时为自由血小板，其散射光较强，随聚集程度加重散射光减弱。
3 新方法的应用与意义
正常老年人血液可能处于高粘、高凝和易于形成血栓的倾向。这种倾向是否会转入病理状态则取决于血液、血流与血管间的相互作用。脑血管动脉血栓性疾病日益危害人类健康。在这些疾病的病理过程中，血小板活化是重要的始动因素。298例老年查体的CT资料表明，颈内动脉颅内段虹吸部有164例钙化[6]。有关188例老年脑缺血疾病的超声多普勒检查说明，脑缺血患者中存在颈内动脉颅外段重度狭窄，认为颈内动脉颅外段硬化病变是脑缺血病的危险因子[7]。因此，老年血管往往存在着动脉粥样硬化等退行性变化，血管的局部狭窄可形成血流的高剪切应力。这种剪切诱导血小板聚集的血管与血流条件正是老年脑血栓形成的前提。研究剪切诱导的血小板聚集及其对策对于老年脑血管病的防治有突出的意义。
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中药川芎的有关成分—川芎嗪—对于SIPA有显著的抑制作用[5]。川芎嗪对不同水平剪切应力诱导的血小板聚集呈剂量—抑制关系，川芎嗪的IC50与剪切应力间的关系可以用以下公式表达：IC50=a ebτ，τ表示剪切应力，a、b为常数。此外，我们还在小样本冠心病患者观察了应用川芎嗪前后SIPA的情况。结果表明给药后剪切诱导血小板聚集率明显降低(P<0.001)。药物代谢动力学研究说明，川芎嗪可以通过血脑屏障。从老年脑血管防治的角度，川芎嗪则是很有应用前景的药物。
由此可见，从老年脑血管病预防的角度，SIPA应作为老年人群普查的医学指标。
作者单位：廖福龙(中国中医研究院中药研究所药理室 (北京 100700))
李斌(北京宣武医院)
焦立公(北京药检所)
, http://www.100md.com 游云(中国中医研究院中药研究所药理室 (北京 100700))
参考文献：
[1]Born GVR:Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal.Nature 19(4):927-929,1962
[2]Ruggeri,Z.M.et al.Mechanisms of shear-induced platelet adhesion and aggregation,Thrombosis and haemostasis,1993;70(1):119-123.
[3]Ikeda,Y.et al.Transmembrance calsium influx associated with von willebrand fsctor binding to GPIb in the initation of shear-induced platelet aggregation.Thrombosis and Haemostasis,1993;69(5):496-502
, 百拇医药
[4]Jen CJ,McIntire LV.Characteristics of shear-induced aggregation in whole blood,J Lab Clin Med 1984;103:115
[5]廖福龙等.川芎嗪抗剪切应力诱导血小板聚集的实验研究.中国药理学通报，1997，13(1):47-50
[6]李惠章等.老年人查体发现颈内动脉颅内段钙化的CT资料分析.中华老年医学杂志，1996，15：347-349
[7]郭大乔等.老年人颈内动脉颅外段硬化性病变与脑缺血性疾病的关系.中华老年医学杂志，1998，17：161-164, 百拇医药
血小板聚集功能在生理性止血和病理性血栓形成中均占重要地位。有关血小板聚集功能的检测始于60年代，最初由Born采用透光浊度法测定[1]。该方法主要用于测定各种血小板聚集诱导剂在低剪切率下诱导的血小板聚集。近年来，剪切诱导的血小板聚集(Shear-induced platelet aggregation,SIPA)受到医学界重视，本文将简介其原理与应用。
1 测定原理
一般认为血小板的聚集始于各种诱导剂与血小板膜受体之间的相互作用。这种相互作用通过膜的传递而激活血小板，使其膜表面另一个受体糖蛋白IIb/IIIa(glucoprotein IIb/IIIa,GPIIb/IIIa)活化，再与血浆中的纤维蛋白原结合，中介血小板聚集。这种典型的聚集常用血小板聚集仪来评价。
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然而，近年研究发现如果血小板受到高剪切力作用，在无诱导剂的情况下也会产生不可逆的聚集。高剪切与低剪切诱导血小板聚集是有区别的，其聚集配体不同。在常规低剪切环境下发生的聚集，是由血浆中的纤维蛋白原中介的；而高剪切环境下的聚集，是vWF中介的。vWF能在高剪切环境的作用是与它独特的分子结构有关。在高剪切力作用下，vWF伸展其巨大的丝状物，这种大多聚体上重复的亚单位提供了一个以多价形式结合于血小板受体的可能性，增加了结合点的数量与相互作用力，使血小板聚集体能有效地对抗流体剪切力的血小板解聚作用。
尽管剪切诱导血小板聚集的分子机制还不十分清楚，但研究发现至少有以下因素参与[2-4]：(1)血浆vWF (2)血小板膜糖蛋白GPIb、GPIIb/IIIa (3)一定浓度的血浆钙离子和ADP。其中，钙离子是诱导剂诱导血小板聚集所必须的。作为诱导剂的ADP在高剪切环境下，可由少数血细胞破坏而得到，但在高剪切下ADP不是诱导血小板聚集的主要因素，vWF和GPIb才是关键所在。研究发现，血小板受到超过60-80dyn/cm2的剪切作用时，GPIb与vWF结合，并导致了血小板的跨膜钙离子内流，使胞浆内钙离子浓度升高2-3倍，同时血小板发生聚集。阻断vWF与GPIb的结合能抑制钙内流，并阻断GPIIb/IIIa与vWF结合，从而抑制血小板聚集。GPIIb/IIIa不参与剪切力对血小板的活化，但中介了血小板的聚集。另外，还发现vWF上与GPIb结合区的基因重组分子(445-733残基)能抑制vWF的所有作用，但它本身不能促使胞浆内钙离子浓度升高。
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2 测定装置
此类实验多采用旋转式锥—板粘度计，把富血小板血浆(PRP)置于相对运动的板和旋转的锥之间，由转速来控制剪切力。当剪应力超过60-80dyn/cm2时，血小板就会产生稳定的聚集。另外，当血小板快速通过微孔或毛细管，使之受到短暂的高剪切力，也观察到血小板聚集现象。最常用的还是旋转式锥—板剪切装置，一般有两种方式：
(1)直接采用具有高剪切条件的旋转式锥—板粘度计，例如剪切率可达到5000s-1以上的旋转式锥—板粘度计。采集血液并制备富血小板血浆，用血小板计数法调节其浓度至一定水平。该血浆在锥—板粘度计的高剪切条件下剪切一定时间后，再次计血小板数。由自由血小板数的减少可算出血小板聚集率。
(2)实验室专用装置：采用旋转式锥—板粘度计的基本结构，锥—板部件则用光学玻璃制造，并用透射或散射光方式实时监测血小板聚集。文献报道的此类装置始于80年代，我们实验室也研制了剪切诱导血小板聚集的激光测定装置[5]，其结构见附图2。
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上述两种方法均可采用，第一种方式属于终点法，第二种方式则可记录血小板聚集的全过程。目前还没有采用第二种方式的商品化的仪器，这也是一个遗憾。
该装置采用光学玻璃制造的锥—板，下部为激光源，上部为散射光探测器。板的旋转与散射光强的测定均由计算机控制。血小板未聚集时为自由血小板，其散射光较强，随聚集程度加重散射光减弱。
3 新方法的应用与意义
正常老年人血液可能处于高粘、高凝和易于形成血栓的倾向。这种倾向是否会转入病理状态则取决于血液、血流与血管间的相互作用。脑血管动脉血栓性疾病日益危害人类健康。在这些疾病的病理过程中，血小板活化是重要的始动因素。298例老年查体的CT资料表明，颈内动脉颅内段虹吸部有164例钙化[6]。有关188例老年脑缺血疾病的超声多普勒检查说明，脑缺血患者中存在颈内动脉颅外段重度狭窄，认为颈内动脉颅外段硬化病变是脑缺血病的危险因子[7]。因此，老年血管往往存在着动脉粥样硬化等退行性变化，血管的局部狭窄可形成血流的高剪切应力。这种剪切诱导血小板聚集的血管与血流条件正是老年脑血栓形成的前提。研究剪切诱导的血小板聚集及其对策对于老年脑血管病的防治有突出的意义。
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中药川芎的有关成分—川芎嗪—对于SIPA有显著的抑制作用[5]。川芎嗪对不同水平剪切应力诱导的血小板聚集呈剂量—抑制关系，川芎嗪的IC50与剪切应力间的关系可以用以下公式表达：IC50=a ebτ，τ表示剪切应力，a、b为常数。此外，我们还在小样本冠心病患者观察了应用川芎嗪前后SIPA的情况。结果表明给药后剪切诱导血小板聚集率明显降低(P<0.001)。药物代谢动力学研究说明，川芎嗪可以通过血脑屏障。从老年脑血管防治的角度，川芎嗪则是很有应用前景的药物。
由此可见，从老年脑血管病预防的角度，SIPA应作为老年人群普查的医学指标。
作者单位：廖福龙(中国中医研究院中药研究所药理室 (北京 100700))
李斌(北京宣武医院)
焦立公(北京药检所)
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参考文献：
[1]Born GVR:Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal.Nature 19(4):927-929,1962
[2]Ruggeri,Z.M.et al.Mechanisms of shear-induced platelet adhesion and aggregation,Thrombosis and haemostasis,1993;70(1):119-123.
[3]Ikeda,Y.et al.Transmembrance calsium influx associated with von willebrand fsctor binding to GPIb in the initation of shear-induced platelet aggregation.Thrombosis and Haemostasis,1993;69(5):496-502
, 百拇医药
[4]Jen CJ,McIntire LV.Characteristics of shear-induced aggregation in whole blood,J Lab Clin Med 1984;103:115
[5]廖福龙等.川芎嗪抗剪切应力诱导血小板聚集的实验研究.中国药理学通报，1997，13(1):47-50
[6]李惠章等.老年人查体发现颈内动脉颅内段钙化的CT资料分析.中华老年医学杂志，1996，15：347-349
[7]郭大乔等.老年人颈内动脉颅外段硬化性病变与脑缺血性疾病的关系.中华老年医学杂志，1998，17：161-164, 百拇医药