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编号:10504718
肝树突状细胞与骨髓树突状细胞体外生物免疫特性的比较研究
http://www.100md.com 《解剖学报》 2000年第0期
     作者:傅继东 钟翠平 王国强 范强 顾云娣 张新华

    单位:上海医科大学组织学胚胎学教研室,200032

    关键词:肝脏;树突状细胞;免疫耐受

    解剖学报00zk21

    【摘要】目的 探讨肝树突状细胞(hepatic dendritic cell, HDC)的 生 物免疫功能及在肝移植耐受中的作用。 方法 分别从肝脏和骨髓分离、 培养DC,以免疫组织化学及 流式细胞术检测两种DC生物特性及免疫活性的差异。 结果 培养6~8d, 骨髓DC (BM-DC)有大 量细胞从集落中释放,并呈成熟状态,细胞表面组织相容性抗原MHC class I、 MHC class II及共刺激分子CD80(B7-1)、CD86(B7-2)都有较高水平表述,混合淋巴细胞反应(MLR)中 表现出有强烈刺激 T 细胞增生的能力;而同时期的 HDC 具有非成熟 DC 的形态及功能特征 ,表面分子表达很低,无刺激 T 细胞增生的能力。 结论 实验结果提示 HDC 具有 BM-DC不同的生物特性可能是产生肝脏移植受特性的一个重要原因。
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    【中图分类号】R392.4 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)增-81

    In vitro COMPARATIVE RESEARCH OF DENDRITIC CELLS DERIVED FROM LIVER AND BONE MARROW

    FU Ji-dong,ZHONG Cui-ping*, WANG Guo-qiang, FAN Qiang,GU Y un-di,ZHANG Xin-hua

    (Department of Histology and Embryology, Shanghai Medical University,Sh anghai 200032, China)

    【Abstract】Objective To investigate the biological character istics of hepatic de ndritic cell(HDC) and its functions in the immune tolerance of hepatic allograft s. Methods DC progenitors were respectively isolated from liver and bone marrow o f C57BL/6 J mice, and were propagated in liquid culture with GM-CSF. The immune fu nction was detected by using immunochemical staining, FCM and MLR. Resu lts Afte r 6-8 days' culture, most BM-DC released from proliferating aggregates. They e xp ressed high level MHC classⅡ and costimulating molecules CD80 (B7-1),CD86(B7- 2),and the ability for strongly stimulating T cell proliferation, which showed the stro ng mature features. But HDC expressed lower level of those molecules, and failed in inducing primary allogeneic responses of naive T cells, Conclusion These obs ervations demonstrated that liver-derived DCs have the bio-function of immatur e DC, which may contribute to the immune tolerance of hepatic allografts.
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    【Key words】Liver; Dendritic cell (DC); Immune tolerance 肝脏因其固有的移植耐受性而在免疫耐受研究中受到关注,肝移植物容易形成耐受,肝移植术的成功率也很高,据美国 Vichow 医院 1993 年统计,其452 例肝移植的1年、5年生存率分别为90.2%和82.8%。不仅如此,伴有肝移植的其他器官(如心脏、肾脏等)移植存活时间也较其单独移植明显延长。另外通过肠吸收或门静脉注射的抗原同样易形成免疫耐受,这表明肝脏有其独特的免疫耐受性。

    最近美国彼兹堡大学的 Thomson 和 Lu [1]提出在肝移植耐受中树突状细胞(dendritic cell, DC) 可能起关健作用,输入肝脏来源的树实状细胞 (hepatic dendritic cell, HDC)能延长移植物的存活期,而输入骨髓来源的 DC (BM-DC) 则无此效果[1]。又有人提出 HDC 诱导T 细胞分泌 Th2 型细胞因子 IL-4、IL-10,而 BM-DC 诱导 T 细胞分泌 IFN-r等 Th1 型细胞因子[2]。那么这两种细胞的生物特性之间存在什么样的差异?为此,我们将两种来源的DC在相同条件下进行体外培养,对两种 DC 的生长发育、生物学特征及免疫学功能进行初步探讨。
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    材料和方法

    1.动物

    8~10周 C57BL/6J 小鼠(H-2Kb,I-Ab,I-E-),C3H/HeJ 小鼠(H-2Kk,I-Ak,I-Ek)购自中国科学院动物中心上海分中心。

    2.材料

    前灌流液(Hanks 液含肝素 500IU/100ml)、PBS液、DBS液、PBA(PBS+0.1%叠氮钠+2%小牛血清,pH为7.2)。RPMI 1640 完全培养基:由 RPMI 1640 干粉 10.4g/L(购自 GIBCOL公司)、HEPES 2×10-2mol/L、L-谷氨酰胺2×10-3mol/L、2-巯基乙醇0.05mol/L、非必需氨基酸0.1mol/L、丙铜酸钠1mol/L、双抗(青霉素100IU/ml、链霉素0.1g/L)和10%灭活的胎牛血清(购自GIBCOL 公司)构成。细胞分离液 Percoll 购自 Pharmacia 公司,鼠重组 GM-CSF(mrGM-CSF)为 GIBCOL 公司产品,IV胶原酶为 Sigma 公司产品。丝裂霉素C为日本 Kogyo 公司产品,3H-TdR为上海原子核研究所产品。大鼠抗小鼠 H-2b、I-Ab、B7-1、B7-2等单抗、羊抗大鼠二抗及 StrepAvidin-Cy3、FITC标记的羊抗大鼠二抗购自Pharmingen 公司。
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    3.DC的分离、培养

    3.1 HDC 的分离、培养:C57BL/6J 雌性小鼠50只,戊巴比妥钠麻醉,无菌开腹,门静脉插管。两步法灌流后取材[3],放入0.05%的IV胶原酶液中体外消化30min。尼龙网过滤,用DBS液清洗两次,稀释成4~5ml细胞悬液。用细胞分离液 Percoll 不连续密度梯度离心后,吸取两液体界面的肝非实质细胞,清洗两次,调整细胞浓度为2.5×106/ml,接种于24孔培养板,每孔1ml,加 mrGM-CSF 20μg/L,隔天筛选换液。

    3.2 BM-DC 的分离、培养:C57BL/6J 雌性小鼠50只,颈椎脱臼处死,无菌取双侧股骨和胫骨,用 Hanks 液冲洗出骨髓,制成细胞悬液,清洗后破血去红细胞膜,用RPMI 1640 完全培液调整细胞浓度为 2×106/ml[4],接种于24孔培样板,每孔1ml,加入细胞因子 mrGM-CSF 20μg/L 隔天筛选换液。
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    分别在不同天数收取以上两种细胞,制成细胞甩片或细胞涂片,-20℃保存备用,并作部分 Gimesa 染色片。

    4. T细胞的分离及与DC的混合培养

    取C3H/HeJ 雌性小鼠6只,无菌开腹取脾细胞,清洗破血去红细胞膜后,制成 1ml 细胞悬液,尼龙毛柱分离 T细胞,调整细胞浓度至2×106/ml备用。

    收集培养4、7、10d的BM-DC与HDC,丝裂霉素 C 处理后 (25g/L,37℃水浴 30min),1640洗3次,调整细胞浓度为2×105/ml备用。取DC和T细胞各0.1ml,加入96孔培养板作混合培养,同时设单一T细胞孔和单一DC孔作对照,培养72h。收集细胞前16h每孔加3H-TDR 0.5UCi,用多头细胞收集仪收集细胞至玻璃纤维膜上,烤干纤维膜,放入闪烁液中,用β液闪计数仪(Beckman LS 6500, USA)测 cpm 值。
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    5.细胞免疫组织化学检测细胞特性

    取-20℃冷藏细胞甩片或细胞涂片,复温后用冷丙酮固定10min,干燥后用0.01mol/L PBS洗两次,每次5min,按常规免疫组织化学染色方法依次用0.03%的H2O2、Avidin 液、Biotin 液、1%BSA 封闭;加一抗 H-2b、I-Ab、B7-1、B7-2 和相应 Biotin化的二抗,再加 ABC 复合物及 DAB 显色,以上各步骤间均以PBS液洗3次,最后脱水封片。每种一抗均以相应的同型(isotype)抗体染色作阴性对照。

    6.流式细胞仪(FCM)检测细胞表型

    收取培养7d的 BM-DC、HDC与培养10d的HDC 制成细胞悬液,每管细胞为0.5~1×106,加 Fc抗体 2μl(4℃,10min) 以去除非特异性荧光吸附;加单抗,室温避光孵育30min用PBA 洗液清洗;再加有荧光素标记的二抗(StrepAvidin-Cy3 或 FITC-IgG),室温避光染色30min,用PBA 洗液清洗2次,弃上清;加入0.5ml PBA 细胞洗液混匀,上机(FACS-Colibar, Becton Dickinson Oxnard, CA)检测。
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    结 果

    1.分离培养 DC的光镜观察

    每只小鼠能分离出骨髓细胞约3.5~4.0×107个,包括造血干细胞及内皮细胞、成纤维细胞等。经24h培养后,在贴壁细胞表面有许多集落出现,以粒细胞集落居多,48h后筛选吸弃悬浮的集落细胞,剩小部分半贴壁半悬浮的DC集落存在,到第4d时,此类半贴壁集落数量剧增,集落表面的细胞可见有长短不一的突起(图1)。继续培养至6~8d,集落丰富,并开始有大量细胞从集落中释放出来(图2),释放的细胞突起较长。细胞涂片 Gimesa 染色可见细胞核偏位,突起较多。

    每只小鼠从肝脏可分离得到约1.0~1.5×107个肝非实质细胞,细胞大小不一,类型较多。培养24~48h后,有大量贴壁细胞贴壁生长,少量HDC前体细胞半贴壁状散在分布,经筛选、扩增培养,第4d时 HDC 数量增多,但并未形成明显集落(图 3)。第7~8d,HDC 数量较多,并有部分细胞悬浮,悬浮细胞有小的突起,同时在此阶段细胞有一明显的增殖高峰,出现大量半贴壁半悬浮的集落,集落表面的细胞有小的突起(图 4)。第10d起,集落依然大量存在,并有部分细胞从集落上缓慢释放,细胞涂片 Gimesa 染色见细胞核偏位,胞质内有大量的囊泡结构。每只小鼠在第7~8d HDC 的得率约为 2~3×106个。
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    2.混合淋巴细胞增殖反应(MLR)

    培养第4d C57BL/6小鼠的 BM-DC 仅轻度促进 C3H 小鼠T细胞的增生,第7d BM-DC刺激 T 细胞增生的能力增强,刺激指数约为9~10;培养7d HDC 无刺激 T 细胞增生的能力,但培养第10d HDC 却表现出一定的刺激 T 细胞增生的能力(图5)。数据经 t 检验(P<0.05)有统计学意义。

    3.免疫组织化学染色

    第4d BM-DC仅MHC class Ⅱ和B7-2呈弱阳性,MHC class I 和 B7-1 呈阴性;第7d BM-DC的 MHC class Ⅱ、B7-2表达较高,呈强阳性(图6,7),MHC class I、B7-1表达较少,呈弱阳性。

, 百拇医药     图5 不同培养时间的 HDC 和 BM-DC刺激同种异体小鼠 T 细胞增生。

    Fig. 5 Allogenic T cell stimulatory function of HDC and BM-DC after different culturing time.

    图10 流式细胞术检测 BM-DC、HDC 细胞表面分子表达。

    Fig.10 The expression of molecules on BM-DC and HDC detected by FCM.

    7d HDC(HDC)表面分子的免疫组织化学染色几乎呈阴性,MHC class Ⅱ、B7-2 呈非常弱的阳性(图8);第10d HDC 的 MHC class Ⅱ、B7-2呈阳性染色(图9),而MHC class I、B7-1 仍呈阴性染色。
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    4.流式细胞仪检测

    用流式细胞仪定量检测细胞表面分子,见培养第7d的BM-DC MHC class II 和 B7-2 的表达升高明显,其单个细胞的荧光峰度右移;而同期 HDC 表面分子表达很低,但第 10 d HDC 表面分子表达有所升高(图 10)。

    讨 论

    自1993年 Inaba等用 GM-CSF 体外成功扩增 DC 以来,DC 的研究得到迅速发展。骨髓中造血干细胞接种培养后,在 GM-CSF 的作用下能向 DC 方向分化,经历了一个由未成熟向成熟 DC 发育的过程。早期未成熟 DC 的突起少, MHC 分子及共刺激分子 B7-1、B7-2的表达非常低,无刺激 T 细胞增生的能力。成熟后,细胞突起增多, MHC 分子及共刺激分子的表达明显升高,能强烈刺激 T 细胞的增生[4]。这与我们观察到的实验结果完全符合,即培养6~8d 后 BM-DC 已基本成熟。
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    分离得到的 HDC 前体细胞较少,DC 生长发育非常缓慢,开始时仅少量的 DC 前体细胞在贴壁细胞的表面散在分布。培养第 4d,HDC 前体细胞才开始出现小的集落。至第6~8d,HDC 前体细胞数量增多,并出现一增生高峰,有大量的半贴壁半悬浮集落生成;少量悬浮细胞有小的突起。此时 HDC 细胞表面分子 MHC class I、II和共刺激分子 B7-1、B7-2的表达都极低,几乎没有刺激同种异体T细胞增生的能力。这种 DC 的生物免疫特性与未成熟 DC 非常相似,可能是诱导 T 细胞甚至凋亡的原因,也就是肝脏的免疫耐受特性的主要原因,此结果也与国外相关研究结果相一致[2,3]

    肝脏含多种类型非实质细胞,能分泌多种生长因子,包括 IL-10、TGF-β等抑制因子,抑制DC 的成熟及其抗原呈递的功能,从而达到抑制特定免疫反应的效果[5]。我们用粉碎肝细胞得到的蛋白粗提物刺激第 4d BM-DC 时,加粗提物的 BM-DC 细胞表面分子的表达反而呈现下降趋势(数据未列出)。这提示肝脏内确实存在影响 DC 成熟分化的因素,这些因素可能是导致 HDC 与 BM-DC 免疫活性差异的原因。
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    人们研究发现 DC 在与 T 细胞的作用过程中可能存在不同的亚型,即DC1与DC2。DC1促进 TH1 的生长分化, DC2则诱导 T 细胞向 Th2 方向分化,并抑制 Th1的分化,但两种DC都有很强的刺激同种异体 T 细胞增生的能力[6]。最近 Khanna 等[2]提出 HDC 在体内、体外都能诱导 T 细胞分泌 Th2 型细胞因子。由此我们推测 HDC 在某一生长阶段也能促进 T 细胞的增生。在培养中我们发现;在第7~8d的增生高峰期,HDC 有丰富的半贴壁集落生成;并且从第10d起开始有部分细胞从集落中释放出来。此时 HDC 细胞表面分子表达有一定程度的升高,以 MHC class II 和 B7-2为明显,并且其刺激 T 细胞增生的能力也有增强,或许此阶段的 HDC 就具备诱导 Th2 生长分化的能力。不过此时 HDC 在体外刺激增生的 T 细胞是否为 Th2 细胞还有待实验进一步证明。另外,体外与体内的环境存在较大的差异,尤其是培养10d后,早期贴壁生长的肝非实质细胞大量死亡,由它们分泌的细胞因子也大量减少,这也可能是 HDC 表面分子 MHC class II 和B7-2表达升高的原因之一。
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    图1 培养4d BM-DC,有细胞集落形成(↑),×100.

    图2 培养7d BM-DC,集落(↑)释放出大量悬浮细胞(*),×100

    图3 培养4d HDC,细胞增殖,开始形成小集落(↑),×200

    图4 培养7d HDC,增殖高峰期,有大量集落生成(↑),×100

    图6 培养7d BM-DC,MHC-II类分子免疫组织化学染色为强阳性(↑),×400

    图7 培养7d BM-DC,B7-2免疫组织化学染色呈强阳性(↑),×400

    图8 培养7d HDC,MHC-II免疫组织化学染色为弱阳性(↑),×400

, 百拇医药     图9 培养10d HDC,MHC-II 类分了免疫组织化学染色为阳性(↑),×400

    Fig.1 4 days' culture,with lots of BM-DC clusters(↑),×100

    Fig.2 7 days' culture,A large number of cells (*) were released from clusters(↑) ×100

    Fig.3 4 days culture,with small HDC clusters(↑) ×200

    Fig.4 7 days culture,show the strong proliferation of HDC with lots of clusters(↑)×100

    Fig.6 MHC class II immunochemical staining shows the Strong positive(↑)of BM-DC in 7 days culture×400
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    Fig.7 B7-2 immunochemical staining shows the strong positive(↑)of BM-DC in 7 days culture×400

    Fig.8 MHC class II immunochemical staining shows the weak positive(↑)of HDC in 7 days culture×400

    Fig.9 MHC class II immunochemical staining shows the positive(↑)of HDC in 10 days culture×400

    【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39770387)

    【作者简介】傅继东(1972-),男(汉族),江西省人,硕士研究生
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    参考文献

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    [2] Khanan A, Morelli A E, Zhong CP, et al. Effects of liver-derved de ndritic cell progenitors on Thl-and Th2 like cytokine responses in vitor and in vivo. The Journal of Immunology,2000,164(3):1346-1354.

    [3] Lu L, Woo J, Rao A S, et al. Propagation of dendritic cell progenit ors from n ormal mouse liver using granulocyte/macrophage colony-stimulating factor and th e ir maturational development in the presence of type-l collagen[J]. J Exp Med, 1994,179(6):1823-1834.
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    [4] Inaba K, Inaba M, Romani N, et al. Generation of large numb er of dendritic c ells from mouse bone marrow cultures supplemented with Granulocyte/Macrophage co lony-stimulating factor[J]. J Exp Med, 1992,176(6):1693-1702.

    [5] Smedt T D, Mechelen M V, Becker G D, et al. Effect of interleukin- 1 0 on dendritic cell maturation and function[J]. Eur, J Immunol,1997,27(5):1229 -1235.

    [6] Rissoan MC, Soumelis V,Kadowaki N,et al. Reciprocal control of T he lper cell and dendritic cell differentiation[J]. Science, 1999,283(5405):1183-1186 .

    【收稿日期】2000-07-06 【修回日期】2000-98-16, 百拇医药