原发性肝细胞癌中p21WAF1及p16INK4a的表达与HBV的关系
作者：张胜亮 张耀铮 高鹤立 李士军
单位：张胜亮 张耀铮 大连医科大学临床生化教研室(大连，116027)；高鹤立 李士军 大连医科大学附属第一医院(大连，116011)
关键词：肝肿瘤；抑制基因；组织化学
癌症99zk08
【摘要】目的：研究p21WAF1、p16INK4a及CDK4在以乙型肝炎病毒(HBV)感染为主要诱因的肝细胞癌(HCC)中的改变及变化机理。方法：利用免疫组织化学技术检测HCC中p21WAF1、p16INK4a及CDK4的蛋白表达；对HCC的实体瘤及血液进行HBV-DNA的PCR。结果：(1)p16INK4a蛋白在HCC中表达的阳性率为51.35%，p21WAF1蛋白的表达率为43.24%，而正常肝组织中为100%，两组均有显著差异(P>0.05)。结论：p16NK4a及p21WAF1蛋白的缺失与HCC的发生发展有关，与HBV的感染没有相关性。p16NK4a蛋白的缺失与HCC转移有关。
, http://www.100md.com
中图号：R735.7 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)s0-0023-04
p21WAF1 and p16NK4aprotein expression and their association
with HBV in hepatocellular carcinoma
ZHANG Sheng- liang， ZHANG Yao- zheng， GAO He- li,et al.
Department of Chinical Biochemistry,Dalian Medical University,Dalian 116027,P.R.China
【Abstract】 Objective： To study the relationship between p21WAF1、 p16NK4a、 cdk4 expression and hepatocarcinogenesis. Methods： Immunohistochemical staining was performed on specimens of HCC using antibodies against p21WAF1,p16NK4a,and cdk4.HBV- DNA was examined by PCR in HCC-s serum and liver tissues. Result： (1)p16NK4a protein was expressed in 51.35% of HCCs and 100% of normal liver tissues.p21WAF1protein was expressed in 43.24% of HCCs and 100% of normal livers.The two protein expressions in HCC were lower than that of normal liver specimens(P<0.05).p16NK4a protein was expressed in 23.08% of HCCs with metastasis and 71.43% of HCCs without HBV infection(P<0.05)..(2) p16NK4a protein was detcted in 53.57% of HCC with HBV infection ,and 33.33% in HCC without HBV infectionThe positive incidence of p21WAF1 protein expression was 50% in HCC with HBV infection,and 33.33% in HCC without HBV infection(P >0.05). Conclusion： (1)The deletion of p16NK4a protein and p21WAF1 protein is related to the hepatocarcinogenesis,moreover,p16NK4a protein-negative HCC may be associated with metastasis.(2) There is no relationship between the deletion of p16NK4a and p21WAF1 protein in HCC with HBV infection.
, 百拇医药
Key words： liver neoplasmas； suppressor genes； Histochemistry
p21WAF1、p16INK4a及CDK4是细胞周期中G1/S期密切相关的三个调节因子。p21WAF1及p16INK4a是CDKI家族两个代表性的抑癌基因，对细胞周期进行负性调控。p21WAF1及p16INK4a表达异常时可使细胞在G1/S点失去限制，细胞无限制的生长，易形成肿瘤细胞〔1〕。CDK4作为p16INK4a及p21WAF1以及cyclinD1的竞争底物，其表达水平及活性对细胞周期的调控起重要作用〔2〕。然而，三者在原发性肝细胞癌中表达的研究较少，因此研究HCC中三者的变化对阐明HCC癌变在G1/S改变机制具有重要意义。
1材料与方法
, 百拇医药
1.1检测标本
37例HCC患者肝癌组织均取自1993～1998年间大连医科大学附属一、二院外科手术病人(其中13例同时留取血清)。所有病例均经临床病理确诊为HCC，其中13例出现肝内及肝外癌转移(肝肿瘤转移至肺、膈肌、大网膜等肝外组织和器官)，14例HCC明确未转移，10例病历不详。13例非肝癌的肝组织取自肝血管瘤及意外死亡尸检肝组织，显微镜下确认无HCC。37例HCC和13例正常肝组织检测了p16INK4a及p21WAF1蛋白，其中13例HCC及5例正常肝组织检测CDK4蛋白。
1.2方法
1.2.1免疫组织化学：所有组织均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4μm连续切片。切片常规脱蜡水化，然后按SP免疫组化染色试剂盒(ZYMED公司)说明进行。p16抗人多克隆抗体(C-20，SantaCruz)稀释度为1∶50、p21WAF1抗人单克隆抗体(C-22，购自SantaCruz)稀释度为1∶100、CDK4抗人抗鼠多克隆抗体(C-22，购自SantaCruz)稀释度为1∶100。每批实验均设阳性及阴性(以PBS代替一抗)对照。p16INK4a、CDK4蛋白反应阳性以细胞核和/或浆出现明显的棕黄色为其蛋白表达阳性细胞，阳性细胞数≥10%为阳性标本。p21WAF1蛋白反应阳性以细胞核出现明显的棕黄色为p21WAF1蛋白表达阳性细胞，阳性细胞数≥5%为p21WAF1蛋白反应阳性标本。
, 百拇医药
1.2.2HBVDNA的PCR检测：组织DNA提取按照文献〔3〕进行。血清HBV-DNA提取及HBVDNA的PCR扩增按照试剂盒(购自伊力康公司)进行。HBVDNAPCR扩增：反应液与Taq酶40∶1混匀，取20μl加入4μl血清或4μl组织DNA(适当稀释)。93℃2分钟，然后按93℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，35个循环，最后72℃延伸5分钟，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，在398bp处出现亮色带为HBV阳性。
1.2.3统计学处理：采用χ2检验，四格表确切概率法
2结果
2.1 p21WAF1、p16INK4a及CDK4蛋白在HCC和正常肝组织中的表达(见表1)
表1 p21WAF1、p16INK4a及CDK4蛋白在肝组织的表达(%)
, 百拇医药
项目
n
p16INK4a
p21WAF1
n
CDK4
+
-
+
-
+
-
HCC
, 百拇医药
37
19(51.35)
18
16(43.24)
21
16
13(81.25)
3
有转移
13
3(23.08)
10
5(38.46)
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8
9
7(77.77)
2
无转移
14
10(71.43)
4
6(42.86)
8
7
6(85.71)
1
, http://www.100md.com
不明确转移
10
6(60)
4
5(50)
5
0
0
0
正常肝组织
13
13(100)
0
, 百拇医药
13(100)
0
5
4(80)
1
表1经统计学处理，p16INK4a及p21WAF1在HCC及正常肝组织中表达均有显著差异(P<0.05)。p16INK4a蛋白在有转移的HCC中的表达明显低于无转移的HCC(P〈0.05)。
p16INK4a蛋白在肝组织中可位于细胞核和/或浆中，弥漫地分布于肝组织中(见图1)；而p21WAF1蛋白在肝细胞中多以细胞核为阳性表达(见图2)，HCC中多位于细胞核和/或浆中。正常肝组织中p21WAF1阳性细胞散在分布，多位于汇管区。p21WAF1及p16INK4a蛋白在癌旁组织的表达强度明显高于在癌组织中的表达(见图1)。CDK4也以核或/和浆表达为主(见图3)，在HCC和癌旁肝组织中的显色无明显差别。
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图1 p16INK4a蛋白在肝细胞癌中的表达(SP染色，×100)图中可见p16INK4a蛋白表达为核/浆型，p16INK4a蛋白在癌旁组织中的表达明显高于癌组织所示
图2 p21WAF1蛋白在正常肝组织中的表达(SP染色，×400)图中箭头所示p21WAF1蛋白表达为核型
图3 CDK4蛋白在肝细胞癌中的表达(SP染色，×400)图中可见CDK4蛋白表达为核/浆型
2.2 p21WAF1与p16INK4a蛋白在肝细胞癌中的表达的相关关系
, 百拇医药
对37例HCC同时进行p21WAF1及p16INK4a蛋白免疫组化分析，其结果见表2。经统计学分析，HCC中p21WAF1蛋白表达与p16INK4a蛋白表达之间没有相关性(P>0.05)。
表2 p21WAF1及p16INK4a蛋白在肝细胞癌中表达的相关关系(%)
项目
n
p16INK4a蛋白
P值
+
-
, 百拇医药
p21WAF1蛋白阳性
16
9(56.25)
7
P>0.05
p21WAF1蛋白阴性
21
10(47.62)
11
合计
37
19(51.35)
, 百拇医药
18
2.3 HCC血清及肝组织标本中HBV DNA的检测
肝癌组织中HBVDNA阳性率为84.62%(11/13)，血清HBV DNA阳性率为38.46%(5/13)，两组之间无显著性差异(P>0.05)。11例HCC血清HBsAg及HBeAg阳性，其肝组织HBVDNA均阳性。其中血清HBVDNA阳性5例。
2.4HCC中p21WAF1及p16INK4a表达与HBV感染的关系(见表3)
表3 HCC中p21WAF1及p16INK4a表达与HBV的关系(%)
项目
n
, 百拇医药
p16INK4a蛋白
p21WAF1蛋白
+
-
+
-
HBV感染
阳性
28
15(53.57)
13
14(50.00)
, 百拇医药
14
阴性
6
3(50.00)
3
2(33.33)
4
合计
34
18(52.94)
16
16(47.06)
18
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血HBV-DNA
阳性
5
2(40)
3
1(20)
4
阴性
6
1(16.67)
5
2(33.33)
4
, 百拇医药
合计
11
3(27.27)
8
3(27.27)
8
注：HBV感染是指HBV任一免疫复合物阳性，11例检测血清HBV-DNA的HCC患者肝组织中均检测到HBV-DNA。
3讨论
细胞周期的调控失衡是癌变的一个作用机制，其中G1/S期的转换是细胞周期中比较敏感的时期，易受内外因素的影响，导致细胞周期的改变，决定细胞继续进行增殖还是退出细胞周期〔4〕。细胞周期素(Cyclin)、细胞周期素依赖激酶(CDKs)以及细胞周期素依赖激酶抑制因子(CDKⅠs)之间的平衡是细胞周期正常进行的基础。
, 百拇医药
p16INK4a在大量的肿瘤细胞系存在基因的各种改变，这种改变可能导致蛋白的变化〔5〕。利用免疫组化技术对其基因表达产物蛋白质进行检测可以总体上了解其与HCC的关系。实验发现p16INK4a蛋白在HCC中的阳性率为51.35%，与正常肝组织比较，有显著差异(P<0.05)(见表1)，提示p16INK4a蛋白的缺失可能与肝癌的发生发展有关。这种变化可能影响肿瘤的生物学行为。在我们研究的27例HCC中13例出现了肝外及肝内转移，其p16INK4a蛋白缺失率为76.92%(10/13)，明显高于未转移HCC中p16INK4a蛋白缺失率(28.57%)(P<0.05)，提示p16INK4a蛋白缺失与HCC的转移有一定的相关性。
p21WAF1在许多肿瘤中没有发现基因结构的改变，在肿瘤中的失活可能与p53等其他调节因素有关〔6〕。而p53在HCC中有较高的突变率〔7〕，这种改变可能降低p21WAF1的表达。我们的实验显示5656%的HCC有p21WAF1蛋白缺失。HUI〔8〕发现38.1%HCC的p21WAF1mRNA表达降低，我们的结果与此较为相似，说明p21WAF1蛋白的改变与HCC的发生有关。而p21WAF1的蛋白缺失与肝癌转移我们没有发现相关性(见表1)。
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p21WAF1和/或p16INK4a蛋白在HCC中的总缺失率为75.68%(28/37)。在肝癌转移的患者中，p16INK4a和/或p21WAF1蛋白的缺失率为100%(13/13)，而未转移HCC中两者的总缺失率为6429%，提示CDKI的失活对于肿瘤的进展及预后有关。而p21WAF1及p16INK4a蛋白表达之间不存在相关性(P>005)，两者可能各自独立的参与了肝细胞的癌变。我们的实验同时显示CDK4在HCC及正常肝组织中蛋白表达没有明显差异(见表1)，由于病例有限，有待进一步研究。实验可能提示在HCC癌变的过程中，CDK4的蛋白表达可能不是起主要作用，其作用的发挥可能与p16INK4a及p21WAF1蛋白的缺失有关。
HUI〔9〕及Chaubert〔10〕均发现在HBV感染的HCC中存在p16INK4a的蛋白及基因的改变，似乎HCC中p16INK4a的失活与HBV有关。然而我们没有发现HCC中p21WAF1及p16INK4a表达与HBV有相关性(P>0.05，见表3)。HBV在肝内可以游离及整合的形式存在，HBV-DNA与宿主基因结合，病毒复制减弱。〔11〕血清中HBV-DNA的PCR检测可以灵敏的反映病毒的复制。我们发现HBV在血清与组织中的表达不同。5例血清HBV-DNA阳性，说明有HBV的复制，p16INK4a蛋白表达率为40%。6例HCC的HBV-DNA血清表现阴性可能是由于HBVDNA的整合等因素引起病毒复制减弱，p16INK4a蛋白表达率为16.67%，低于其他组。p21WAF1蛋白阳性率在两组表达较一致(见表3)。是否p16INK4a蛋白表达与HBV存在的形式有关有待进一步研究。
, 百拇医药
〔参考文献〕
1 Xiong Y.Why are there so many CDK inhibitors〔J〕?Biochemica et Biophscia Acta,1996,1288:01.
2 Hunter T,Pines J.Cyclins and Cancer Ⅱ：CyclinD and CDK inhibitors come of Age〔J〕 .Cell,1994,79:573.
3 卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术〔M〕.第一版.北京：高等教育出版社，193：102.
4 Charles J.Sherr.Cancer cell cycles〔J〕.Science,1996,274:1672.
5 Yang R,Gombart AF,Serrano M,et al.Mutational effects on the p16INK4a tumor suppressor protein〔J〕.Cancer Research,1995,55:2503.
, 百拇医药
6 EI-Deiry WS,Harper JW,O’connor PM,etal.Induction of WAF1/CIP by a p53 independent pathway〔J〕.Cancer Research,1994,54:3391.
7 Henkler F,Waseem N,Golding MHC,et al.Mutant p53 but not Hepatitis B virus X protein is present in hepatitis B virus related human hepatocellular carcinoma〔J〕 .Cancer Research,1995;55:6084.
8 HUI AM,Kanai Y,Sakamoto M,et al.Reduced p21WAF1 expression and p53 mutation in hepatocellular carcinomas〔J〕.Hepatology,1997,25:575.
, 百拇医药
9 HUI AM,Kanai Y,Sakamoto M,et al.Inactivation of p16INK4a in hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepatology,1996,24:575.
10 Chaubert P,Gayer R,Zimmermann A,et al.Germ line mutation of p16INK4a(MTS1)gene occur in a subset of patients with hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepatology,1997,25:
1376.
11 周金莲，梁英锐，冯德云，等.肝癌及癌旁组织HBVDNA原位杂交HBsAg免疫组织化学双标记研究〔J〕.中华病理学杂志，1995，24：18.
收稿日期：1998-11-17;修回日期：1999-01-12, 百拇医药
单位：张胜亮 张耀铮 大连医科大学临床生化教研室(大连，116027)；高鹤立 李士军 大连医科大学附属第一医院(大连，116011)
关键词：肝肿瘤；抑制基因；组织化学
癌症99zk08
【摘要】目的：研究p21WAF1、p16INK4a及CDK4在以乙型肝炎病毒(HBV)感染为主要诱因的肝细胞癌(HCC)中的改变及变化机理。方法：利用免疫组织化学技术检测HCC中p21WAF1、p16INK4a及CDK4的蛋白表达；对HCC的实体瘤及血液进行HBV-DNA的PCR。结果：(1)p16INK4a蛋白在HCC中表达的阳性率为51.35%，p21WAF1蛋白的表达率为43.24%，而正常肝组织中为100%，两组均有显著差异(P>0.05)。结论：p16NK4a及p21WAF1蛋白的缺失与HCC的发生发展有关，与HBV的感染没有相关性。p16NK4a蛋白的缺失与HCC转移有关。
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中图号：R735.7 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)s0-0023-04
p21WAF1 and p16NK4aprotein expression and their association
with HBV in hepatocellular carcinoma
ZHANG Sheng- liang， ZHANG Yao- zheng， GAO He- li,et al.
Department of Chinical Biochemistry,Dalian Medical University,Dalian 116027,P.R.China
【Abstract】 Objective： To study the relationship between p21WAF1、 p16NK4a、 cdk4 expression and hepatocarcinogenesis. Methods： Immunohistochemical staining was performed on specimens of HCC using antibodies against p21WAF1,p16NK4a,and cdk4.HBV- DNA was examined by PCR in HCC-s serum and liver tissues. Result： (1)p16NK4a protein was expressed in 51.35% of HCCs and 100% of normal liver tissues.p21WAF1protein was expressed in 43.24% of HCCs and 100% of normal livers.The two protein expressions in HCC were lower than that of normal liver specimens(P<0.05).p16NK4a protein was expressed in 23.08% of HCCs with metastasis and 71.43% of HCCs without HBV infection(P<0.05)..(2) p16NK4a protein was detcted in 53.57% of HCC with HBV infection ,and 33.33% in HCC without HBV infectionThe positive incidence of p21WAF1 protein expression was 50% in HCC with HBV infection,and 33.33% in HCC without HBV infection(P >0.05). Conclusion： (1)The deletion of p16NK4a protein and p21WAF1 protein is related to the hepatocarcinogenesis,moreover,p16NK4a protein-negative HCC may be associated with metastasis.(2) There is no relationship between the deletion of p16NK4a and p21WAF1 protein in HCC with HBV infection.
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Key words： liver neoplasmas； suppressor genes； Histochemistry
p21WAF1、p16INK4a及CDK4是细胞周期中G1/S期密切相关的三个调节因子。p21WAF1及p16INK4a是CDKI家族两个代表性的抑癌基因，对细胞周期进行负性调控。p21WAF1及p16INK4a表达异常时可使细胞在G1/S点失去限制，细胞无限制的生长，易形成肿瘤细胞〔1〕。CDK4作为p16INK4a及p21WAF1以及cyclinD1的竞争底物，其表达水平及活性对细胞周期的调控起重要作用〔2〕。然而，三者在原发性肝细胞癌中表达的研究较少，因此研究HCC中三者的变化对阐明HCC癌变在G1/S改变机制具有重要意义。
1材料与方法
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1.1检测标本
37例HCC患者肝癌组织均取自1993～1998年间大连医科大学附属一、二院外科手术病人(其中13例同时留取血清)。所有病例均经临床病理确诊为HCC，其中13例出现肝内及肝外癌转移(肝肿瘤转移至肺、膈肌、大网膜等肝外组织和器官)，14例HCC明确未转移，10例病历不详。13例非肝癌的肝组织取自肝血管瘤及意外死亡尸检肝组织，显微镜下确认无HCC。37例HCC和13例正常肝组织检测了p16INK4a及p21WAF1蛋白，其中13例HCC及5例正常肝组织检测CDK4蛋白。
1.2方法
1.2.1免疫组织化学：所有组织均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4μm连续切片。切片常规脱蜡水化，然后按SP免疫组化染色试剂盒(ZYMED公司)说明进行。p16抗人多克隆抗体(C-20，SantaCruz)稀释度为1∶50、p21WAF1抗人单克隆抗体(C-22，购自SantaCruz)稀释度为1∶100、CDK4抗人抗鼠多克隆抗体(C-22，购自SantaCruz)稀释度为1∶100。每批实验均设阳性及阴性(以PBS代替一抗)对照。p16INK4a、CDK4蛋白反应阳性以细胞核和/或浆出现明显的棕黄色为其蛋白表达阳性细胞，阳性细胞数≥10%为阳性标本。p21WAF1蛋白反应阳性以细胞核出现明显的棕黄色为p21WAF1蛋白表达阳性细胞，阳性细胞数≥5%为p21WAF1蛋白反应阳性标本。
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1.2.2HBVDNA的PCR检测：组织DNA提取按照文献〔3〕进行。血清HBV-DNA提取及HBVDNA的PCR扩增按照试剂盒(购自伊力康公司)进行。HBVDNAPCR扩增：反应液与Taq酶40∶1混匀，取20μl加入4μl血清或4μl组织DNA(适当稀释)。93℃2分钟，然后按93℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，35个循环，最后72℃延伸5分钟，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，在398bp处出现亮色带为HBV阳性。
1.2.3统计学处理：采用χ2检验，四格表确切概率法
2结果
2.1 p21WAF1、p16INK4a及CDK4蛋白在HCC和正常肝组织中的表达(见表1)
表1 p21WAF1、p16INK4a及CDK4蛋白在肝组织的表达(%)
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项目
n
p16INK4a
p21WAF1
n
CDK4
+
-
+
-
+
-
HCC
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37
19(51.35)
18
16(43.24)
21
16
13(81.25)
3
有转移
13
3(23.08)
10
5(38.46)
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9
7(77.77)
2
无转移
14
10(71.43)
4
6(42.86)
8
7
6(85.71)
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不明确转移
10
6(60)
4
5(50)
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0
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正常肝组织
13
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0
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1
表1经统计学处理，p16INK4a及p21WAF1在HCC及正常肝组织中表达均有显著差异(P<0.05)。p16INK4a蛋白在有转移的HCC中的表达明显低于无转移的HCC(P〈0.05)。
p16INK4a蛋白在肝组织中可位于细胞核和/或浆中，弥漫地分布于肝组织中(见图1)；而p21WAF1蛋白在肝细胞中多以细胞核为阳性表达(见图2)，HCC中多位于细胞核和/或浆中。正常肝组织中p21WAF1阳性细胞散在分布，多位于汇管区。p21WAF1及p16INK4a蛋白在癌旁组织的表达强度明显高于在癌组织中的表达(见图1)。CDK4也以核或/和浆表达为主(见图3)，在HCC和癌旁肝组织中的显色无明显差别。
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图1 p16INK4a蛋白在肝细胞癌中的表达(SP染色，×100)图中可见p16INK4a蛋白表达为核/浆型，p16INK4a蛋白在癌旁组织中的表达明显高于癌组织所示
图2 p21WAF1蛋白在正常肝组织中的表达(SP染色，×400)图中箭头所示p21WAF1蛋白表达为核型
图3 CDK4蛋白在肝细胞癌中的表达(SP染色，×400)图中可见CDK4蛋白表达为核/浆型
2.2 p21WAF1与p16INK4a蛋白在肝细胞癌中的表达的相关关系
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对37例HCC同时进行p21WAF1及p16INK4a蛋白免疫组化分析，其结果见表2。经统计学分析，HCC中p21WAF1蛋白表达与p16INK4a蛋白表达之间没有相关性(P>0.05)。
表2 p21WAF1及p16INK4a蛋白在肝细胞癌中表达的相关关系(%)
项目
n
p16INK4a蛋白
P值
+
-
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p21WAF1蛋白阳性
16
9(56.25)
7
P>0.05
p21WAF1蛋白阴性
21
10(47.62)
11
合计
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19(51.35)
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2.3 HCC血清及肝组织标本中HBV DNA的检测
肝癌组织中HBVDNA阳性率为84.62%(11/13)，血清HBV DNA阳性率为38.46%(5/13)，两组之间无显著性差异(P>0.05)。11例HCC血清HBsAg及HBeAg阳性，其肝组织HBVDNA均阳性。其中血清HBVDNA阳性5例。
2.4HCC中p21WAF1及p16INK4a表达与HBV感染的关系(见表3)
表3 HCC中p21WAF1及p16INK4a表达与HBV的关系(%)
项目
n
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p16INK4a蛋白
p21WAF1蛋白
+
-
+
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HBV感染
阳性
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15(53.57)
13
14(50.00)
, 百拇医药
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阴性
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3(50.00)
3
2(33.33)
4
合计
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18(52.94)
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血HBV-DNA
阳性
5
2(40)
3
1(20)
4
阴性
6
1(16.67)
5
2(33.33)
4
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合计
11
3(27.27)
8
3(27.27)
8
注：HBV感染是指HBV任一免疫复合物阳性，11例检测血清HBV-DNA的HCC患者肝组织中均检测到HBV-DNA。
3讨论
细胞周期的调控失衡是癌变的一个作用机制，其中G1/S期的转换是细胞周期中比较敏感的时期，易受内外因素的影响，导致细胞周期的改变，决定细胞继续进行增殖还是退出细胞周期〔4〕。细胞周期素(Cyclin)、细胞周期素依赖激酶(CDKs)以及细胞周期素依赖激酶抑制因子(CDKⅠs)之间的平衡是细胞周期正常进行的基础。
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p16INK4a在大量的肿瘤细胞系存在基因的各种改变，这种改变可能导致蛋白的变化〔5〕。利用免疫组化技术对其基因表达产物蛋白质进行检测可以总体上了解其与HCC的关系。实验发现p16INK4a蛋白在HCC中的阳性率为51.35%，与正常肝组织比较，有显著差异(P<0.05)(见表1)，提示p16INK4a蛋白的缺失可能与肝癌的发生发展有关。这种变化可能影响肿瘤的生物学行为。在我们研究的27例HCC中13例出现了肝外及肝内转移，其p16INK4a蛋白缺失率为76.92%(10/13)，明显高于未转移HCC中p16INK4a蛋白缺失率(28.57%)(P<0.05)，提示p16INK4a蛋白缺失与HCC的转移有一定的相关性。
p21WAF1在许多肿瘤中没有发现基因结构的改变，在肿瘤中的失活可能与p53等其他调节因素有关〔6〕。而p53在HCC中有较高的突变率〔7〕，这种改变可能降低p21WAF1的表达。我们的实验显示5656%的HCC有p21WAF1蛋白缺失。HUI〔8〕发现38.1%HCC的p21WAF1mRNA表达降低，我们的结果与此较为相似，说明p21WAF1蛋白的改变与HCC的发生有关。而p21WAF1的蛋白缺失与肝癌转移我们没有发现相关性(见表1)。
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p21WAF1和/或p16INK4a蛋白在HCC中的总缺失率为75.68%(28/37)。在肝癌转移的患者中，p16INK4a和/或p21WAF1蛋白的缺失率为100%(13/13)，而未转移HCC中两者的总缺失率为6429%，提示CDKI的失活对于肿瘤的进展及预后有关。而p21WAF1及p16INK4a蛋白表达之间不存在相关性(P>005)，两者可能各自独立的参与了肝细胞的癌变。我们的实验同时显示CDK4在HCC及正常肝组织中蛋白表达没有明显差异(见表1)，由于病例有限，有待进一步研究。实验可能提示在HCC癌变的过程中，CDK4的蛋白表达可能不是起主要作用，其作用的发挥可能与p16INK4a及p21WAF1蛋白的缺失有关。
HUI〔9〕及Chaubert〔10〕均发现在HBV感染的HCC中存在p16INK4a的蛋白及基因的改变，似乎HCC中p16INK4a的失活与HBV有关。然而我们没有发现HCC中p21WAF1及p16INK4a表达与HBV有相关性(P>0.05，见表3)。HBV在肝内可以游离及整合的形式存在，HBV-DNA与宿主基因结合，病毒复制减弱。〔11〕血清中HBV-DNA的PCR检测可以灵敏的反映病毒的复制。我们发现HBV在血清与组织中的表达不同。5例血清HBV-DNA阳性，说明有HBV的复制，p16INK4a蛋白表达率为40%。6例HCC的HBV-DNA血清表现阴性可能是由于HBVDNA的整合等因素引起病毒复制减弱，p16INK4a蛋白表达率为16.67%，低于其他组。p21WAF1蛋白阳性率在两组表达较一致(见表3)。是否p16INK4a蛋白表达与HBV存在的形式有关有待进一步研究。
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〔参考文献〕
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8 HUI AM,Kanai Y,Sakamoto M,et al.Reduced p21WAF1 expression and p53 mutation in hepatocellular carcinomas〔J〕.Hepatology,1997,25:575.
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10 Chaubert P,Gayer R,Zimmermann A,et al.Germ line mutation of p16INK4a(MTS1)gene occur in a subset of patients with hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepatology,1997,25:
1376.
11 周金莲，梁英锐，冯德云，等.肝癌及癌旁组织HBVDNA原位杂交HBsAg免疫组织化学双标记研究〔J〕.中华病理学杂志，1995，24：18.
收稿日期：1998-11-17;修回日期：1999-01-12, 百拇医药