帕金森病基因治疗实验研究中治疗基因的选择
作者：段德义 徐群渊
单位：首都医科大学神经科学研究所，北京100054
关键词：
解剖学报00zk07
【中图分类号】 Q189 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)-增-25
THERAPEUTIC GENES IN EXPERIMENTAL STUDY ON GENE THERAPY FOR PARKINSON DISEASE
帕金森病(PD)的主要病理特征为中脑黑质多巴胺能神经元变性缺失，临床 表现有静止性震颤、肌强直、运动减少和姿势反射障碍等。目前的治疗措施以左旋多巴(L- 3，4-dihydroxyphephenelalanine,L-DOPA)为主，但存在后期无效、不能阻止疾病进展及 震 颤等问题。其他治疗措施如向脑内植入能产生多巴胺(DA)的细胞(如肾上腺髓质 细胞和胚胎多巴胺能神经元)也有一定的疗效，但因存在存活、疗效、细胞来源及伦理等问 题难以在临床推广[1]。从80年代开始，人们积极探索各种基因治疗PD的手段，包 括向 脑内移植能提高纹状体DA水平的各种酶(如酪氨酸羟化酶)以及能促进黑质神经元存活的神经 营养因子等基因的各种运载细胞，或将这些基因通过病毒性载体直接注入脑内[2] 。许多研究证明，上述不同基因治疗方案都能在不同程度上改善动物行为症状或有助于中脑 神经元结构功能的恢复。
, http://www.100md.com
帕金森病(PD)的主要病理特征为中脑黑质多巴胺能神经元变性缺失，临床 表现有静止性震颤、肌强直、运动减少和姿势反射障碍等。目前的治疗措施以左旋多巴(L- 3，4-dihydroxyphephenelalanine,L-DOPA)为主，但存在后期无效、不能阻止疾病进展及 震 颤等问题。其他治疗措施如向脑内植入能产生多巴胺(DA)的细胞(如肾上腺髓质 细胞和胚胎多巴胺能神经元)也有一定的疗效，但因存在存活、疗效、细胞来源及伦理等问 题难以在临床推广[1]。从80年代开始，人们积极探索各种基因治疗PD的手段，包 括向 脑内移植能提高纹状体DA水平的各种酶(如酪氨酸羟化酶)以及能促进黑质神经元存活的神经 营养因子等基因的各种运载细胞，或将这些基因通过病毒性载体直接注入脑内[2] 。许多研究证明，上述不同基因治疗方案都能在不同程度上改善动物行为症状或有助于中脑 神经元结构功能的恢复。
1.帕金森病基因治疗策略
鉴于PD主要是由于合成DA递质的黑质多巴胺能神经元丢失造成其靶结构纹状体中DA含量下降 所致，因此对PD的基因治疗可在两个水平进行，即一方面将编码DA生成或代谢的酶类基因 导入纹状体以增加DA的局部含量；另一方面，则可将营养因子基因导入黑质纹状体系统以减 慢或阻止DA神经元变性的进程[2]。
, http://www.100md.com
向黑质纹状体导入治疗基因通过间接体内(回体)(ex vivo)和直接体内(in vivo)两 种方法。 前者是在体外用携带治疗基因的表达载体转染培养细胞后再移植于脑内，后者是将携带目的 基因的表达载体直接注射于脑内，以达到治疗PD的目的。
一般用于体外转基因的表达载体为真核表达质粒和逆转录病毒。质粒的基因输送系统包括裸 DNA、阳离子脂质体、阳离子聚合体[2]。阳离子多肽(如多聚甘氨酸)和带负电荷DN A结合后与细胞表面的特异性配体如转铁蛋白或胰岛素相互作用并诱发胞吞作用，使DNA转运 至细胞内。阳离子脂质可浓缩并包裹DNA于正电荷复合体(脂质体)中，也可由胞吞介导进入 细胞[2]。逆转录病毒载体来自经过改造的小鼠白血病病毒，这种载体可容纳长达8 .0kb的外源DNA序列，其克隆质粒中已被去除了原来表达病毒成分的基因如env、gag、pol 等 ，只保留了病毒的逆转录及原病毒转录的控制序列LTR以及病毒的包装信号ψ。重组病毒感 染(转导，transduction)细胞后，其RNA逆转录形成的DNA即原病毒可以稳定地整合于细胞基 因组中，使外源DNA在细胞中得到稳定表达[2]。但其只能转导分裂期细胞，从而限 制了其在非增生细胞如肝细胞、肌纤维、造血干细胞和神经元等细胞中基因转移的应用。可 用来表达外源基因的运载细胞很多，如成纤维细胞、成肌细胞、多能骨髓基质细胞、肿 瘤细胞系、胶质细胞和神经干细胞[1]等均有应用。
, http://www.100md.com
直接体内的转基因载体多用病毒性载体，如腺病毒(adenoviral vector,Ad)、 腺相关病毒(adenoassociated viral vector,AAV)、单纯疱疹病毒(herpes si mplex virus vector,HSV)、慢病毒(lentiviral vector)等。这 些重组病毒可在注射局部感染细胞并使之表达外源基因以达到治疗的目的。另外，也有用质 粒直接脑内注射的报道。
2.治疗基因Ⅰ--影响多巴胺合成途径的酶类基因
2.1酪氨酸羟化酶(TH)：TH是DA合成通路上的限速酶，但作为蛋白，它不能直接 被细胞所吸收。将表达外源TH的遗传修饰细胞植入或将TH基因直接注入纹状体，是目前基因 治疗PD的主要策略。
将转有TH基因的大鼠成肌细胞移植于PD模型大鼠纹状体后，能纠正模型动物的不正常旋转行 为达50%～60%，疗效可维持13个月以上，移植后纹状体内DA含量可达到正常水平的49%、是 未治疗时的25倍，未见肿瘤形成，免疫排除反应不明显[3]。将GFAP启动子驱动的T H 表达载体与脂质体的混合物直接注入PD大鼠纹状体，经过GFAP和TH免疫双标处理后在激光共 聚焦显微镜下观察，可见TH特异性表达于神经胶质细胞，动物旋转行为改善[4] 。为了提高质粒直接注射后基因的表达水平，将牛乳头瘤病毒改造的TH和AADC(左旋芳香氨 基酸脱羧酶)表达质粒向PD大鼠纹状体连续注射7d，动物行为改善达5个月之久，且共转染效 率比单一TH的要好[5]。用HSV介导的TH基因转染PD大鼠纹状体后，动物行为改善 和生化代谢(包括纹状体TH酶活性和细胞外液DA浓度)好转可持续1年[6]。
, 百拇医药
2.2 GTP环化水解酶(GTP cyclohydrolase I,GTPCHI)：6-四氢碟吟(tetrahydropete rin ,BH4)是TH的辅助因子，而GTPCHI是合成BH4过程中的限速酶。由于单胺能神经元以外的细胞 中B H4含量较低而不足以激活TH的活性[7]，因此在TH、GTPCHI共表达的纹状体组织中 ，L-DOPA含量会比单一转染TH时明显提高。用AAV介导的TH、GTPCHI转染PD大鼠纹状体后，3 周可见TH表达，6个月后表达降低；用神经元标记物NeuN染色表明，90%以上的AAV-TH阳性 细 胞为神经元。微透析分析表明，GTPCHI和TH共表达的动物L-DOPA水平升高明显(4～7μg/L) ， 且不依赖于外源性BH4的供应，但动物的旋转行为没有明显变化；而单转染TH的动物只有在 获得外源BH4的情况下才可检测到L-DOPA(1～4μg/L)[8]。
用TH和GTPCHI重组逆转录病毒转染大鼠胶质肉瘤9L细胞、原代培养成纤维细胞[9] 、大鼠和人的多能骨髓基质细胞[10]后移植于PD大鼠纹状体，微透析分析表明共转 染细胞移植组的纹状体L-DOPA比TH单一转染组明显高，但是转基因成纤维细胞对外源基因 表 达呈进行性降低，移植后第5周已完全检测不到转基因的表达，说明成纤维细胞对转基因的 长期表达效果不理想；转基因骨髓基质细胞存活87d，但转基因表达只有9d，动物的旋转行 为得到改善，共转染组与单TH转染组间没有显著性差别。
, http://www.100md.com
2.3 左旋芳香氨基酸脱羧酶(aromatic amino acid decarboxylase,AADC):在DA合成过 程中，需 由酪氨酸经TH催化形成L-DOPA，再经AADC对之脱羧而形成神经递质DA。研究发现，在帕金 森 病的纹状体中，内源性AADC含量甚微、活性很低[11]。因此，单独补充TH基因的治 疗效果可能受到限制。已有研究证明，AAV介导的AADC基因在大鼠纹状体转移后，再全身给 予L-DOPA的情况下，其纹状体内的脱羧能力提高并能维持6个月，转入酶的基因表达在1年 以 上。其优点在于通过调节L-DOPA的剂量达到调节DA含量的目的，这与TH或TH-AADC联合治 疗 不同，后两者不能得到可调节的DA输送方法[12]。用TH和AADC共表达的AAV载体转 染MPTP诱发的PD模型猴纹状体，TH表达可达134d，沿注射通道见DA水平升高，但行为上没有 明显改变。用此种载体后，动物有发热和偶见的过敏反应，但组织学上未见炎症反应[ 13]。
, http://www.100md.com 3.治疗基因Ⅱ--多巴胺重吸收转运蛋白(小泡单胺类转运体)
现已知，长期使用L-DOPA药物治疗PD会出现效果降低(wearing-off)的现象和 运动障碍，其部分原因是DA能神经末梢丢失后不再调节DA的稳定释放。
小泡单胺类转运体(vesicular monoamine transporter,VMAT)位于神经末梢的突触囊泡膜上 ，可将内源性DA从胞质运至小泡内贮存[14]。在两类VMAT中，VMAT2主要位于脑内 ，对儿茶酚胺类的亲和性高于VMAT1。VMAT2在没有突触小泡的非神经元细胞( 如成纤维细胞)中也能起到单胺类转运体的作用，即可将DA贮存于酸性胞内体(endosome)中 [15]，需要时能稳定而缓慢地释放出来。实验证明，将原代培养的成纤维细胞用VM AT-2和AADC重组逆转录病毒转染后再移植到PD大鼠纹状体内，在全身性给于L-DOPA的条件 下 ，发现DA在纹状体内的水平比单一转染AADC基因的动物持续时间长，能明显提高L-DOPA全 身 给药后纹状体内DA水平，这恰好能解决L-DOPA药物治疗PD时出现的副作用，包括药物作用 持续时间短、出现运动障碍等[16]。
, http://www.100md.com
4.治疗基因Ⅲ--神经营养因子
上述TH、GTPCHI、AADC、VMAT-2等参与DA代谢的酶类或蛋白基因对帕金森病有对 症治疗作用，而利用GDNF、BDNF和bFGF等神经营养因子基因则具有营养DA能神经元的作用， 它们对PD的治疗作用体现在保护神经元的结构和功能方面。
4.1 胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)：GDNF最早是从大鼠胶质瘤细胞系B49的条件培养液中分离纯化得到，并发 现其在中枢神经系统的尾状核、壳核、海马、皮质和脊髓[17]以及骨骼肌、胃肠道 平滑肌纤维中表达。作为靶器官(组织)源性神经营养因子，GDNF在体内微量释放后通过逆行 转运或旁分泌作用对多巴胺能神经元、脊髓前角运动神经元、背根神经节、颈上神经节、小 脑浦肯野细胞以及肾等非神经元细胞具有生长促进作用[18]。
, 百拇医药
将转有GDNF基因的幼年仓鼠肾细胞(BHK)经微囊包裹后移植于靠近大鼠内侧前脑束(MFB)的黑 质前方，1周后用6-OHDA毁损MFB，发现尽管纹状体DA含量没有增加，但黑质致密部TH阳性D A神经元受到保护且动物旋转行为能够改善[19]。将转入GDNF基因的施万细胞 系SCTM41与胚胎多巴胺能神经元共培养后再植入纹状体和黑质，能提高植入的胚胎细胞存活 能力，表现为移植物中TH阳性细胞和移植物周围TH阳性纤维增加，可见细胞突起伸向释放GD NF的微囊部位[20]。
将Ad-GDNF注射于大鼠黑质附近或纹状体，能减少6-OHDA所引起的DA神经元变性，在移植7 周 内可在黑质中检出GDNF转基因蛋白的表达，但只有接受Ad-GDNF纹状体注射的动物的旋转行 为得到改善及6-OHDA诱发的DA神经末端的损伤受到保护[21]，说明GDNF在黑质的 表达未能起到营养作用。将小鼠磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子控 制的GDNF慢病毒表达载体[22]注射于黑质周围，也能保护黑质多巴胺能神经元的化 学损伤，增加黑质TH阳性神经元的存活。在PD晚期模型中也发现Ad-GDNF在黑质的表达能提 高黑质DA及其代谢产物DOPAC的含量，降低动物旋转行为，改善运动状况[23]。Ad -GDNF也能保护MPTP损伤的C57小鼠黑质纹状体多巴胺神经元，并提高纹状体的DA含量 [24]。
, http://www.100md.com
4.2 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)：bFGF最早是 从牛 脑及垂体的提取液中分离纯化而来，其功能为促进成纤维细胞增殖。后来发现，大鼠全脑胶 质细胞均能表达bFGF，神经元内表达则仅限于某些部位(如海马、扣带回、脑内多巴胺能神 经元)[25]。人脑黑质多巴胺能神经元中呈bFGF免疫反应者达82%，不随年龄增加而 变 化；而在PD患者中，bFGF免疫反应在残存的多巴胺能神经元中只有12.7%[26]。
现已知，bFGF可以促进多巴胺能神经元的存活，促进其突起生长和对DA的摄取，还可在MPP +损伤情况下促进神经元突起的再生长[27]。向MPTP小鼠模型纹状体中注射bFGF 可以引起TH阳性神经末梢的延伸，此现象在幼鼠比在老年小鼠中更明显[28]。胚胎 中脑腹侧组织用bFGF预处理后移植到6-OHDA损毁的大鼠PD模型脑内，其多巴胺能神经元存 活 率可达49%，而未经bFGF处理的只有32%[29]。用bFGF逆转录病毒载体转染原代培养 的成纤维细胞，与胚胎多巴胺能神经元共移植，4周后，大鼠旋转行为开始改善，神经元存 活率提高、突起生长活跃[30]。
, 百拇医药
4.3 脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)：BDNF几乎在脑 的 各部分均有分布，在海马和大脑皮质的含量最高，可影响某些外周和中枢神经元的存活、生 长和分化[31]。BDNF在正常人中脑多巴胺能神经元中表达，其中黑质致密部神经元 占65%。在PD病人的黑质致密部、尾状核、壳核、小脑和额皮质中BDNF表达降低[32] 。经BDNF抗体处理的体外培养大鼠胚胎多巴胺能神经元、细胞的存活能力降低；如将抗 体定位注射于成年大鼠黑质，能引起大鼠的旋转行为。将BDNF预处理的胚胎黑质神经元移植 于PD大鼠模型脑内，3周后发现大鼠旋转行为降低，但经BDNF处理的移植物中TH阳性神经元 数目却减少到20%，这说明BDNF可增强细胞的功能，但不能增强细胞的存活能力[33] 。
从新生大鼠脑皮质分离的I型星形胶质细胞原代培养物，在经逆转录病毒介导的BDNF基因转 染后，移植于6-OHDA毁损的大鼠纹状体32d后，用苯丙胺(amphetamine)诱发的动物旋转行 为 可降低45%，但阿扑吗啡(apomorphine)诱发的旋转行为反而增高；损伤侧纹状体内TH免疫反 应 纤维密度则无影响。这说明BDNF不是通过多巴胺能神经元的再生或突起形成而起作用的 [34]。将BDNF转基因成纤维细胞移植于PD大鼠纹状体，不仅能部分防止6-OHDA引起的纹 状体多巴胺能神经末梢的丢失，而且能预防黑质多巴胺能神经元胞体的进一步缺失[35 ]。将神经特异性NSE启动子控制的rAAV-BDNF注射于黑质致密部后，BDNF可表达9个月， 如在6个月时用6-OHDA毁损黑质，其TH阳性神经元的数量不受损伤的影响，还能阻断苯丙胺 诱导的旋转行为[36]。
, http://www.100md.com
5.治疗基因Ⅳ--抗细胞凋亡和抗过氧化分子
Bcl-2主要分布于线粒体外膜的胞质面、内质网膜和核膜上。已知线粒体膜电位(d elta psiM)的降低会导致渗透性转换孔(permeability transition pore,PTP)的开放从而 触发细胞凋亡。线粒体膜电位则是通过复合体尤其是复合体I将内膜的质子泵出膜外形成的 。在PD病人，中脑黑质和外周组织的线粒体复合体I活性往往降低，这是中脑黑质细胞发生 凋亡的原因之一。Bcl-2和过氧化物歧化酶(SOD)有助于PTP的关闭而抑制凋亡的发生 [37]。bcl-2基因缺陷小鼠对神经毒性物质更敏感，可使MPTP(l-methyl-4-phenyl -1,2, 3,6 tetrahydropyridine)诱发的DA水平降低更明显；向取自在bcl-2转基因小鼠新皮质的 神 经元原代培养物中加入6-OHDA，在杂合子动物其细胞死亡率为69%，而纯合子的则为34%； 用 MPTP处理也可得到相似的结果。在用MPTP处理后，正常小鼠纹状体DA含量降低32%，而bcl- 2 纯合子转基因小鼠的DA含量没有变化[38]。bcl-2转染后，DA对PC12细胞的毒性作 用降低，表现为细胞核凝聚和DNA片段化现象均减少，该转基因细胞的提取物能抑制DA的自 氧化作用，这种抗氧化作用可能是bcl-2抑制细胞凋亡的部分原因[39]。将bcl-2 基因工程永生化黑质细胞定位移植于6-OHDA毁损的大鼠纹状体，发现大鼠的旋转行为降低4 3%，而对照组只为12%，组织学检查未见肿瘤形成[40]。
, 百拇医药
在用脑内移植胚胎中脑组织治疗PD的研究中发现，大约有80%～95%的细胞在移植早期即出现 死亡现象[40]。有研究认为，氧应激(oxidative stress)参与了这一过程。用Ad介 导的Cu/Zn-SOD基因体外感染神经元后植入脑内，能提高PD模型大鼠在移植后的功能恢复能 力[41]。
6.结语
在对帕金森病的基因治疗实验研究中，TH、GTPCHI、AADC、VMAT-2等调节DA代谢 的酶类的转基因细胞移植或病毒性载体介导的基因脑内直接注射均获得了一定结果，其中TH 与GTPCHI和AADC复合转基因成纤维细胞移植获得了比单一TH基因治疗更好的结果。另外，针 对L-DOPA治疗后期出现的副作用，在全身给药的基础上，补充VMAT以增强DA的贮存能力 可达 到缓解毒副作用的目的。GDNF、BDNF、Bcl-2等基因在治疗PD中对多巴胺能神经元有明显的 神经营养作用，这可能对早中期PD治疗有意义。在基因治疗的两种策略中，ex vivo 方法的 优点是可以得到稳定整合外源基因的运载细胞来用于移植，但由于一般患者年龄偏大，获得 原代培养的自体细胞作转基因细胞有一定难度。因此，永生化神经干细胞是一种很有前途的 基因运载细胞。in vivo方法能直接将治疗基因导入靶组织，避免了运载细胞引起的免 疫反 应，但各种病毒性载体在安全性、有效性、稳定性等方面还各有不足。所以，开发新一代病 毒载体如杂和性(hybrid)或嵌和性(chimeric)载体就显得很有必要，如Ad/AAV载体既具有Ad 的高效转导和高容纳能力，又具有AAV的整合能力。随着科学技术的迅速发展，在临床上应 用基因治疗PD的目标一定能够实现。
, http://www.100md.com
【作者简介】段德义(1963-)，男(汉族)，甘肃省镇原人，博士，讲师
参考文献
[1]Prasad KN,Clarkson ED,La Rosa FG,et al.[J]Mol Genet Metab ,1998,65(1):1-9.
[2]Costantini LC,Bakowska JC,Breakefield XO,et al.[J]Gene Th erapy ,2000,7(2):93-109.
[3]Cao L,Zhao YC,Jiang ZH,et al.[J]Gene Ther,2000,7(5):445- 9.
[4]Segovia J,Vergara P,Brenner M,et al.[J]Gene Ther,1998,5 (12):1650-1655.
, 百拇医药
[5]Imaoka T,Date I,Ohmoto T,et al.[J]Hum Gene Ther,1998,9( 7):1093-1100.
[6]During MJ,Naegele JR,O′Malley,et al.[J]Science,1994,26 6(5189):1399-1403.
[7]Levine RA,Miller LP,Lovenberg W.[J]Science,1981,214(452 3):919-921.
[8]Mandel RJ,Rendahl KG,Spratt SK,et al.[J]J Neurosci,1998 ,18(11):4271-4284.
[9]Leff SE,Rendahl KG,Spratt SK,et al.[J]Exp Neurol,1998,151 (2):249-264.
, 百拇医药
[10]Schwarz EJ,Alexander GM,Prockop DJ,et al.[J]Hum Gene The r,1999,10(15):2539-2549.
[11]Kang UJ,Park DH,Wessel T,et al.[J]Neurosci lett,1992,14 7(1):53-57.
[12]Leff SE,Spratt SK,Snyder RO,et al.[J]Neuroscience,1999, 92(1):185-196.
[13]During MJ,Samulski RJ,Elsworth JD,et al.[J]Gene Ther,19 98,5(6):820-827.
[14]Erickson JD,Eiden LE,Hoffman BJ.[J]Proc Natl Acad Sci U SA,1992,89(22):10993-10997.
, 百拇医药
[15]Merickel A,Rosandich P,Peter D,et al.[J]J Biol Chem,1995 ,270(43):25798-25804.
[16]Lee WY,Chang JW,Nemeth NL,et al.[J]J Neurosci,1999,19(8) :3266-3274.
[17]Springer JE,Mu X,Bergmann LW,et al.[J]Exp Neurol,1994,12 7(2):167-170.
[18]Saarma M,Sariola H.[J]Microsc Res Tech,1999,45(4-5):29 2-302.
[19]Lindner MD,Winn SR,Baetge EE,et al.[J]Exp Neurol,1995,13 2(1):62-76.
, http://www.100md.com
[20]Sautter J,Tseng JL,Braguglia D,et al.[J]Exp Neurol, 1998,149(1):230-236.
[21]Connor B,Kozlowski DA,Schallert T,et al.[J]Gene Ther ,19 99,6(12):1936-1951.
[22]Deglon N,Tseng JL,Bensadoun,JC,et al.[J]Hum Gene Ther,20 00,11(1):179-190.
[23]Lapchak PA,Araujo DM,Hilt DC,et al.[J]Brain Res,1997,777 (1-2):153-160.
[24]Kojima H,Abiru Y,Sakajiri K,et al.[J]Biochem Biophys Res Commun,1997,238(2):569-573.
, 百拇医药
[25]Gomez-Pinilla F,Lee JW,Cotman CW.[J]Neuroscience,1994， 61(4):911-923.
[26]Tooyama I,Kawamata T,Walker D,et al.[J]Neurology,1993,43 (2):372-376.
[27]Zawada WM,David LK,Cohen JJ，et al.[J]Exp Neurol,1996, 140(1):60-67.
[28]Date I,Yoshimoto Y,Imaoka T,et al.[J]Brain Res,1993,621( 1):150-154.
[29]Zawada WM,Zastrow DJ,Clarkson ED,et al.[J]Brain Research ,1998,786(1-2):96-103.
, 百拇医药
[30]Takayama H,Ray J,Heather K，et al.[J]Nat Med,1995,1(1):5 3-58.
[31]Serrano-Sanchez T,Diaz-Armesto I.[J]Rev Neurol,1998,26 (154):1027-1032.
[32]Mogi M,Togari A,Kondo T,et al.[J]Neurosci Lett,1999,270( 1):45-48.
[33]Zhou J,Bradford HF,Stern GM,et al.[J]Brain Res Dev Brain Res,1997,100(1):43-51.
[34]Yoshimoto Y,Lin Q,Collier TJ,et al.[J]Brain Res ,1995,69 1(1-2):25-36.
, http://www.100md.com
[35]Levivier M,Przedborski S,Bencsics C,et al.[J]J Neurosci, 1995,15(12):7810-7820.
[36]Klein RL,Lewis MH,Muzyczka N,et al.[J]Brain Res,1999,847 (2):314-320.
[37]Tatton WG,Chalmers-Redman RM.[J]Ann Neurol,1998,4 4(3 suppl l):S134-141.
[38]Offen D,Beart PM,Cheung NS,et al.[J]Proc Natl Acad Sci U SA,1998,95(10):5789-5794.
[39]Offen D,Ziv I,Panet H,et al.[J]Cell Mol Neurobiol,1997,1 7(3):289-304.
[40]Anton R,Kordower JH,Kane DJ,et al.[J]Cell Transplant,199 5,4(1):49-54.
[41]Barkats M,Nakao N,Grasbon-Frodl EM,et al.[J]Neuroscienc e,1997,78(3):703-713.
【收稿日期】2000-07-17
请看PDF全文, 百拇医药
单位：首都医科大学神经科学研究所，北京100054
关键词：
解剖学报00zk07
【中图分类号】 Q189 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)-增-25
THERAPEUTIC GENES IN EXPERIMENTAL STUDY ON GENE THERAPY FOR PARKINSON DISEASE
帕金森病(PD)的主要病理特征为中脑黑质多巴胺能神经元变性缺失，临床 表现有静止性震颤、肌强直、运动减少和姿势反射障碍等。目前的治疗措施以左旋多巴(L- 3，4-dihydroxyphephenelalanine,L-DOPA)为主，但存在后期无效、不能阻止疾病进展及 震 颤等问题。其他治疗措施如向脑内植入能产生多巴胺(DA)的细胞(如肾上腺髓质 细胞和胚胎多巴胺能神经元)也有一定的疗效，但因存在存活、疗效、细胞来源及伦理等问 题难以在临床推广[1]。从80年代开始，人们积极探索各种基因治疗PD的手段，包 括向 脑内移植能提高纹状体DA水平的各种酶(如酪氨酸羟化酶)以及能促进黑质神经元存活的神经 营养因子等基因的各种运载细胞，或将这些基因通过病毒性载体直接注入脑内[2] 。许多研究证明，上述不同基因治疗方案都能在不同程度上改善动物行为症状或有助于中脑 神经元结构功能的恢复。
, http://www.100md.com
帕金森病(PD)的主要病理特征为中脑黑质多巴胺能神经元变性缺失，临床 表现有静止性震颤、肌强直、运动减少和姿势反射障碍等。目前的治疗措施以左旋多巴(L- 3，4-dihydroxyphephenelalanine,L-DOPA)为主，但存在后期无效、不能阻止疾病进展及 震 颤等问题。其他治疗措施如向脑内植入能产生多巴胺(DA)的细胞(如肾上腺髓质 细胞和胚胎多巴胺能神经元)也有一定的疗效，但因存在存活、疗效、细胞来源及伦理等问 题难以在临床推广[1]。从80年代开始，人们积极探索各种基因治疗PD的手段，包 括向 脑内移植能提高纹状体DA水平的各种酶(如酪氨酸羟化酶)以及能促进黑质神经元存活的神经 营养因子等基因的各种运载细胞，或将这些基因通过病毒性载体直接注入脑内[2] 。许多研究证明，上述不同基因治疗方案都能在不同程度上改善动物行为症状或有助于中脑 神经元结构功能的恢复。
1.帕金森病基因治疗策略
鉴于PD主要是由于合成DA递质的黑质多巴胺能神经元丢失造成其靶结构纹状体中DA含量下降 所致，因此对PD的基因治疗可在两个水平进行，即一方面将编码DA生成或代谢的酶类基因 导入纹状体以增加DA的局部含量；另一方面，则可将营养因子基因导入黑质纹状体系统以减 慢或阻止DA神经元变性的进程[2]。
, http://www.100md.com
向黑质纹状体导入治疗基因通过间接体内(回体)(ex vivo)和直接体内(in vivo)两 种方法。 前者是在体外用携带治疗基因的表达载体转染培养细胞后再移植于脑内，后者是将携带目的 基因的表达载体直接注射于脑内，以达到治疗PD的目的。
一般用于体外转基因的表达载体为真核表达质粒和逆转录病毒。质粒的基因输送系统包括裸 DNA、阳离子脂质体、阳离子聚合体[2]。阳离子多肽(如多聚甘氨酸)和带负电荷DN A结合后与细胞表面的特异性配体如转铁蛋白或胰岛素相互作用并诱发胞吞作用，使DNA转运 至细胞内。阳离子脂质可浓缩并包裹DNA于正电荷复合体(脂质体)中，也可由胞吞介导进入 细胞[2]。逆转录病毒载体来自经过改造的小鼠白血病病毒，这种载体可容纳长达8 .0kb的外源DNA序列，其克隆质粒中已被去除了原来表达病毒成分的基因如env、gag、pol 等 ，只保留了病毒的逆转录及原病毒转录的控制序列LTR以及病毒的包装信号ψ。重组病毒感 染(转导，transduction)细胞后，其RNA逆转录形成的DNA即原病毒可以稳定地整合于细胞基 因组中，使外源DNA在细胞中得到稳定表达[2]。但其只能转导分裂期细胞，从而限 制了其在非增生细胞如肝细胞、肌纤维、造血干细胞和神经元等细胞中基因转移的应用。可 用来表达外源基因的运载细胞很多，如成纤维细胞、成肌细胞、多能骨髓基质细胞、肿 瘤细胞系、胶质细胞和神经干细胞[1]等均有应用。
, http://www.100md.com
直接体内的转基因载体多用病毒性载体，如腺病毒(adenoviral vector,Ad)、 腺相关病毒(adenoassociated viral vector,AAV)、单纯疱疹病毒(herpes si mplex virus vector,HSV)、慢病毒(lentiviral vector)等。这 些重组病毒可在注射局部感染细胞并使之表达外源基因以达到治疗的目的。另外，也有用质 粒直接脑内注射的报道。
2.治疗基因Ⅰ--影响多巴胺合成途径的酶类基因
2.1酪氨酸羟化酶(TH)：TH是DA合成通路上的限速酶，但作为蛋白，它不能直接 被细胞所吸收。将表达外源TH的遗传修饰细胞植入或将TH基因直接注入纹状体，是目前基因 治疗PD的主要策略。
将转有TH基因的大鼠成肌细胞移植于PD模型大鼠纹状体后，能纠正模型动物的不正常旋转行 为达50%～60%，疗效可维持13个月以上，移植后纹状体内DA含量可达到正常水平的49%、是 未治疗时的25倍，未见肿瘤形成，免疫排除反应不明显[3]。将GFAP启动子驱动的T H 表达载体与脂质体的混合物直接注入PD大鼠纹状体，经过GFAP和TH免疫双标处理后在激光共 聚焦显微镜下观察，可见TH特异性表达于神经胶质细胞，动物旋转行为改善[4] 。为了提高质粒直接注射后基因的表达水平，将牛乳头瘤病毒改造的TH和AADC(左旋芳香氨 基酸脱羧酶)表达质粒向PD大鼠纹状体连续注射7d，动物行为改善达5个月之久，且共转染效 率比单一TH的要好[5]。用HSV介导的TH基因转染PD大鼠纹状体后，动物行为改善 和生化代谢(包括纹状体TH酶活性和细胞外液DA浓度)好转可持续1年[6]。
, 百拇医药
2.2 GTP环化水解酶(GTP cyclohydrolase I,GTPCHI)：6-四氢碟吟(tetrahydropete rin ,BH4)是TH的辅助因子，而GTPCHI是合成BH4过程中的限速酶。由于单胺能神经元以外的细胞 中B H4含量较低而不足以激活TH的活性[7]，因此在TH、GTPCHI共表达的纹状体组织中 ，L-DOPA含量会比单一转染TH时明显提高。用AAV介导的TH、GTPCHI转染PD大鼠纹状体后，3 周可见TH表达，6个月后表达降低；用神经元标记物NeuN染色表明，90%以上的AAV-TH阳性 细 胞为神经元。微透析分析表明，GTPCHI和TH共表达的动物L-DOPA水平升高明显(4～7μg/L) ， 且不依赖于外源性BH4的供应，但动物的旋转行为没有明显变化；而单转染TH的动物只有在 获得外源BH4的情况下才可检测到L-DOPA(1～4μg/L)[8]。
用TH和GTPCHI重组逆转录病毒转染大鼠胶质肉瘤9L细胞、原代培养成纤维细胞[9] 、大鼠和人的多能骨髓基质细胞[10]后移植于PD大鼠纹状体，微透析分析表明共转 染细胞移植组的纹状体L-DOPA比TH单一转染组明显高，但是转基因成纤维细胞对外源基因 表 达呈进行性降低，移植后第5周已完全检测不到转基因的表达，说明成纤维细胞对转基因的 长期表达效果不理想；转基因骨髓基质细胞存活87d，但转基因表达只有9d，动物的旋转行 为得到改善，共转染组与单TH转染组间没有显著性差别。
, http://www.100md.com
2.3 左旋芳香氨基酸脱羧酶(aromatic amino acid decarboxylase,AADC):在DA合成过 程中，需 由酪氨酸经TH催化形成L-DOPA，再经AADC对之脱羧而形成神经递质DA。研究发现，在帕金 森 病的纹状体中，内源性AADC含量甚微、活性很低[11]。因此，单独补充TH基因的治 疗效果可能受到限制。已有研究证明，AAV介导的AADC基因在大鼠纹状体转移后，再全身给 予L-DOPA的情况下，其纹状体内的脱羧能力提高并能维持6个月，转入酶的基因表达在1年 以 上。其优点在于通过调节L-DOPA的剂量达到调节DA含量的目的，这与TH或TH-AADC联合治 疗 不同，后两者不能得到可调节的DA输送方法[12]。用TH和AADC共表达的AAV载体转 染MPTP诱发的PD模型猴纹状体，TH表达可达134d，沿注射通道见DA水平升高，但行为上没有 明显改变。用此种载体后，动物有发热和偶见的过敏反应，但组织学上未见炎症反应[ 13]。
, http://www.100md.com 3.治疗基因Ⅱ--多巴胺重吸收转运蛋白(小泡单胺类转运体)
现已知，长期使用L-DOPA药物治疗PD会出现效果降低(wearing-off)的现象和 运动障碍，其部分原因是DA能神经末梢丢失后不再调节DA的稳定释放。
小泡单胺类转运体(vesicular monoamine transporter,VMAT)位于神经末梢的突触囊泡膜上 ，可将内源性DA从胞质运至小泡内贮存[14]。在两类VMAT中，VMAT2主要位于脑内 ，对儿茶酚胺类的亲和性高于VMAT1。VMAT2在没有突触小泡的非神经元细胞( 如成纤维细胞)中也能起到单胺类转运体的作用，即可将DA贮存于酸性胞内体(endosome)中 [15]，需要时能稳定而缓慢地释放出来。实验证明，将原代培养的成纤维细胞用VM AT-2和AADC重组逆转录病毒转染后再移植到PD大鼠纹状体内，在全身性给于L-DOPA的条件 下 ，发现DA在纹状体内的水平比单一转染AADC基因的动物持续时间长，能明显提高L-DOPA全 身 给药后纹状体内DA水平，这恰好能解决L-DOPA药物治疗PD时出现的副作用，包括药物作用 持续时间短、出现运动障碍等[16]。
, http://www.100md.com
4.治疗基因Ⅲ--神经营养因子
上述TH、GTPCHI、AADC、VMAT-2等参与DA代谢的酶类或蛋白基因对帕金森病有对 症治疗作用，而利用GDNF、BDNF和bFGF等神经营养因子基因则具有营养DA能神经元的作用， 它们对PD的治疗作用体现在保护神经元的结构和功能方面。
4.1 胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)：GDNF最早是从大鼠胶质瘤细胞系B49的条件培养液中分离纯化得到，并发 现其在中枢神经系统的尾状核、壳核、海马、皮质和脊髓[17]以及骨骼肌、胃肠道 平滑肌纤维中表达。作为靶器官(组织)源性神经营养因子，GDNF在体内微量释放后通过逆行 转运或旁分泌作用对多巴胺能神经元、脊髓前角运动神经元、背根神经节、颈上神经节、小 脑浦肯野细胞以及肾等非神经元细胞具有生长促进作用[18]。
, 百拇医药
将转有GDNF基因的幼年仓鼠肾细胞(BHK)经微囊包裹后移植于靠近大鼠内侧前脑束(MFB)的黑 质前方，1周后用6-OHDA毁损MFB，发现尽管纹状体DA含量没有增加，但黑质致密部TH阳性D A神经元受到保护且动物旋转行为能够改善[19]。将转入GDNF基因的施万细胞 系SCTM41与胚胎多巴胺能神经元共培养后再植入纹状体和黑质，能提高植入的胚胎细胞存活 能力，表现为移植物中TH阳性细胞和移植物周围TH阳性纤维增加，可见细胞突起伸向释放GD NF的微囊部位[20]。
将Ad-GDNF注射于大鼠黑质附近或纹状体，能减少6-OHDA所引起的DA神经元变性，在移植7 周 内可在黑质中检出GDNF转基因蛋白的表达，但只有接受Ad-GDNF纹状体注射的动物的旋转行 为得到改善及6-OHDA诱发的DA神经末端的损伤受到保护[21]，说明GDNF在黑质的 表达未能起到营养作用。将小鼠磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子控 制的GDNF慢病毒表达载体[22]注射于黑质周围，也能保护黑质多巴胺能神经元的化 学损伤，增加黑质TH阳性神经元的存活。在PD晚期模型中也发现Ad-GDNF在黑质的表达能提 高黑质DA及其代谢产物DOPAC的含量，降低动物旋转行为，改善运动状况[23]。Ad -GDNF也能保护MPTP损伤的C57小鼠黑质纹状体多巴胺神经元，并提高纹状体的DA含量 [24]。
, http://www.100md.com
4.2 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)：bFGF最早是 从牛 脑及垂体的提取液中分离纯化而来，其功能为促进成纤维细胞增殖。后来发现，大鼠全脑胶 质细胞均能表达bFGF，神经元内表达则仅限于某些部位(如海马、扣带回、脑内多巴胺能神 经元)[25]。人脑黑质多巴胺能神经元中呈bFGF免疫反应者达82%，不随年龄增加而 变 化；而在PD患者中，bFGF免疫反应在残存的多巴胺能神经元中只有12.7%[26]。
现已知，bFGF可以促进多巴胺能神经元的存活，促进其突起生长和对DA的摄取，还可在MPP +损伤情况下促进神经元突起的再生长[27]。向MPTP小鼠模型纹状体中注射bFGF 可以引起TH阳性神经末梢的延伸，此现象在幼鼠比在老年小鼠中更明显[28]。胚胎 中脑腹侧组织用bFGF预处理后移植到6-OHDA损毁的大鼠PD模型脑内，其多巴胺能神经元存 活 率可达49%，而未经bFGF处理的只有32%[29]。用bFGF逆转录病毒载体转染原代培养 的成纤维细胞，与胚胎多巴胺能神经元共移植，4周后，大鼠旋转行为开始改善，神经元存 活率提高、突起生长活跃[30]。
, 百拇医药
4.3 脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)：BDNF几乎在脑 的 各部分均有分布，在海马和大脑皮质的含量最高，可影响某些外周和中枢神经元的存活、生 长和分化[31]。BDNF在正常人中脑多巴胺能神经元中表达，其中黑质致密部神经元 占65%。在PD病人的黑质致密部、尾状核、壳核、小脑和额皮质中BDNF表达降低[32] 。经BDNF抗体处理的体外培养大鼠胚胎多巴胺能神经元、细胞的存活能力降低；如将抗 体定位注射于成年大鼠黑质，能引起大鼠的旋转行为。将BDNF预处理的胚胎黑质神经元移植 于PD大鼠模型脑内，3周后发现大鼠旋转行为降低，但经BDNF处理的移植物中TH阳性神经元 数目却减少到20%，这说明BDNF可增强细胞的功能，但不能增强细胞的存活能力[33] 。
从新生大鼠脑皮质分离的I型星形胶质细胞原代培养物，在经逆转录病毒介导的BDNF基因转 染后，移植于6-OHDA毁损的大鼠纹状体32d后，用苯丙胺(amphetamine)诱发的动物旋转行 为 可降低45%，但阿扑吗啡(apomorphine)诱发的旋转行为反而增高；损伤侧纹状体内TH免疫反 应 纤维密度则无影响。这说明BDNF不是通过多巴胺能神经元的再生或突起形成而起作用的 [34]。将BDNF转基因成纤维细胞移植于PD大鼠纹状体，不仅能部分防止6-OHDA引起的纹 状体多巴胺能神经末梢的丢失，而且能预防黑质多巴胺能神经元胞体的进一步缺失[35 ]。将神经特异性NSE启动子控制的rAAV-BDNF注射于黑质致密部后，BDNF可表达9个月， 如在6个月时用6-OHDA毁损黑质，其TH阳性神经元的数量不受损伤的影响，还能阻断苯丙胺 诱导的旋转行为[36]。
, http://www.100md.com
5.治疗基因Ⅳ--抗细胞凋亡和抗过氧化分子
Bcl-2主要分布于线粒体外膜的胞质面、内质网膜和核膜上。已知线粒体膜电位(d elta psiM)的降低会导致渗透性转换孔(permeability transition pore,PTP)的开放从而 触发细胞凋亡。线粒体膜电位则是通过复合体尤其是复合体I将内膜的质子泵出膜外形成的 。在PD病人，中脑黑质和外周组织的线粒体复合体I活性往往降低，这是中脑黑质细胞发生 凋亡的原因之一。Bcl-2和过氧化物歧化酶(SOD)有助于PTP的关闭而抑制凋亡的发生 [37]。bcl-2基因缺陷小鼠对神经毒性物质更敏感，可使MPTP(l-methyl-4-phenyl -1,2, 3,6 tetrahydropyridine)诱发的DA水平降低更明显；向取自在bcl-2转基因小鼠新皮质的 神 经元原代培养物中加入6-OHDA，在杂合子动物其细胞死亡率为69%，而纯合子的则为34%； 用 MPTP处理也可得到相似的结果。在用MPTP处理后，正常小鼠纹状体DA含量降低32%，而bcl- 2 纯合子转基因小鼠的DA含量没有变化[38]。bcl-2转染后，DA对PC12细胞的毒性作 用降低，表现为细胞核凝聚和DNA片段化现象均减少，该转基因细胞的提取物能抑制DA的自 氧化作用，这种抗氧化作用可能是bcl-2抑制细胞凋亡的部分原因[39]。将bcl-2 基因工程永生化黑质细胞定位移植于6-OHDA毁损的大鼠纹状体，发现大鼠的旋转行为降低4 3%，而对照组只为12%，组织学检查未见肿瘤形成[40]。
, 百拇医药
在用脑内移植胚胎中脑组织治疗PD的研究中发现，大约有80%～95%的细胞在移植早期即出现 死亡现象[40]。有研究认为，氧应激(oxidative stress)参与了这一过程。用Ad介 导的Cu/Zn-SOD基因体外感染神经元后植入脑内，能提高PD模型大鼠在移植后的功能恢复能 力[41]。
6.结语
在对帕金森病的基因治疗实验研究中，TH、GTPCHI、AADC、VMAT-2等调节DA代谢 的酶类的转基因细胞移植或病毒性载体介导的基因脑内直接注射均获得了一定结果，其中TH 与GTPCHI和AADC复合转基因成纤维细胞移植获得了比单一TH基因治疗更好的结果。另外，针 对L-DOPA治疗后期出现的副作用，在全身给药的基础上，补充VMAT以增强DA的贮存能力 可达 到缓解毒副作用的目的。GDNF、BDNF、Bcl-2等基因在治疗PD中对多巴胺能神经元有明显的 神经营养作用，这可能对早中期PD治疗有意义。在基因治疗的两种策略中，ex vivo 方法的 优点是可以得到稳定整合外源基因的运载细胞来用于移植，但由于一般患者年龄偏大，获得 原代培养的自体细胞作转基因细胞有一定难度。因此，永生化神经干细胞是一种很有前途的 基因运载细胞。in vivo方法能直接将治疗基因导入靶组织，避免了运载细胞引起的免 疫反 应，但各种病毒性载体在安全性、有效性、稳定性等方面还各有不足。所以，开发新一代病 毒载体如杂和性(hybrid)或嵌和性(chimeric)载体就显得很有必要，如Ad/AAV载体既具有Ad 的高效转导和高容纳能力，又具有AAV的整合能力。随着科学技术的迅速发展，在临床上应 用基因治疗PD的目标一定能够实现。
, http://www.100md.com
【作者简介】段德义(1963-)，男(汉族)，甘肃省镇原人，博士，讲师
参考文献
[1]Prasad KN,Clarkson ED,La Rosa FG,et al.[J]Mol Genet Metab ,1998,65(1):1-9.
[2]Costantini LC,Bakowska JC,Breakefield XO,et al.[J]Gene Th erapy ,2000,7(2):93-109.
[3]Cao L,Zhao YC,Jiang ZH,et al.[J]Gene Ther,2000,7(5):445- 9.
[4]Segovia J,Vergara P,Brenner M,et al.[J]Gene Ther,1998,5 (12):1650-1655.
, 百拇医药
[5]Imaoka T,Date I,Ohmoto T,et al.[J]Hum Gene Ther,1998,9( 7):1093-1100.
[6]During MJ,Naegele JR,O′Malley,et al.[J]Science,1994,26 6(5189):1399-1403.
[7]Levine RA,Miller LP,Lovenberg W.[J]Science,1981,214(452 3):919-921.
[8]Mandel RJ,Rendahl KG,Spratt SK,et al.[J]J Neurosci,1998 ,18(11):4271-4284.
[9]Leff SE,Rendahl KG,Spratt SK,et al.[J]Exp Neurol,1998,151 (2):249-264.
, 百拇医药
[10]Schwarz EJ,Alexander GM,Prockop DJ,et al.[J]Hum Gene The r,1999,10(15):2539-2549.
[11]Kang UJ,Park DH,Wessel T,et al.[J]Neurosci lett,1992,14 7(1):53-57.
[12]Leff SE,Spratt SK,Snyder RO,et al.[J]Neuroscience,1999, 92(1):185-196.
[13]During MJ,Samulski RJ,Elsworth JD,et al.[J]Gene Ther,19 98,5(6):820-827.
[14]Erickson JD,Eiden LE,Hoffman BJ.[J]Proc Natl Acad Sci U SA,1992,89(22):10993-10997.
, 百拇医药
[15]Merickel A,Rosandich P,Peter D,et al.[J]J Biol Chem,1995 ,270(43):25798-25804.
[16]Lee WY,Chang JW,Nemeth NL,et al.[J]J Neurosci,1999,19(8) :3266-3274.
[17]Springer JE,Mu X,Bergmann LW,et al.[J]Exp Neurol,1994,12 7(2):167-170.
[18]Saarma M,Sariola H.[J]Microsc Res Tech,1999,45(4-5):29 2-302.
[19]Lindner MD,Winn SR,Baetge EE,et al.[J]Exp Neurol,1995,13 2(1):62-76.
, http://www.100md.com
[20]Sautter J,Tseng JL,Braguglia D,et al.[J]Exp Neurol, 1998,149(1):230-236.
[21]Connor B,Kozlowski DA,Schallert T,et al.[J]Gene Ther ,19 99,6(12):1936-1951.
[22]Deglon N,Tseng JL,Bensadoun,JC,et al.[J]Hum Gene Ther,20 00,11(1):179-190.
[23]Lapchak PA,Araujo DM,Hilt DC,et al.[J]Brain Res,1997,777 (1-2):153-160.
[24]Kojima H,Abiru Y,Sakajiri K,et al.[J]Biochem Biophys Res Commun,1997,238(2):569-573.
, 百拇医药
[25]Gomez-Pinilla F,Lee JW,Cotman CW.[J]Neuroscience,1994， 61(4):911-923.
[26]Tooyama I,Kawamata T,Walker D,et al.[J]Neurology,1993,43 (2):372-376.
[27]Zawada WM,David LK,Cohen JJ，et al.[J]Exp Neurol,1996, 140(1):60-67.
[28]Date I,Yoshimoto Y,Imaoka T,et al.[J]Brain Res,1993,621( 1):150-154.
[29]Zawada WM,Zastrow DJ,Clarkson ED,et al.[J]Brain Research ,1998,786(1-2):96-103.
, 百拇医药
[30]Takayama H,Ray J,Heather K，et al.[J]Nat Med,1995,1(1):5 3-58.
[31]Serrano-Sanchez T,Diaz-Armesto I.[J]Rev Neurol,1998,26 (154):1027-1032.
[32]Mogi M,Togari A,Kondo T,et al.[J]Neurosci Lett,1999,270( 1):45-48.
[33]Zhou J,Bradford HF,Stern GM,et al.[J]Brain Res Dev Brain Res,1997,100(1):43-51.
[34]Yoshimoto Y,Lin Q,Collier TJ,et al.[J]Brain Res ,1995,69 1(1-2):25-36.
, http://www.100md.com
[35]Levivier M,Przedborski S,Bencsics C,et al.[J]J Neurosci, 1995,15(12):7810-7820.
[36]Klein RL,Lewis MH,Muzyczka N,et al.[J]Brain Res,1999,847 (2):314-320.
[37]Tatton WG,Chalmers-Redman RM.[J]Ann Neurol,1998,4 4(3 suppl l):S134-141.
[38]Offen D,Beart PM,Cheung NS,et al.[J]Proc Natl Acad Sci U SA,1998,95(10):5789-5794.
[39]Offen D,Ziv I,Panet H,et al.[J]Cell Mol Neurobiol,1997,1 7(3):289-304.
[40]Anton R,Kordower JH,Kane DJ,et al.[J]Cell Transplant,199 5,4(1):49-54.
[41]Barkats M,Nakao N,Grasbon-Frodl EM,et al.[J]Neuroscienc e,1997,78(3):703-713.
【收稿日期】2000-07-17
请看PDF全文, 百拇医药