中国部分地区麻风菌的基因分型初探
作者：吴勤学 尹跃平 张良芬 侯伟 余艳华
单位：南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所 210042
关键词：分支杆菌；麻风基因型
中华皮肤科杂志00zk20
【摘要】目的探讨我国麻风菌有否基因型的差别。方法用麻风菌基因扩增试验检测我国 有关省份麻风患者病损活检标本中麻风菌的DNA分型。结果检测的9个省中的麻风临床标本16 份，其中有7份标本出现91bpDNA片段，有9份标本出现97bpDNA片段。结论我国麻风菌可能在 基因水平上有株间差异，并且分布在不同地区。
Preliminary Investigation of Genotype and Its Distribution of Mycobacterium Leprae Strains in Part of China
, 百拇医药
WU Qinxue YIN Yueping ZHANG Liangfen et al
(Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union
Medical College, Nanjing 210042)
【 Abstract】 Objective To explore whether there were differences in genotypes between strains of M.leprae in China or not. Methods Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the genotypes of M.leprae in samples from patients with
, 百拇医药
leprosy in different parts of China. Results Out of 16 samples from 9 provinces, 91 bp DNA fragments were present in 7 samples and 97 bp DNA fragments in 9 samples. Conclusion Above mentioned results suggest the genotyping differences in strains of M.leprae with different distribution in areas of China.
【 Key words】 Mycobacterium leprae Genotype
麻风菌分型对判断麻风菌感染的免疫学有重要意义[1]，鼠足垫接种曾发现有生长速度的差别，但由于麻风菌尚不能体外培养，大大地限制了对它的深入研究，当今分子生物学技术的发展使我们有可能从分子水平的高度去了解麻风菌是否有分型及其分型基础，我们用PCR法在我国部分地区麻风患者的活检石蜡包埋组织切片和未经包埋活检标本中做了初步研究，现将所得结果报告如下。
, 百拇医药
材料和方法
一、材料
(一)受检标本：为麻风患者的石蜡包埋活检组织(经10%中性福尔马林液或70%酒精固定)或70%酒精固定活检组织。其临床状况如表1所示。
表1 临床标本状况及其麻风菌基因分型测结果 标本号
病型
BI
放大DNA片段(bp)
固定剂及标本形式
来源
91
97
, 百拇医药
2437
MB
2+
91
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乙醇、蜡块
黑龙江省
2433
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3+
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乙醇、蜡块
, 百拇医药 辽宁省
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乙醇、蜡块
辽宁省
Yu XX
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乙醇、组织匀浆
, 百拇医药
辽宁省
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福尔马林、蜡块
山东省
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6+
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, 百拇医药
福尔马林、蜡块
山东省
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不明
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福尔马林、蜡块
江苏省
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不明
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, 百拇医药
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福尔马林、蜡块
江苏省
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福尔马林、蜡块
安徽省
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, http://www.100md.com
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福尔马林、蜡块
浙江省
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福尔马林、蜡块
浙江省
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, 百拇医药
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乙醇、蜡块
浙江省
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福尔马林、蜡块
福建省
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广东省
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贵州省
合计
16
7
9
(二)石蜡切片处理剂和PCR引物：采用的Texpat试盒和引物RPOT(F)(简称P1)和RPUT(R)(简称P2)均由日本国立感染病研究所多摩麻风中心松冈赠送。
, 百拇医药
(三)dNTPs及Taq酶：购于上海复旦大学科技开发公司和遗传研究所。试剂盒全称为：FDDK-I DNA Amplication Kit I。
二、方法
(一)石蜡包埋活检组织中麻风菌模板DNA的释放与纯化：采用我们变动的松冈方法[3]。将蜡块内包埋组织切成5μm厚切片，取5片置于1.5m LE ppendorf管中，取Texpat液，摇匀，向已加有石蜡切片的Eppendorf管中加20滴Texpat液，旋涡振荡后，置100℃水浴10min，于12000r/min4℃离心15min，小心取150μL上清液置另一备好的Eppendorf管中，按2倍体积加无水酒精，旋涡振荡后置-72℃30min，于15000r/min4℃离心15min，倾去上清液，倒置试管自然干燥后，每管加入TE缓冲液50μL置-20℃备用。
(二)70%酒精固定之活检组织中麻风菌模板DNA的释放和纯化：无菌操作将活检组织于玻璃研磨器中剪碎和研磨20min，用无菌蒸馏水制成匀浆，取10min静置上清液，15000r/min4℃离心15min，留沉淀，视沉淀量多少酌加0.2～0.5mL无菌蒸馏水悬浮沉淀。取5μL悬浮液在液氮、沸水浴中反复冻融5次，最后1次煮沸10min，即可直接用于基因扩增试验。
, http://www.100md.com
(三)基因扩增和检测方法：分别取石蜡切片和活检匀浆提取的麻风菌DNA液1μL，加dNTPs 8μL、P12.5μL、P22.5μL、5×Buffer 10μL及DW25.5μL。在PTC-51B型PCR仪中，95℃10min，后加Taq酶0.5μL和石蜡油50μL，再按94℃90s，55℃90s，72℃120s总循环40次，最后72℃延伸10min。取9μL扩增产物进行15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，用1%EB染色，以蒸馏水脱去背景，在紫外检测仪下观察并照相记录结果。
结果
结果见图1和表1。
图1 麻风患者活检标本中麻风菌DNA扩增后型别
图1 显示麻风患者标本中麻风菌经DNA扩增后出现的基因型别。由于泳道数限制，仅列出其中部分标本的结果作为型例。
, 百拇医药 表1列出我国从北向南沿海和与它周围相邻的省份的抽样调查结果，抽样数不等。初步显示：①所检全部标本中不同标本出现2种分子量的特异条带，即91bp和97bp条带；②在抽样为2～3份标本的5个省中，都有标本显示91bp和97bp的条带，且出现97bp条带的标本偏多些；③其余4省抽样仅1份标本，各省标本亦各自显示有91bp或97bp放大DNA片段的带型出现。
讨论
众所周知，许多细菌和病毒有其不同的生物表型、不同的血清型和基因型，这些差异在疾病传播、感染发病乃至治疗上都有着重要意义。麻风既然是一种传染病，了解麻风菌的分型状况对判断麻风菌的免疫学非常重要。但由于麻风菌至今尚不能体外培养，大大地限制了对它各方面的深入研究，其分型的研究也同样滞后。回顾历史，Shepard曾用小鼠足垫模型显示麻风菌在小鼠足垫中的生长速度有所不同，认为麻风菌有“快速型”和“慢速型”之分，但他未发现有地理环境上的差别，由于菌在足垫中为有限繁殖，也未能发现有何致病力上的差别，其后荷兰学者Wit等[2]在14届国际麻风会议上报告了他们用RAPD-PCR、ERIC-PCR和REP-PCR检测的结果，认为麻风菌有株间差异，但未对其意义作何讨论。日本松冈报告了他们在巴基斯坦、泰国、印度、菲律宾等国家以及天然感染的犰狳和猩猩等的麻风菌发现有基因型的不同。
, 百拇医药
我们用简化的松冈[3]方法对我国部分地区麻风患者来源的麻风菌进行初步分型研究，发现了在我国存在着麻风菌基因型上的差别，在已检测的9个省份中，已发现5省同时出现了基因带型的差别，其余4省间也显示了有带型的差别，其意义尚待研究。我们认为进一步进行下列研究可能很有必要：①应扩大样本(包括扩大一个地区的样本量和扩大研究地区数)进行探讨，特别是在尚未发现带型有别的省份；②取足垫之“快速型”和“慢速性”菌进行基因型分析，将发现基因带型差
别的菌接种鼠足垫(在裸鼠更好)，观其生长速度异同，共同比较分析其表现型与基因型
有否相关；③将得到带型差别的所有菌进行基因测序，比较分析基因型的多形性与生物
表型及致病性、疾病分型乃至治疗有否相关；④进一步分析麻风菌的疫源及分子流行学
情况，可能有助于了解麻风的起源及传播情况。
参考文献
1，松冈正典,前田伸司,甲斐雅规，他.らハ菌rPOT遗子の多型性之の地理分布.JapanJLepr ,1999,68:51.
2，中国麻风防治协会.第14届国际麻风会议专题报告与论文文摘汇编，1995.219.
3， 吴勤学,尹跃平,张良芬，等.石蜡包埋组织中麻风菌基因扩增试验初探.中华皮肤科杂志 ,2000,33(增刊)：63-64.
(收稿日期：1999-12-10), http://www.100md.com
单位：南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所 210042
关键词：分支杆菌；麻风基因型
中华皮肤科杂志00zk20
【摘要】目的探讨我国麻风菌有否基因型的差别。方法用麻风菌基因扩增试验检测我国 有关省份麻风患者病损活检标本中麻风菌的DNA分型。结果检测的9个省中的麻风临床标本16 份，其中有7份标本出现91bpDNA片段，有9份标本出现97bpDNA片段。结论我国麻风菌可能在 基因水平上有株间差异，并且分布在不同地区。
Preliminary Investigation of Genotype and Its Distribution of Mycobacterium Leprae Strains in Part of China
, 百拇医药
WU Qinxue YIN Yueping ZHANG Liangfen et al
(Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union
Medical College, Nanjing 210042)
【 Abstract】 Objective To explore whether there were differences in genotypes between strains of M.leprae in China or not. Methods Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the genotypes of M.leprae in samples from patients with
, 百拇医药
leprosy in different parts of China. Results Out of 16 samples from 9 provinces, 91 bp DNA fragments were present in 7 samples and 97 bp DNA fragments in 9 samples. Conclusion Above mentioned results suggest the genotyping differences in strains of M.leprae with different distribution in areas of China.
【 Key words】 Mycobacterium leprae Genotype
麻风菌分型对判断麻风菌感染的免疫学有重要意义[1]，鼠足垫接种曾发现有生长速度的差别，但由于麻风菌尚不能体外培养，大大地限制了对它的深入研究，当今分子生物学技术的发展使我们有可能从分子水平的高度去了解麻风菌是否有分型及其分型基础，我们用PCR法在我国部分地区麻风患者的活检石蜡包埋组织切片和未经包埋活检标本中做了初步研究，现将所得结果报告如下。
, 百拇医药
材料和方法
一、材料
(一)受检标本：为麻风患者的石蜡包埋活检组织(经10%中性福尔马林液或70%酒精固定)或70%酒精固定活检组织。其临床状况如表1所示。
表1 临床标本状况及其麻风菌基因分型测结果 标本号
病型
BI
放大DNA片段(bp)
固定剂及标本形式
来源
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合计
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(二)石蜡切片处理剂和PCR引物：采用的Texpat试盒和引物RPOT(F)(简称P1)和RPUT(R)(简称P2)均由日本国立感染病研究所多摩麻风中心松冈赠送。
, 百拇医药
(三)dNTPs及Taq酶：购于上海复旦大学科技开发公司和遗传研究所。试剂盒全称为：FDDK-I DNA Amplication Kit I。
二、方法
(一)石蜡包埋活检组织中麻风菌模板DNA的释放与纯化：采用我们变动的松冈方法[3]。将蜡块内包埋组织切成5μm厚切片，取5片置于1.5m LE ppendorf管中，取Texpat液，摇匀，向已加有石蜡切片的Eppendorf管中加20滴Texpat液，旋涡振荡后，置100℃水浴10min，于12000r/min4℃离心15min，小心取150μL上清液置另一备好的Eppendorf管中，按2倍体积加无水酒精，旋涡振荡后置-72℃30min，于15000r/min4℃离心15min，倾去上清液，倒置试管自然干燥后，每管加入TE缓冲液50μL置-20℃备用。
(二)70%酒精固定之活检组织中麻风菌模板DNA的释放和纯化：无菌操作将活检组织于玻璃研磨器中剪碎和研磨20min，用无菌蒸馏水制成匀浆，取10min静置上清液，15000r/min4℃离心15min，留沉淀，视沉淀量多少酌加0.2～0.5mL无菌蒸馏水悬浮沉淀。取5μL悬浮液在液氮、沸水浴中反复冻融5次，最后1次煮沸10min，即可直接用于基因扩增试验。
, http://www.100md.com
(三)基因扩增和检测方法：分别取石蜡切片和活检匀浆提取的麻风菌DNA液1μL，加dNTPs 8μL、P12.5μL、P22.5μL、5×Buffer 10μL及DW25.5μL。在PTC-51B型PCR仪中，95℃10min，后加Taq酶0.5μL和石蜡油50μL，再按94℃90s，55℃90s，72℃120s总循环40次，最后72℃延伸10min。取9μL扩增产物进行15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，用1%EB染色，以蒸馏水脱去背景，在紫外检测仪下观察并照相记录结果。
结果
结果见图1和表1。
图1 麻风患者活检标本中麻风菌DNA扩增后型别
图1 显示麻风患者标本中麻风菌经DNA扩增后出现的基因型别。由于泳道数限制，仅列出其中部分标本的结果作为型例。
, 百拇医药 表1列出我国从北向南沿海和与它周围相邻的省份的抽样调查结果，抽样数不等。初步显示：①所检全部标本中不同标本出现2种分子量的特异条带，即91bp和97bp条带；②在抽样为2～3份标本的5个省中，都有标本显示91bp和97bp的条带，且出现97bp条带的标本偏多些；③其余4省抽样仅1份标本，各省标本亦各自显示有91bp或97bp放大DNA片段的带型出现。
讨论
众所周知，许多细菌和病毒有其不同的生物表型、不同的血清型和基因型，这些差异在疾病传播、感染发病乃至治疗上都有着重要意义。麻风既然是一种传染病，了解麻风菌的分型状况对判断麻风菌的免疫学非常重要。但由于麻风菌至今尚不能体外培养，大大地限制了对它各方面的深入研究，其分型的研究也同样滞后。回顾历史，Shepard曾用小鼠足垫模型显示麻风菌在小鼠足垫中的生长速度有所不同，认为麻风菌有“快速型”和“慢速型”之分，但他未发现有地理环境上的差别，由于菌在足垫中为有限繁殖，也未能发现有何致病力上的差别，其后荷兰学者Wit等[2]在14届国际麻风会议上报告了他们用RAPD-PCR、ERIC-PCR和REP-PCR检测的结果，认为麻风菌有株间差异，但未对其意义作何讨论。日本松冈报告了他们在巴基斯坦、泰国、印度、菲律宾等国家以及天然感染的犰狳和猩猩等的麻风菌发现有基因型的不同。
, 百拇医药
我们用简化的松冈[3]方法对我国部分地区麻风患者来源的麻风菌进行初步分型研究，发现了在我国存在着麻风菌基因型上的差别，在已检测的9个省份中，已发现5省同时出现了基因带型的差别，其余4省间也显示了有带型的差别，其意义尚待研究。我们认为进一步进行下列研究可能很有必要：①应扩大样本(包括扩大一个地区的样本量和扩大研究地区数)进行探讨，特别是在尚未发现带型有别的省份；②取足垫之“快速型”和“慢速性”菌进行基因型分析，将发现基因带型差
别的菌接种鼠足垫(在裸鼠更好)，观其生长速度异同，共同比较分析其表现型与基因型
有否相关；③将得到带型差别的所有菌进行基因测序，比较分析基因型的多形性与生物
表型及致病性、疾病分型乃至治疗有否相关；④进一步分析麻风菌的疫源及分子流行学
情况，可能有助于了解麻风的起源及传播情况。
参考文献
1，松冈正典,前田伸司,甲斐雅规，他.らハ菌rPOT遗子の多型性之の地理分布.JapanJLepr ,1999,68:51.
2，中国麻风防治协会.第14届国际麻风会议专题报告与论文文摘汇编，1995.219.
3， 吴勤学,尹跃平,张良芬，等.石蜡包埋组织中麻风菌基因扩增试验初探.中华皮肤科杂志 ,2000,33(增刊)：63-64.
(收稿日期：1999-12-10), http://www.100md.com