灭活CVB1在离体骨骼肌细胞中基因转移的研究
作者：陈国俊 汪学文 张成 刘焯霖 陈元 方丹云
单位：中山医科大学附属第一医院神经科， 广东 广州 510080
关键词：柯萨奇病毒B组；肌；骨骼；基因转移
00zk06
摘 要：【目的】 研究灭活后的柯萨奇病毒B1在原代培养骨骼肌细胞中对报道基因pCDNA3-LacZ转移效率的影响。【方法】 ①用聚乙二醇沉淀和蔗糖低温超速离心法提纯并用β-丙内酯灭活病毒；②分别用不同浓度的转铁蛋白聚赖氨酸(TfpL)+LacZ、灭活CVB1+LacZ以及灭活CVB1+TfpL+LacZ在肌肉细胞进行基因转移，以报告基因产物β-半乳糖苷酶染色阳性的细胞数作为基因转移效率指标。【结果】 灭活CVB1+TfpL+LacZ在肌肉细胞中使基因转移效率由TfpL+LacZ组的不到1%提高到15%～20%。【结论】 灭活CVB1也能象腺病毒一样促进基因转移，CVB1的嗜肌肉特性为在肌肉组织中研究靶向明确的新载体提供了实验依据。
, 百拇医药
中图分类号： R375 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0022-03
Gene Transfer Efficiency Enhancement by Inactivated Coxsakie B1 Virus in Skeletal Muscle Cells in Vitro
CHEN Guo-jun, WANG Xue-wen, ZHANG Cheng, LIU Zhuo-lin, CHEN Yuan, FANG Dan-yun
(Department of Neurology, First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China)
, 百拇医药
Astract: 【Objective】 To study the effect of inactivated Coxsackie virus B1, which was considered to have high affinity to skeletal muscle cells, on gene transfer efficiency of reporter gene, pCDNA3-LacZ, in primary muscle cells. 【Methods】 ① Virus was purified by polyethylene sedimentation followed by sucrose supercentrifugation, ② Transferrin-polylysine (TfpL)+LacZ, inactivated CVB1+LacZ and inactivated CVB1+TfpL+LacZ were designed in different concentrations for the use of gene transfer, then, positive cells contained β-galactosidase were calculated as gene transfer efficiency. 【Results】 Inactivated CVB1 enhanced gene transfer efficiency from less than 1% in TfpL+LacZ group to 15%～20% per cent in CVB1+ TfpL+LacZ group. 【Conclusions】 Like adenovirus, inactivated CVB1 can also increase gene transfer efficiency in muscle cells, which provides experimental basis for constructing new vector targeting to muscle cells.
, 百拇医药
Key words: Coxsackie virus B groups; muscle, skeletal; gene transfer
在肌肉细胞的基因转移中，目前最常用的是腺病毒(adenovirus,AV)载体。AV降解溶酶体的特性，还促进了在HeLa细胞中转铁蛋白(transferrin,Tf)—聚赖氨酸(polylysine,pL)介导的报道基因转移，效率比TfpL-DNA复合物提高了1 000倍。更有意义的是，在肌细胞中采用该法将灭活AV携带报道基因获得成功，并且宿主的排异反应大为降低，报道基因表达时间延长而基因转移效率并没有明显降低[1]。但AV载体靶细胞范围广泛也正意味着对肌细胞的特异性不高。柯萨奇B1病毒(Coxsackie virus B1,CVB1)是一种小而无囊膜的单链正股RNA病毒，直径为28 nm，现已将CVB1用来制备稳定的实验性肌炎模型。已经证明CVB1具有嗜肌肉特性并认为与病毒的外壳蛋白有关[2]。目前尚不能将CVB1制成疫苗，为此，我们将灭活CVB1、TfpL和报道基因pCDNA3-LacZ设计成不同浓度和不同组合，在原代培养骨骼肌细胞中进行了基因转移研究，希望在靶向于肌肉细胞的基因治疗中探索一种新思路。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 CVB1病毒
购自预防医学科学院毒种室。质粒：pCDNA3-LacZ长约8 kb，由CMV启动子驱动，本室保存。TfpL为Sigma公司产品。
1.2 CVB1提纯和灭活
参照Novotny和Mapoles[3]报道的方法加以修改。简言之，聚乙二醇沉淀法将病毒悬液初步浓缩；在10%～50%蔗糖梯度中上样，低温超速分步离心；电镜观察并做病毒活性测定；β-丙内酯(β-propiolactone,BPL)20 mL/L浓度灭活，测定残存毒力[4]。
1.3 原代骨骼肌细胞培养
取1～3 d新生SD大鼠，断头处死，消毒并取前后肢，去皮去骨并剪碎,胰酶消化30～60 min， 50 μm不锈钢网过滤，常温下1 000 r/min离心10 min。无血清混合培养基重悬，计数并接种于6孔板内，每孔105个细胞。前3 d每天换液(F-10：DMEM高糖培养基=50∶50，100 mL/L小牛血清)，3 d后隔天换液。
, http://www.100md.com
1.4 基因转移试验
①肌细胞培养至第3天时，细胞约50%～80%融合，试验前吸去培养基，用无血清培养基洗1次；②Ⅰ液为pCDNA3分别按3、6、15和50 μg溶于20 mmol/L HEPES(含有150 mmol/L NaCl) 100 μL中；Ⅱ液为TfpL分别按10、20和30 μg溶于20 mmol/L HEPES(含有150 mmol/L NaCl) 100 μL中。实验之前取溶液Ⅱ缓慢逐滴加入溶液Ⅰ中，总量达200 μL，室温静置30 min。③将上述液体加入6孔板内的细胞中，然后加800 μL无血清混合培养基，随后各加入6、10和20 μL的灭活CVB1液(6.4×1015病毒颗粒/L)，对照组加入同体积的病毒贮存液。37 ℃继续培养4～6 h，取出后加入12.5%的混合培养基4 mL，继续培养20 h。④换液继续培养24 h。
1.5 X-gal染色和阳性细胞计数
, http://www.100md.com
X-gal染色参照Trivedi[5]的方法。阳性细胞计数：每个显微镜视野计取每1 000个细胞中X-gal染色阳性的肌细胞数。
2 结 果
2.1 各种浓度的质粒和TfpL对转染效率的影响
经酚-氯仿提取后的质粒能满足一般的基因转移需要。本实验中15 μg DNA与10 μg TfpL组合时出现了1%～2%的阳性细胞(其它浓度的组合则未显示出阳性细胞)。即DNA与TfpL之比为3∶2(图1)。由图可见，被染蓝的部分位于细胞浆内，细胞形态保持良好(箭头所指,下同)。
图1 TfpL组出现1%～2%的阳性细胞
Fig.1 1%～2% positive cells in TfpL group
, 百拇医药
X-gal staining(×40)
2.2 CVB1与TfpL协同作用
10 μL CVB1(6.4×1010病毒颗粒)+15 μg DNA产生了5%左右的阳性细胞(图2)。当15 μgDNA、10 μg TfpL与10 μL CVB1一起加进骨骼肌细胞时，被染蓝的细胞数增加到15%～20%(图3)。CVB1促进了TfpL在肌细胞中受体介导的基因转移。质粒DNA、TfpL与CVB1的不同组合对基因转移效率的影响见表1。
图2 CVB1组出现5%的阳性细胞
Fig.2 5% positive cells in TfpL group
, http://www.100md.com
X-gal staining(×10)
图3 CVB1+TfpL组阳性细胞增至15%～20%
Fig.3 Positive cells increased to 15%～20%
in CVB1+TfpL group
3.1 X-gal staining(×10), 3.2 X-gal staining(×40)
表1 质粒DNA、TfpL与CVB1不同组合的基因转移效率
Table 1 Gene transfer efficiency of different combinations
, 百拇医药
of DNA,TfpL and CVB1 Different combinations
Percentage of positive cells
pCDNA3lacZ+TfpL
1%～2%
pCDNA3lacZ+CVB1
5%
pCDNA3lacZ+TfpL+CVB1
15%～20%
3 讨 论
实验中，单纯质粒DNA用至50 μg都未获得阳性结果，TfpL组的转移效率仅为1%左右。可能与肌细胞肌膜屏障有关，但确切原因还不清楚。CVB1组获得了5%的阳性细胞，说明CVB1具有促进基因转移的作用，已经证明，CVB1感染在HEP-2细胞中能增加细胞通透性，促进细菌入侵。灭活CVB1与TfpL共同作用，使转移效率增加到15%～20%，推测CVB1使肌细胞对DNA摄取增加，或可能降低了溶酶体对外源物质破坏的能力。
, http://www.100md.com
实验说明，灭活CVB1也能象灭活AV一样促进基因转移，用灭活CVB1构建的载体，体积小于AV复合物，有可能在越过细胞的分子屏障中发挥优于AV的作用。灭活CVB1同时避免了因活病毒复制所引起的免疫损伤，由此构建的CVB1-pL-DNA复合物同时具有靶向明确和促进基因转移的特点，简单操作，提高效率。实验的意义还在于，用组织特异性灭活病毒作载体，将作为一种新思路，不仅为肌肉病，而且还为其它组织疾病的基因治疗如灭活肝炎病毒治疗肝癌，灭活脑炎病毒治疗脑组织退行性疾病提供了一种靶向明确的高效的基因转移方法。
(编辑 刘清海)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800045)；广东省自然科学基金博士启动基金资助项目(994041)
作者简介：陈国俊(1964-)，男，江苏杨州人，博士，讲师，主要研究肌营养不良症基因转移；汪学文，深圳南山区人民医院；陈 元、方丹云，本校微生物学教研室.
, http://www.100md.com
参考文献：
[1] Petrof B J, Lochmuller H, Massie B, et al. Impairment of force generationafter adenovirus-mediated gene transfer to muscle is alleviated by adenoviral gene inactivation and host CD8+ T cell deficiency[J]. Hum Gene Ther, 1996,7(15):1913.
[2] Tam P E, Schmidt A M, Ytterberg S R, et al. Duration of virus persistence and its relationship to inflammation in the chronic phase of Coxsackie virus B1-induced murine polymyositis[J]. J Lab Clin Med 1994,123(3):346.
, 百拇医药
[3] Novotny J, Avobodva J, Ransnas L A, et al. A method for the preparation of purified antigens of Coxsackie B3 virus from a large volume of cell culture supernatant[J]. Acta Virol, 1992,36(4):483.
[4] 姜述德,Pye D.β-丙内酯灭活脊髓灰质炎病毒[J].中华微生物学与免疫学杂志，1985,5(2)：92.
[5] Trivedi R A, Dickson G. Liposome-mediated gene transfer into normal and dystrophin-deficient mouse myoblast[J]. J Neuochem, 1995,64(5):2230
收稿日期：2000-04-26, http://www.100md.com
单位：中山医科大学附属第一医院神经科， 广东 广州 510080
关键词：柯萨奇病毒B组；肌；骨骼；基因转移
00zk06
摘 要：【目的】 研究灭活后的柯萨奇病毒B1在原代培养骨骼肌细胞中对报道基因pCDNA3-LacZ转移效率的影响。【方法】 ①用聚乙二醇沉淀和蔗糖低温超速离心法提纯并用β-丙内酯灭活病毒；②分别用不同浓度的转铁蛋白聚赖氨酸(TfpL)+LacZ、灭活CVB1+LacZ以及灭活CVB1+TfpL+LacZ在肌肉细胞进行基因转移，以报告基因产物β-半乳糖苷酶染色阳性的细胞数作为基因转移效率指标。【结果】 灭活CVB1+TfpL+LacZ在肌肉细胞中使基因转移效率由TfpL+LacZ组的不到1%提高到15%～20%。【结论】 灭活CVB1也能象腺病毒一样促进基因转移，CVB1的嗜肌肉特性为在肌肉组织中研究靶向明确的新载体提供了实验依据。
, 百拇医药
中图分类号： R375 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0022-03
Gene Transfer Efficiency Enhancement by Inactivated Coxsakie B1 Virus in Skeletal Muscle Cells in Vitro
CHEN Guo-jun, WANG Xue-wen, ZHANG Cheng, LIU Zhuo-lin, CHEN Yuan, FANG Dan-yun
(Department of Neurology, First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China)
, 百拇医药
Astract: 【Objective】 To study the effect of inactivated Coxsackie virus B1, which was considered to have high affinity to skeletal muscle cells, on gene transfer efficiency of reporter gene, pCDNA3-LacZ, in primary muscle cells. 【Methods】 ① Virus was purified by polyethylene sedimentation followed by sucrose supercentrifugation, ② Transferrin-polylysine (TfpL)+LacZ, inactivated CVB1+LacZ and inactivated CVB1+TfpL+LacZ were designed in different concentrations for the use of gene transfer, then, positive cells contained β-galactosidase were calculated as gene transfer efficiency. 【Results】 Inactivated CVB1 enhanced gene transfer efficiency from less than 1% in TfpL+LacZ group to 15%～20% per cent in CVB1+ TfpL+LacZ group. 【Conclusions】 Like adenovirus, inactivated CVB1 can also increase gene transfer efficiency in muscle cells, which provides experimental basis for constructing new vector targeting to muscle cells.
, 百拇医药
Key words: Coxsackie virus B groups; muscle, skeletal; gene transfer
在肌肉细胞的基因转移中，目前最常用的是腺病毒(adenovirus,AV)载体。AV降解溶酶体的特性，还促进了在HeLa细胞中转铁蛋白(transferrin,Tf)—聚赖氨酸(polylysine,pL)介导的报道基因转移，效率比TfpL-DNA复合物提高了1 000倍。更有意义的是，在肌细胞中采用该法将灭活AV携带报道基因获得成功，并且宿主的排异反应大为降低，报道基因表达时间延长而基因转移效率并没有明显降低[1]。但AV载体靶细胞范围广泛也正意味着对肌细胞的特异性不高。柯萨奇B1病毒(Coxsackie virus B1,CVB1)是一种小而无囊膜的单链正股RNA病毒，直径为28 nm，现已将CVB1用来制备稳定的实验性肌炎模型。已经证明CVB1具有嗜肌肉特性并认为与病毒的外壳蛋白有关[2]。目前尚不能将CVB1制成疫苗，为此，我们将灭活CVB1、TfpL和报道基因pCDNA3-LacZ设计成不同浓度和不同组合，在原代培养骨骼肌细胞中进行了基因转移研究，希望在靶向于肌肉细胞的基因治疗中探索一种新思路。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 CVB1病毒
购自预防医学科学院毒种室。质粒：pCDNA3-LacZ长约8 kb，由CMV启动子驱动，本室保存。TfpL为Sigma公司产品。
1.2 CVB1提纯和灭活
参照Novotny和Mapoles[3]报道的方法加以修改。简言之，聚乙二醇沉淀法将病毒悬液初步浓缩；在10%～50%蔗糖梯度中上样，低温超速分步离心；电镜观察并做病毒活性测定；β-丙内酯(β-propiolactone,BPL)20 mL/L浓度灭活，测定残存毒力[4]。
1.3 原代骨骼肌细胞培养
取1～3 d新生SD大鼠，断头处死，消毒并取前后肢，去皮去骨并剪碎,胰酶消化30～60 min， 50 μm不锈钢网过滤，常温下1 000 r/min离心10 min。无血清混合培养基重悬，计数并接种于6孔板内，每孔105个细胞。前3 d每天换液(F-10：DMEM高糖培养基=50∶50，100 mL/L小牛血清)，3 d后隔天换液。
, http://www.100md.com
1.4 基因转移试验
①肌细胞培养至第3天时，细胞约50%～80%融合，试验前吸去培养基，用无血清培养基洗1次；②Ⅰ液为pCDNA3分别按3、6、15和50 μg溶于20 mmol/L HEPES(含有150 mmol/L NaCl) 100 μL中；Ⅱ液为TfpL分别按10、20和30 μg溶于20 mmol/L HEPES(含有150 mmol/L NaCl) 100 μL中。实验之前取溶液Ⅱ缓慢逐滴加入溶液Ⅰ中，总量达200 μL，室温静置30 min。③将上述液体加入6孔板内的细胞中，然后加800 μL无血清混合培养基，随后各加入6、10和20 μL的灭活CVB1液(6.4×1015病毒颗粒/L)，对照组加入同体积的病毒贮存液。37 ℃继续培养4～6 h，取出后加入12.5%的混合培养基4 mL，继续培养20 h。④换液继续培养24 h。
1.5 X-gal染色和阳性细胞计数
, http://www.100md.com
X-gal染色参照Trivedi[5]的方法。阳性细胞计数：每个显微镜视野计取每1 000个细胞中X-gal染色阳性的肌细胞数。
2 结 果
2.1 各种浓度的质粒和TfpL对转染效率的影响
经酚-氯仿提取后的质粒能满足一般的基因转移需要。本实验中15 μg DNA与10 μg TfpL组合时出现了1%～2%的阳性细胞(其它浓度的组合则未显示出阳性细胞)。即DNA与TfpL之比为3∶2(图1)。由图可见，被染蓝的部分位于细胞浆内，细胞形态保持良好(箭头所指,下同)。
图1 TfpL组出现1%～2%的阳性细胞
Fig.1 1%～2% positive cells in TfpL group
, 百拇医药
X-gal staining(×40)
2.2 CVB1与TfpL协同作用
10 μL CVB1(6.4×1010病毒颗粒)+15 μg DNA产生了5%左右的阳性细胞(图2)。当15 μgDNA、10 μg TfpL与10 μL CVB1一起加进骨骼肌细胞时，被染蓝的细胞数增加到15%～20%(图3)。CVB1促进了TfpL在肌细胞中受体介导的基因转移。质粒DNA、TfpL与CVB1的不同组合对基因转移效率的影响见表1。
图2 CVB1组出现5%的阳性细胞
Fig.2 5% positive cells in TfpL group
, http://www.100md.com
X-gal staining(×10)
图3 CVB1+TfpL组阳性细胞增至15%～20%
Fig.3 Positive cells increased to 15%～20%
in CVB1+TfpL group
3.1 X-gal staining(×10), 3.2 X-gal staining(×40)
表1 质粒DNA、TfpL与CVB1不同组合的基因转移效率
Table 1 Gene transfer efficiency of different combinations
, 百拇医药
of DNA,TfpL and CVB1 Different combinations
Percentage of positive cells
pCDNA3lacZ+TfpL
1%～2%
pCDNA3lacZ+CVB1
5%
pCDNA3lacZ+TfpL+CVB1
15%～20%
3 讨 论
实验中，单纯质粒DNA用至50 μg都未获得阳性结果，TfpL组的转移效率仅为1%左右。可能与肌细胞肌膜屏障有关，但确切原因还不清楚。CVB1组获得了5%的阳性细胞，说明CVB1具有促进基因转移的作用，已经证明，CVB1感染在HEP-2细胞中能增加细胞通透性，促进细菌入侵。灭活CVB1与TfpL共同作用，使转移效率增加到15%～20%，推测CVB1使肌细胞对DNA摄取增加，或可能降低了溶酶体对外源物质破坏的能力。
, http://www.100md.com
实验说明，灭活CVB1也能象灭活AV一样促进基因转移，用灭活CVB1构建的载体，体积小于AV复合物，有可能在越过细胞的分子屏障中发挥优于AV的作用。灭活CVB1同时避免了因活病毒复制所引起的免疫损伤，由此构建的CVB1-pL-DNA复合物同时具有靶向明确和促进基因转移的特点，简单操作，提高效率。实验的意义还在于，用组织特异性灭活病毒作载体，将作为一种新思路，不仅为肌肉病，而且还为其它组织疾病的基因治疗如灭活肝炎病毒治疗肝癌，灭活脑炎病毒治疗脑组织退行性疾病提供了一种靶向明确的高效的基因转移方法。
(编辑 刘清海)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800045)；广东省自然科学基金博士启动基金资助项目(994041)
作者简介：陈国俊(1964-)，男，江苏杨州人，博士，讲师，主要研究肌营养不良症基因转移；汪学文，深圳南山区人民医院；陈 元、方丹云，本校微生物学教研室.
, http://www.100md.com
参考文献：
[1] Petrof B J, Lochmuller H, Massie B, et al. Impairment of force generationafter adenovirus-mediated gene transfer to muscle is alleviated by adenoviral gene inactivation and host CD8+ T cell deficiency[J]. Hum Gene Ther, 1996,7(15):1913.
[2] Tam P E, Schmidt A M, Ytterberg S R, et al. Duration of virus persistence and its relationship to inflammation in the chronic phase of Coxsackie virus B1-induced murine polymyositis[J]. J Lab Clin Med 1994,123(3):346.
, 百拇医药
[3] Novotny J, Avobodva J, Ransnas L A, et al. A method for the preparation of purified antigens of Coxsackie B3 virus from a large volume of cell culture supernatant[J]. Acta Virol, 1992,36(4):483.
[4] 姜述德,Pye D.β-丙内酯灭活脊髓灰质炎病毒[J].中华微生物学与免疫学杂志，1985,5(2)：92.
[5] Trivedi R A, Dickson G. Liposome-mediated gene transfer into normal and dystrophin-deficient mouse myoblast[J]. J Neuochem, 1995,64(5):2230
收稿日期：2000-04-26, http://www.100md.com