血管紧张素Ⅱ介导的心肌细胞肥大反应中磷酸化MAPK的作用
作者：刘培庆 鲁伟 王庭槐 潘敬运
单位：中山医科大学生理学教研室， 广东 广州 510089
关键词：丝裂原活化蛋白激酶；心肌细胞；肥大反应；血管紧张素Ⅱ；磷酸化
00zk04摘 要：【目的】 本研究主要是从丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活及失活角度研究该信号途径在血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)介导的心肌细胞肥大反应中作用。【方法】 实验分别以：①心肌细胞蛋白合成速率作为心肌肥大反应指标；②磷酸化MAPK蛋白(p44MAPK、p42MAPK)表达反映MAPK活性状态。【结果】 ①AngⅡ(0.1 μmol/L)处理心肌细胞48 h，可使3H-亮氨酸掺入明显增加，该作用可被CV11974明显抑制(抑制85%),而PD098059可部分抑制该反应(抑制32.5%)；②AngⅡ(0.1 μmol/L)处理心肌细胞 5 min，磷酸化MAPK蛋白表达即开始增加，30 min左右达到高峰，2 h基本恢复正常，血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型受体(AT1)拮抗剂CV11974(0.1 mmol/L)或MAPK激酶(MEK)特异性抑制剂PD098059(50 μmol/L)可明显抑制AngⅡ介导的磷酸化MAPK蛋白表达(30 min时分别下降89%及81%)。【结论】 AngⅡ主要通过AT1受体激活MAPK及介导心肌肥大反应，抑制MAPK的激活可减轻AngⅡ介导的心肌肥大反应。MAPK通路激活是AngⅡ介导的心肌肥大反应重要机制。
, 百拇医药
中图分类号： R331.36 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0013-04
The Regulation of MKP-1 in Cardiomyocyte Hypertrophic Response Induced by Angiotensin Ⅱ
LIU Pei-qing, LU Wei, WANG Ting-huai, PAN Jing-yun
(Department of Physiology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
Abstract: 【Objective】 The study was to examine the MAPK activity and protein expression in the cardiomyocyte hypertrophic response induced by angiotensin Ⅱ(AngⅡ). 【Method】 (1) Neonatal rat cardiomyocyte hypertrophic response was assayed by protein synthesis rate. (2) Protein expression of Phosphorlated MAPK and MKP-1 were detected by Western blotting.【Result】 (1) AngⅡ induced promotion of 3 H-leucine incorporation in dose-dependent manner. Pretreatment with CV11974, a selective AT1 receptor antagonist, or PD098059, a specific MEK inhibitor, cardiomyocyte hypertrophic response induced by AngⅡ could be inhibited by 85% and 32.5%, respectively.(2) Pretreatment of cardio myocyte with AngⅡ for 5 min, p44MAPK and p42MAPK protein expression began to increase，the peak effect was at 30 min and last for 2 h; while pretreatment with CV11974(0.1 mmol/L) or PD098059 (50 μmol/L), AngⅡ-induced increase in (p44+ p42)MAPK were inhibited by 89% and 81%, respectively. 【Conclusion】 The results suggest that activation of MAPK may play an important role in AngⅡ-induce hypertrophic response in neonatal rat cardiomyocyte, and other signal pathway may also participated in AngⅡ-induced cardiomyocyte hypertrophic response.
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Key words: mitogen-activated protein kinase; cardiomyocyte; hypertrophic response; angiotensin Ⅱ; phosphorylation
许多研究证明在压力超负荷等病理因素所导致的心肌肥大反应中，血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是重要的刺激因子，而血管紧张素转化酶抑制剂及血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)受体拮抗剂是目前治疗高血压心肌肥厚的重要药物[1，2]。但AngⅡ导致心肌肥大反应的细胞内信号调控机制尚未完全阐明。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK )是目前发现的一个重要的生长信号调节蛋白，广泛分布在胞浆内，其成员细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)，主要是p44 MAPK和p42 MAPK两个同型体与细胞生长、分化和增殖的调控关系尤为密切[3]。本研究主要利用培养的新生大鼠心肌细胞，通过探讨血管紧张素Ⅱ激活MAPK与介导心肌肥大反应的受体途径及相互关系，分析MAPK信号途径在血管紧张素Ⅱ导致心肌肥大反应中的作用，为深入研究心肌肥大的发生和逆转机制提供新思路和线索。
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1 材料与方法
1.1 心肌细胞细胞培养
按Simpson等描述的方法培养新生大鼠心肌细胞。以6 g/L胰蛋白酶分离1～3 d龄的Sprague-Dawley大鼠心室肌细胞，采用差速贴壁法纯化心肌细胞。在培养的前48 h，在心肌细胞培养液中加入0.1 mmol/L 5'-溴脱氧尿苷，以抑制非心肌细胞增殖。然后换无血清培养液，72 h开始用于药物实验。
1.2 心肌细胞3H-亮氨酸掺入测定
调细胞数密度0.3×109/L，接种于24孔培养板上，每孔1 mL。培养48 h后换为无血清培养基，培养24 h后加入0.037 MBq 3 H-亮氨酸及各种处理因子,继续培养48 h。收集细胞于玻璃纤维素膜上,以三氯乙酸固定,洗去游离的同位素标记物。滤膜烘干后置于含5 mL闪烁液的闪烁瓶中,以LS3801液体闪烁仪(Beckman)测定放射强度。
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1.3 免疫印迹法测定磷酸化MAPK蛋白表达[4]
各种干预因素处理不同时间后，去除心肌细胞培养瓶中液体，加入0.15 mL提取液,其组成为(mmol/L):β-磷酸甘油20，benzanidine 10，焦磷酸钠 50，NaF 50，NaCl 50，EDTA 5，EGTA 5，Na3VO4 0.2, HEPES 10 (pH7.4),PMSF 0.5，aprotinin 0.1，leupeptin 0.02，φ=0.1% Triton X-100，φ=0.3% β-巯基乙醇。收集细胞提取物，以低温高速离心机(Eppendorf 5417R型)4 ℃离心 (13 000 r/min,r=9.2 cm)，取上清液，按Bradford法测量蛋白浓度，调蛋白质量浓度至200 mg/L，进行SDS-PAGE电泳，电印迹转移法转至硝酸纤维素膜上，以含10 g/L牛血清白蛋白(BSA)的TBST溶液室温封闭1 h，分别与一抗(小鼠来源抗磷酸化MAPK单克隆抗体，1∶10 000稀释度)和二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG)室温各孵育1 h，与ECL试剂反应1 min，X线胶片压片曝光1 min，用IBAS图像处理系统对胶片扫描测定感光区带的感光密度，并进行积分处理。
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1.4 试 剂
小鼠来源磷酸化MAPK单克隆抗体(可与大鼠、人等种系动物发生免疫反应，Sigma目录号：M8159)、leupeptin、apoprotin、PMSF、蛋白激酶抑制肽(其氨基酸序列为：TTYADFIASGRRANAIHD)、AngⅡ均购自Sigma公司，化学发光增强剂(ECL)购自基因公司，其中含辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG，3H-亮氨酸购自北京原子能研究所，CV11974由日本爱媛大学小野知原教授惠赠，PD098059、胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司，其它试剂均为国产分析纯。
1.5 统计学处理
数据以均数±标准差(
±s)表示。进行秩和检验，P<0.05表示差异有显著性意义。
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2 结 果
2.1 AngⅡ对蛋白质合成速率
在无血清培养液中，AngⅡ(0.01～1.00 μmol/L)剂量依赖性增加新生大鼠心肌细胞3H-亮氨酸掺入。以0.1 μmol/L作为AngⅡ的标准实验浓度。AngⅡ(0.1 μmol/L)处理心肌细胞48 h，可使3H-亮氨酸掺入明显增加，该作用可被AT1受体阻断剂(CV11974，为TCV-116活性代谢产物，终浓度1 μmol/L)明显抑制(抑制85%),而MAPK激酶(MEK)特异性抑制剂PD098059(50 μmol/L)可部分抑制该反应(抑制32.5%)。以上结果表明AngⅡ主要通过AT1受体介导心肌肥大反应，抑制MAPK的激活可减轻但不能完全取消AngⅡ介导的心肌肥大反应(图1，2)。
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图1 不同浓度AngⅡ对培养的新生大鼠心肌细胞3H-
亮氨酸掺入的影响
Fig.1 Effects of angiotensin Ⅱ on the surface area,3H-leucine incorporation and protein content
in the cultured neonatal rat cardio myocyte
图2 CV11974及PD098059对AngⅡ促进培养新生大鼠
心肌细胞3H-亮氨酸掺入的影响
, 百拇医药
Fig.2 Effects of CV11974 and PD098059 on promotion of
3H-leucine incorporation in cultured neonatal rat cardio myocyte induced by angiotensin Ⅱ(0.1 μmol/L)
*P<0.05,* *P<0.01 compared with control; #P<0.05, # #P<0.01 compared with AngⅡ
2.2 AngⅡ诱导磷酸化MAPK蛋白表达的受体途径及时相关系
以针对磷酸化p44MAPK和p42MAPK两个同型体的MAPK单克隆抗体对SDS-PAGE电泳结果进行免疫分析，结果显示新生大鼠心肌细胞中MAPK这两个同型体皆有表达。AngⅡ处理心肌细胞5 min磷酸化MAPK蛋白(p44MAPK及p42MAPK)表达即开始增加，30 min左右达到高峰，提示MAPK磷酸化激活，2 h磷酸化MAPK蛋白表达基本恢复正常。AT1拮抗剂CV11974(0.1 mmol/L)或MAPK激酶(MEK)特异性抑制剂PD098059(50 μmol/L)可明显抑制AngⅡ介导的磷酸化MAPK蛋白表达(30 min时分别下降89%及81%)，提示同介导心肌细胞肥大反应相似，AngⅡ激活MAPK亦主要通过AT1受体，抑制MAPK上游激酶MEK可明显抑制磷酸化MAPK蛋白表达(图3，4)。
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图3 CV11974及PD098059对AngⅡ激活MAPK的影响
Fig.3 Effects of CV11974 and PD098059 on mitogen-
activated protein kinase activity stimulated
by angiotensin Ⅱ(0.1 μmol/L)
*P<0.05,* *P<0.01 compared with control; #P<0.05, # #P<0.01 compared with AngⅡ
图4 AngⅡ诱导磷酸化MAPK蛋白表达的时相关系
, http://www.100md.com
Fig.4 Time caurse of phosphorylated mitogen-activated
protein kinase protein expression induced
by angiotensin Ⅱ
*P<0.05,* *P<0.01 compared with control
3 讨 论
本研究表明，AngⅡ可剂量依赖性的诱导培养的新生大鼠心肌细胞的肥大反应及MAPK激活，这种作用主要通过AT1受体介导。抑制MAPK的激活可减轻但不能完全取消AngⅡ介导的心肌肥大反应，提示MAPK通路是AngⅡ介导的心肌肥大反应信号途径之一。
, http://www.100md.com 近年，人们对AngⅡ作用的细胞内信号机制进行了广泛的研究；特别是蛋白激酶作为细胞内信号传递的重要组成部分，在AngⅡ介导的心肌肥大中的作用更受到人们广泛关注。MAPK是20世纪90年代以来发现的最重要的生长信号调节蛋白，其在细胞信号传导方面有两个重要特征[5,6]：①活化的MAPK通过转位方式进入细胞核，激活其下游底物，主要是一些编码核转录因子的早反应基因(如原癌基因c-fos、c-myc、c-jun 和Erg-1等)表达，调控细胞生长反应，导致次级反应基因(如ANF基因、β-MHC基因、MLC-2基因等)的异常表达，影响细胞的功能；②MAPK可将多个不同受体系统(如G-蛋白耦联受体和蛋白酪氨酸激酶受体)介导的信号加以整合，起着多种信号的交汇点或共同通路的作用[7，8]。AngⅡ作为一种重要的致心肌肥大因子，对MAPK信号途径的逐级激活可能是其导致心肌肥大的重要机制[9]。但是激活的MAPK很快被细胞内的磷酸酶去磷酸化而失活，因此，MAPK的激活可能只作为心肌肥大反应的启动信号。有多种可能导致MAPK磷酸化位点去磷酸化的磷酸酶，其中较为重要的包括MKP-1和钙调蛋白磷酸酶(calcineurin)，我们的相关研究提示在心肌细胞，MKP-1是失活MAPK的主要磷酸酶，即MAPK活性受其上游MAPK激酶及其下游MAPK磷酸酶的双重调控。本研究发现抑制MAPK的激活可减轻但不能完全取消AngⅡ介导的心肌肥大反应，提示除MAPK信号途径外，尚可能存在其它介导AngⅡ致心肌肥大反应的信号通路。我们既往研究观察到AngⅡ介导的心肌肥大反应时可导致细胞内钙浓度增加，钙-钙调蛋白信号通路可能也与AngⅡ介导的心肌肥大反应有关[9,10]。
, 百拇医药
本实验结果证明MAPK激活是AngⅡ介导心肌肥大反应的重要环节，但MAPK信号通路可能不是AngⅡ介导的心肌肥大反应唯一信号途径，深入探讨心肌肥大的细胞内信号机制，将为研究心肌肥大的发生和逆转机制提供重要的思路和线索。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870888)
作者简介：刘培庆(1964-)，男，山东泰安人，博士，副教授.
参考文献：
[1] Watson P A. Mechanical activation of signaling pathways in the cardiovascular system [J]. Trends Cardiovasc Med , 1996, 6(1): 73.
[2] Menard J, Campbell D J, Azizi M, et al. Synergistic effects of ACE inhibition and AngⅡantagonism on blood pressure,cardiac weight, and renin in spontaneously hypertensive rats [J]. Circulation, 1997, 96(13): 3072.
, 百拇医药
[3] Post R P ,Goldstein D, Thuerauf D J, et al. Dissociation of p44 and p42 mitogen-activated protein kinase activation from receptor-induced hypertrophy in neonatal rat ventricular myocyte [J]. J Biol Chem, 1996, 271(14): 8452.
[4] Anita M P, Rim C S, Yao H, et al. A novel mitogen-activated protein kinase phosphatase [J]. J Biol Chem, 1996, 270(24): 8452.
[5] Fuller S J, Davies E L, Gillespie B J, et al. Mitogen-activated protein kinase phosphatase 1 inhibits the stimulation of gene expression by hypertrophic agonists in cardiac myocytes [J]. Biochem J, 1997,323(Pt 2):313.
, 百拇医药
[6] Cook S J, Beltman J, Cadwallader K A, et al. Regulation of mitogen-activated protein kinase phosphatase 1 expression by extracellular signal-related kinase-dependent and Ca2+-dependent signal pathways in Rat-1 cells [J]. J Biol Chem, 1997, 272(20): 13309.
[7] Kusari A B, Byon J，Bandyopadhyay D，et al. Insulin-induced mitogen-activated protein (MAP) kinase phosphatase -1 (MKP-1) attenuates insulin-stimulated MAP kinase activity: a mechanism for the feedback inhibition of insulin signaling [J]. Mol Endocrinol, 1997, 11(10): 1532.
, 百拇医药
[8] Cho M J. Reciprocal regulation of mammalian nitric oxide synthase and calcineurin by plant calmodulin isoforms [J]. Biochemistry,1998,37(45):15593.
[9] Martin A. Signaling pathways in cardiac myocyte hypertrophy [J]. J Mol Cell Cardiol, 1997, 29: 2873.
[10] Quadroni M. Phosphorylation of calmodulin alters its potency as an activator of target enzymes [J]. Biochemistry.1998,37(18):6523.
收稿日期：2000-04-17, 百拇医药
单位：中山医科大学生理学教研室， 广东 广州 510089
关键词：丝裂原活化蛋白激酶；心肌细胞；肥大反应；血管紧张素Ⅱ；磷酸化
00zk04摘 要：【目的】 本研究主要是从丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活及失活角度研究该信号途径在血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)介导的心肌细胞肥大反应中作用。【方法】 实验分别以：①心肌细胞蛋白合成速率作为心肌肥大反应指标；②磷酸化MAPK蛋白(p44MAPK、p42MAPK)表达反映MAPK活性状态。【结果】 ①AngⅡ(0.1 μmol/L)处理心肌细胞48 h，可使3H-亮氨酸掺入明显增加，该作用可被CV11974明显抑制(抑制85%),而PD098059可部分抑制该反应(抑制32.5%)；②AngⅡ(0.1 μmol/L)处理心肌细胞 5 min，磷酸化MAPK蛋白表达即开始增加，30 min左右达到高峰，2 h基本恢复正常，血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型受体(AT1)拮抗剂CV11974(0.1 mmol/L)或MAPK激酶(MEK)特异性抑制剂PD098059(50 μmol/L)可明显抑制AngⅡ介导的磷酸化MAPK蛋白表达(30 min时分别下降89%及81%)。【结论】 AngⅡ主要通过AT1受体激活MAPK及介导心肌肥大反应，抑制MAPK的激活可减轻AngⅡ介导的心肌肥大反应。MAPK通路激活是AngⅡ介导的心肌肥大反应重要机制。
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中图分类号： R331.36 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0013-04
The Regulation of MKP-1 in Cardiomyocyte Hypertrophic Response Induced by Angiotensin Ⅱ
LIU Pei-qing, LU Wei, WANG Ting-huai, PAN Jing-yun
(Department of Physiology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
Abstract: 【Objective】 The study was to examine the MAPK activity and protein expression in the cardiomyocyte hypertrophic response induced by angiotensin Ⅱ(AngⅡ). 【Method】 (1) Neonatal rat cardiomyocyte hypertrophic response was assayed by protein synthesis rate. (2) Protein expression of Phosphorlated MAPK and MKP-1 were detected by Western blotting.【Result】 (1) AngⅡ induced promotion of 3 H-leucine incorporation in dose-dependent manner. Pretreatment with CV11974, a selective AT1 receptor antagonist, or PD098059, a specific MEK inhibitor, cardiomyocyte hypertrophic response induced by AngⅡ could be inhibited by 85% and 32.5%, respectively.(2) Pretreatment of cardio myocyte with AngⅡ for 5 min, p44MAPK and p42MAPK protein expression began to increase，the peak effect was at 30 min and last for 2 h; while pretreatment with CV11974(0.1 mmol/L) or PD098059 (50 μmol/L), AngⅡ-induced increase in (p44+ p42)MAPK were inhibited by 89% and 81%, respectively. 【Conclusion】 The results suggest that activation of MAPK may play an important role in AngⅡ-induce hypertrophic response in neonatal rat cardiomyocyte, and other signal pathway may also participated in AngⅡ-induced cardiomyocyte hypertrophic response.
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Key words: mitogen-activated protein kinase; cardiomyocyte; hypertrophic response; angiotensin Ⅱ; phosphorylation
许多研究证明在压力超负荷等病理因素所导致的心肌肥大反应中，血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是重要的刺激因子，而血管紧张素转化酶抑制剂及血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)受体拮抗剂是目前治疗高血压心肌肥厚的重要药物[1，2]。但AngⅡ导致心肌肥大反应的细胞内信号调控机制尚未完全阐明。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK )是目前发现的一个重要的生长信号调节蛋白，广泛分布在胞浆内，其成员细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)，主要是p44 MAPK和p42 MAPK两个同型体与细胞生长、分化和增殖的调控关系尤为密切[3]。本研究主要利用培养的新生大鼠心肌细胞，通过探讨血管紧张素Ⅱ激活MAPK与介导心肌肥大反应的受体途径及相互关系，分析MAPK信号途径在血管紧张素Ⅱ导致心肌肥大反应中的作用，为深入研究心肌肥大的发生和逆转机制提供新思路和线索。
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1 材料与方法
1.1 心肌细胞细胞培养
按Simpson等描述的方法培养新生大鼠心肌细胞。以6 g/L胰蛋白酶分离1～3 d龄的Sprague-Dawley大鼠心室肌细胞，采用差速贴壁法纯化心肌细胞。在培养的前48 h，在心肌细胞培养液中加入0.1 mmol/L 5'-溴脱氧尿苷，以抑制非心肌细胞增殖。然后换无血清培养液，72 h开始用于药物实验。
1.2 心肌细胞3H-亮氨酸掺入测定
调细胞数密度0.3×109/L，接种于24孔培养板上，每孔1 mL。培养48 h后换为无血清培养基，培养24 h后加入0.037 MBq 3 H-亮氨酸及各种处理因子,继续培养48 h。收集细胞于玻璃纤维素膜上,以三氯乙酸固定,洗去游离的同位素标记物。滤膜烘干后置于含5 mL闪烁液的闪烁瓶中,以LS3801液体闪烁仪(Beckman)测定放射强度。
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1.3 免疫印迹法测定磷酸化MAPK蛋白表达[4]
各种干预因素处理不同时间后，去除心肌细胞培养瓶中液体，加入0.15 mL提取液,其组成为(mmol/L):β-磷酸甘油20，benzanidine 10，焦磷酸钠 50，NaF 50，NaCl 50，EDTA 5，EGTA 5，Na3VO4 0.2, HEPES 10 (pH7.4),PMSF 0.5，aprotinin 0.1，leupeptin 0.02，φ=0.1% Triton X-100，φ=0.3% β-巯基乙醇。收集细胞提取物，以低温高速离心机(Eppendorf 5417R型)4 ℃离心 (13 000 r/min,r=9.2 cm)，取上清液，按Bradford法测量蛋白浓度，调蛋白质量浓度至200 mg/L，进行SDS-PAGE电泳，电印迹转移法转至硝酸纤维素膜上，以含10 g/L牛血清白蛋白(BSA)的TBST溶液室温封闭1 h，分别与一抗(小鼠来源抗磷酸化MAPK单克隆抗体，1∶10 000稀释度)和二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG)室温各孵育1 h，与ECL试剂反应1 min，X线胶片压片曝光1 min，用IBAS图像处理系统对胶片扫描测定感光区带的感光密度，并进行积分处理。
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1.4 试 剂
小鼠来源磷酸化MAPK单克隆抗体(可与大鼠、人等种系动物发生免疫反应，Sigma目录号：M8159)、leupeptin、apoprotin、PMSF、蛋白激酶抑制肽(其氨基酸序列为：TTYADFIASGRRANAIHD)、AngⅡ均购自Sigma公司，化学发光增强剂(ECL)购自基因公司，其中含辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG，3H-亮氨酸购自北京原子能研究所，CV11974由日本爱媛大学小野知原教授惠赠，PD098059、胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司，其它试剂均为国产分析纯。
1.5 统计学处理
数据以均数±标准差(
±s)表示。进行秩和检验，P<0.05表示差异有显著性意义。, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 AngⅡ对蛋白质合成速率
在无血清培养液中，AngⅡ(0.01～1.00 μmol/L)剂量依赖性增加新生大鼠心肌细胞3H-亮氨酸掺入。以0.1 μmol/L作为AngⅡ的标准实验浓度。AngⅡ(0.1 μmol/L)处理心肌细胞48 h，可使3H-亮氨酸掺入明显增加，该作用可被AT1受体阻断剂(CV11974，为TCV-116活性代谢产物，终浓度1 μmol/L)明显抑制(抑制85%),而MAPK激酶(MEK)特异性抑制剂PD098059(50 μmol/L)可部分抑制该反应(抑制32.5%)。以上结果表明AngⅡ主要通过AT1受体介导心肌肥大反应，抑制MAPK的激活可减轻但不能完全取消AngⅡ介导的心肌肥大反应(图1，2)。
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图1 不同浓度AngⅡ对培养的新生大鼠心肌细胞3H-
亮氨酸掺入的影响
Fig.1 Effects of angiotensin Ⅱ on the surface area,3H-leucine incorporation and protein content
in the cultured neonatal rat cardio myocyte
图2 CV11974及PD098059对AngⅡ促进培养新生大鼠
心肌细胞3H-亮氨酸掺入的影响
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Fig.2 Effects of CV11974 and PD098059 on promotion of
3H-leucine incorporation in cultured neonatal rat cardio myocyte induced by angiotensin Ⅱ(0.1 μmol/L)
*P<0.05,* *P<0.01 compared with control; #P<0.05, # #P<0.01 compared with AngⅡ
2.2 AngⅡ诱导磷酸化MAPK蛋白表达的受体途径及时相关系
以针对磷酸化p44MAPK和p42MAPK两个同型体的MAPK单克隆抗体对SDS-PAGE电泳结果进行免疫分析，结果显示新生大鼠心肌细胞中MAPK这两个同型体皆有表达。AngⅡ处理心肌细胞5 min磷酸化MAPK蛋白(p44MAPK及p42MAPK)表达即开始增加，30 min左右达到高峰，提示MAPK磷酸化激活，2 h磷酸化MAPK蛋白表达基本恢复正常。AT1拮抗剂CV11974(0.1 mmol/L)或MAPK激酶(MEK)特异性抑制剂PD098059(50 μmol/L)可明显抑制AngⅡ介导的磷酸化MAPK蛋白表达(30 min时分别下降89%及81%)，提示同介导心肌细胞肥大反应相似，AngⅡ激活MAPK亦主要通过AT1受体，抑制MAPK上游激酶MEK可明显抑制磷酸化MAPK蛋白表达(图3，4)。
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图3 CV11974及PD098059对AngⅡ激活MAPK的影响
Fig.3 Effects of CV11974 and PD098059 on mitogen-
activated protein kinase activity stimulated
by angiotensin Ⅱ(0.1 μmol/L)
*P<0.05,* *P<0.01 compared with control; #P<0.05, # #P<0.01 compared with AngⅡ
图4 AngⅡ诱导磷酸化MAPK蛋白表达的时相关系
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Fig.4 Time caurse of phosphorylated mitogen-activated
protein kinase protein expression induced
by angiotensin Ⅱ
*P<0.05,* *P<0.01 compared with control
3 讨 论
本研究表明，AngⅡ可剂量依赖性的诱导培养的新生大鼠心肌细胞的肥大反应及MAPK激活，这种作用主要通过AT1受体介导。抑制MAPK的激活可减轻但不能完全取消AngⅡ介导的心肌肥大反应，提示MAPK通路是AngⅡ介导的心肌肥大反应信号途径之一。
, http://www.100md.com 近年，人们对AngⅡ作用的细胞内信号机制进行了广泛的研究；特别是蛋白激酶作为细胞内信号传递的重要组成部分，在AngⅡ介导的心肌肥大中的作用更受到人们广泛关注。MAPK是20世纪90年代以来发现的最重要的生长信号调节蛋白，其在细胞信号传导方面有两个重要特征[5,6]：①活化的MAPK通过转位方式进入细胞核，激活其下游底物，主要是一些编码核转录因子的早反应基因(如原癌基因c-fos、c-myc、c-jun 和Erg-1等)表达，调控细胞生长反应，导致次级反应基因(如ANF基因、β-MHC基因、MLC-2基因等)的异常表达，影响细胞的功能；②MAPK可将多个不同受体系统(如G-蛋白耦联受体和蛋白酪氨酸激酶受体)介导的信号加以整合，起着多种信号的交汇点或共同通路的作用[7，8]。AngⅡ作为一种重要的致心肌肥大因子，对MAPK信号途径的逐级激活可能是其导致心肌肥大的重要机制[9]。但是激活的MAPK很快被细胞内的磷酸酶去磷酸化而失活，因此，MAPK的激活可能只作为心肌肥大反应的启动信号。有多种可能导致MAPK磷酸化位点去磷酸化的磷酸酶，其中较为重要的包括MKP-1和钙调蛋白磷酸酶(calcineurin)，我们的相关研究提示在心肌细胞，MKP-1是失活MAPK的主要磷酸酶，即MAPK活性受其上游MAPK激酶及其下游MAPK磷酸酶的双重调控。本研究发现抑制MAPK的激活可减轻但不能完全取消AngⅡ介导的心肌肥大反应，提示除MAPK信号途径外，尚可能存在其它介导AngⅡ致心肌肥大反应的信号通路。我们既往研究观察到AngⅡ介导的心肌肥大反应时可导致细胞内钙浓度增加，钙-钙调蛋白信号通路可能也与AngⅡ介导的心肌肥大反应有关[9,10]。
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本实验结果证明MAPK激活是AngⅡ介导心肌肥大反应的重要环节，但MAPK信号通路可能不是AngⅡ介导的心肌肥大反应唯一信号途径，深入探讨心肌肥大的细胞内信号机制，将为研究心肌肥大的发生和逆转机制提供重要的思路和线索。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870888)
作者简介：刘培庆(1964-)，男，山东泰安人，博士，副教授.
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收稿日期：2000-04-17, 百拇医药