胃癌中MTS1基因异常甲基化的研究
作者：全欣鑫 黄志明 周晓东 姚学军
单位：全欣鑫 黄志明 周晓东(中山医科大学孙逸仙纪念医院医学研究中心， 广东 广州 510120)；姚学军(湖北医科大学病毒研究所， 湖北 武汉 430071)
关键词：胃肿瘤；MTS1基因；甲基化；灭活机制
00zk31
摘 要：【目的】 探讨多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor gene 1, MTS1) 5′端CpG岛异常甲基化与原发性胃癌发病机制之间的关系。【方法】 PCR-甲基化检测法研究31例胃癌标本和19例正常胃组织中MTS1基因5′端CpG岛异常甲基化情况。【结果】 有35.5%(11/31)的胃癌标本和5.3%(1/19)正常胃组织出现MTS1基因5′端CpG岛异常甲基化，两者之间有显著性差异(P<0.05)。【结论】 MTS1基因5′端CpG岛异常甲基化是其在原发性胃癌中的主要灭活机制，与胃癌的发生发展密切相关。
, http://www.100md.com
中图分类号： R697.32 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0109-03
Inactivation of the Multiple Tumor Suppressor Gene 1(MTS1) by de novoMethylation in Human Primary Gastric Cancer
QUAN Xin-xin, HUANG Zhi-ming, ZHOU Xiao-dong,( Lin Bai-xin Research Center Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120, China)
YAO Xue-jun
, http://www.100md.com (Department of Virology, Hubei Medical University, Wuhan 430071, China)
Abstract:【Objective】 To study the 5′ CpG islands methylation of the multiple tumor suppressor gene 1(MTS1) gene in human primary gastric cancer. 【Methods】 A PCR assay relying on the inability of some restriction enzymes to cut methylated sequences was used to analyze the methylation of the MTS1 gene. 【Results】 de novo methylation of the MTS1 gene was observed in 11 of 31(35.5%) primary gastric cancer cases and in 1 of 19(5.3%) normal gastric mucosa, and there is a significant correlation (P<0.05) between them. 【Conclusion】 Our results suggest that de novo methylation are prodominant inactivation mechanisms of the MTS1 gene and may be associated with pathogenesis of human primary gastric cancinoma.
, http://www.100md.com
Key words: gastric carcinoma; MTS1 gene; de novo methylation; inactivation
胃癌的发生发展是一个多基因参与的多阶段过程，其分子生物学水平的发病机制尚不完全清楚。有关近年发现的多肿瘤抑制基因 (multiple tumor suppressor gene 1) MTS1与原发性胃癌的关系有待研究。我们在检测了MTS1基因在原发性胃癌中突变缺失的基础上，进一步研究了胃癌组织中MTS1基因CpG岛(启动子区富含C、G的序列)甲基化的情况。
1 材料与方法
1.1 组织标本
31例原发性胃癌和19例正常胃的组织标本是收集1997年6月～1998年3月期间湖北医科大学附属第一、第二医院手术切除的标本。切除标本在1h内放入液氮或-70℃中保存。所有病例均经病理证实。
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1.2 PCR-SSCP分析
常规提取组织DNA后，用光密度测量法测量DNA含量，PCR扩增MTS1基因α、β型外显子1(E1α、E1β)和外显子2(E2)，引物序列和扩增条件按文献[1，2]。扩增产物经甲酰胺变性后，5%(v/v)聚丙烯酰胺凝胶电泳300 V，1.5 h，乙醇固定、硝酸脱色，硝酸银染色，在干胶仪上干胶后保存。
1.3 PCR-甲基化检测法
1 μg组织DNA用40 U甲基化敏感酶(HpaⅡ 37 ℃和SmaⅠ 30 ℃)完全消化2 h，同时用40 U甲基化非敏感酶(MspⅠ 37 ℃)消化2 h作为对照。消化后的DNA进行MTS1基因α、β型外显子1(E1α、E1β)的PCR扩增，扩增引物和循环条件参见有关文献，产物经EB染色，20 g/L琼脂糖电泳，荧光灯下观察结果。统计学分析采用χ2检验。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 MTS1基因的PCR-SSCP分析
对所有PCR扩增结果阳性的标本作SSCP分析，发现无1例标本的MTS1基因外显子1(E1α、E1β)和外显子2(E2)有异常电泳带，提示胃癌组织中未见有该基因的微小突变。
2.2 MTS1基因异常甲基化情况
MTS1基因发生异常甲基化的标本，MTS1序列不能被甲基化敏感酶切割，PCR扩增MTS1基因外显子，产物为阳性，而甲基化非敏感酶则可以切开此序列，PCR扩增无产物；MTS1基因没有被异常甲基化的标本用甲基化敏感酶和甲基化非敏感酶均可切割，PCR扩增MTS1基因外显子则均无产物。
2.3 胃癌组织异常甲基化分析
31例胃癌组织中有11例(35.5%)发生MTS1基因外显子1甲基化，其中5例(16.1%)在SmaⅠ位点发生异常甲基化，另外6(19.4%)例在SmaⅠ和HpaⅡ位点均有异常甲基化(图1)；19例正常胃粘膜组织中只有1例发生SmaⅠ位点甲基化，胃癌与正常组织之间比较有显著性差异(P<0.05)(表1)。
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3 讨 论
3.1 启动子区CpG岛异常甲基化与mRNA转录抑制
图1 胃癌组织MTS1基因PCR-甲基化检测
Fig.1 PCR-based methylation assay results of MTS1 gene
in gastric cancer tissues
M: Marker
1,3,5～9,16 have no de novo methylation of MTS1 gene , so that PCR-based Methylation Assay showed negative PCR productions
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2,4,10～15,17 have hypermethylation of MTS1 gene so that PCR-based Methylation Assay showed positive PCR productions
表1 原发性胃癌与正常胃粘膜中MTS1基因
异常甲基化的比较
Table 1 de nove methylation of MTS1 gene in primary
gastric cancer and normal tissues n(%) MTS1
Methylation
Gastric Cancer
, 百拇医药
Control
χ2
P
+
11(35.5)
1(5.3)
-
20(64.5)
18(94.7)
4.36
<0.05
Total
31
, 百拇医药
19
肿瘤组织DNA常常有异常甲基化的作用，包括与细胞增殖周期密切相关的癌基因低甲基化和抑癌基因高甲基化改变，这些异常甲基化改变一方面可激活癌基因，另一方面可使抑癌基因由于5′端启动子调控区CpG岛异常高甲基化而抑制mRNA转录作用[3,4]，导致该基因的失活。
3.2 MTS1基因CpG岛异常甲基化是其在胃癌中的主要灭活机制
多肿瘤抑制基因MTS1在人的众多类型的恶性肿瘤中有高频率的变异，包括突变、缺失甲基化[5,6]、染色体易位等，这些变异导致该基因的正常抑制细胞增殖的功能丧失(即灭活或失活)与癌的发生发展密切相关。但MTS1基因在原发性胃癌中的变异情况却报道较少，并且缺失率较低，没有发现突变的存在，提示可能MTS1基因在胃癌组织中有其他的失活机制[7]。为探讨抑癌基因MTS1与原发性胃癌的关系及其在胃癌中的灭活机制，我们在用PCR-SSCP法研究了胃癌组织中MTS1基因突变缺失的基础上，首次检测了胃癌和正常胃粘膜组织中MTS1基因5′端CpG岛异常甲基化的情况。CpG岛为启动子区一段富含C和G的序列，该序列的甲基化状态与其转录水平密切相关。CpG岛的高甲基化可抑制该基因的转录。抑癌基因启动子区CpG岛如存在异常高甲基化，则可由于该基因的转录抑制而导致功能失活。 本检测结果发现35.5%的原发性胃癌有MTS1基因5′端CpG岛异常甲基化现象，与正常胃组织相比有显著性差异(P<0.05)，说明胃癌中有MTS1基因的变异，5′端CpG岛异常甲基化是其在胃癌中的主要灭活机制。
, 百拇医药
3.3 PCR-甲基化检测法的影响因素
PCR-甲基化检测法[8]的原理是根据一些限制性内切酶的识别位点都包含CG，如果C被甲基化后，切割作用则不能产生。PCR扩增这一序列，未被切割的为扩增阳性，反之则为阴性。甲基化敏感酶HpaⅡ和SmaⅠ只能切割CCGG和CCCGGG序列，而不能切割CmCGG和CCmCGGG序列；甲基化非敏感酶Mps Ⅰ则可切割CCGG和CmCGG序列而作为对照。此法检测序列5′端CpG岛异常甲基化现象灵敏度高，但可能由于酶切不完全而出现假阳性。本研究用过量的酶量(每1 μg DNA加40 U酶)完全消化组织DNA以避免出现假阳性结果。实验结果表明在胃癌中MTS1基因甲基化的序列主要在CmCGG和CCmCGGG。
本实验：①首次检测了原发性胃癌和正常胃粘膜组织中MTS1基因5′端CpG岛异常甲基化的情况；②首次发现35.5%的胃癌有MTS1基因异常甲基化，与正常胃组织相比有显著性差异(P<0.05)，认为MTS1基因甲基化与原发性胃癌的发生发展密切相关，CpG岛异常甲基化是MTS1基因在胃癌中的主要失活机制；③胃癌中MTS1基因甲基化的序列主要为CmCGG和CCmCGGG。
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基金项目：广东省博士后基金资助项目(1999年)
作者简介：全欣鑫(1972-)，女，陕西蒲城人，医学博士, 博士后, 主治医师；现在中山医科大学孙逸仙纪念医院博士后流动站工作；主要研究：①消化系肿瘤的发病机制与治疗，②丙型肝炎病毒的复制机理.
参考文献：
[1] Kamb A,Gruis N A,Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types[J].Science,1994,264(15):436.
[2] Mao L, Merio A, Bedi G, et al. A novel p16INK4A transcript[J]. Cancer Res. 1995, 55: 2995.
, http://www.100md.com
[3] Costello J F, Berger M S, Huang H S, et al. Silencing of p16/CDKN2 expression in human gliomas by methylation and chromatin condensation[J]. Cancer Res. 1996, 56: 2405.
[4] Gonzalez-Zulueta M, Bender C M, Yang A S, et al. Methylation of 5′ CpG island of the p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing[J]. Cancer Res. 1995, 55: 4531.
[5] Herman J G, Merlo A, Mao L, et al. Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers[J]. Cancer Res. 1995, 55: 4525.
, 百拇医药
[6] Reed A L, Califano J, Cairns P, et al. High frequency of p16(CDKN2/MTS1/INK4A) inactivation in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Cancer Res, 1996, 56: 3630.
[7] Sakata K, Tamura G, Maesawa C, et al. Loss of heterozygosity on the short arm of chromosome 9 without p16 gene mutation in gastric carcinomas[J]. Jpn J Cancer Res, 1995, 86(12): 333.
[8] Maesawa C, Tamura G, Nishizuka S, et al. Inactivation of the CDKN2 gene by homozygous deletion and de novo methylation is associated with advanced stage esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer Res, 1996, 56: 3875.
收稿日期：2000-03-20, 百拇医药
单位：全欣鑫 黄志明 周晓东(中山医科大学孙逸仙纪念医院医学研究中心， 广东 广州 510120)；姚学军(湖北医科大学病毒研究所， 湖北 武汉 430071)
关键词：胃肿瘤；MTS1基因；甲基化；灭活机制
00zk31
摘 要：【目的】 探讨多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor gene 1, MTS1) 5′端CpG岛异常甲基化与原发性胃癌发病机制之间的关系。【方法】 PCR-甲基化检测法研究31例胃癌标本和19例正常胃组织中MTS1基因5′端CpG岛异常甲基化情况。【结果】 有35.5%(11/31)的胃癌标本和5.3%(1/19)正常胃组织出现MTS1基因5′端CpG岛异常甲基化，两者之间有显著性差异(P<0.05)。【结论】 MTS1基因5′端CpG岛异常甲基化是其在原发性胃癌中的主要灭活机制，与胃癌的发生发展密切相关。
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中图分类号： R697.32 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0109-03
Inactivation of the Multiple Tumor Suppressor Gene 1(MTS1) by de novoMethylation in Human Primary Gastric Cancer
QUAN Xin-xin, HUANG Zhi-ming, ZHOU Xiao-dong,( Lin Bai-xin Research Center Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120, China)
YAO Xue-jun
, http://www.100md.com (Department of Virology, Hubei Medical University, Wuhan 430071, China)
Abstract:【Objective】 To study the 5′ CpG islands methylation of the multiple tumor suppressor gene 1(MTS1) gene in human primary gastric cancer. 【Methods】 A PCR assay relying on the inability of some restriction enzymes to cut methylated sequences was used to analyze the methylation of the MTS1 gene. 【Results】 de novo methylation of the MTS1 gene was observed in 11 of 31(35.5%) primary gastric cancer cases and in 1 of 19(5.3%) normal gastric mucosa, and there is a significant correlation (P<0.05) between them. 【Conclusion】 Our results suggest that de novo methylation are prodominant inactivation mechanisms of the MTS1 gene and may be associated with pathogenesis of human primary gastric cancinoma.
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Key words: gastric carcinoma; MTS1 gene; de novo methylation; inactivation
胃癌的发生发展是一个多基因参与的多阶段过程，其分子生物学水平的发病机制尚不完全清楚。有关近年发现的多肿瘤抑制基因 (multiple tumor suppressor gene 1) MTS1与原发性胃癌的关系有待研究。我们在检测了MTS1基因在原发性胃癌中突变缺失的基础上，进一步研究了胃癌组织中MTS1基因CpG岛(启动子区富含C、G的序列)甲基化的情况。
1 材料与方法
1.1 组织标本
31例原发性胃癌和19例正常胃的组织标本是收集1997年6月～1998年3月期间湖北医科大学附属第一、第二医院手术切除的标本。切除标本在1h内放入液氮或-70℃中保存。所有病例均经病理证实。
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1.2 PCR-SSCP分析
常规提取组织DNA后，用光密度测量法测量DNA含量，PCR扩增MTS1基因α、β型外显子1(E1α、E1β)和外显子2(E2)，引物序列和扩增条件按文献[1，2]。扩增产物经甲酰胺变性后，5%(v/v)聚丙烯酰胺凝胶电泳300 V，1.5 h，乙醇固定、硝酸脱色，硝酸银染色，在干胶仪上干胶后保存。
1.3 PCR-甲基化检测法
1 μg组织DNA用40 U甲基化敏感酶(HpaⅡ 37 ℃和SmaⅠ 30 ℃)完全消化2 h，同时用40 U甲基化非敏感酶(MspⅠ 37 ℃)消化2 h作为对照。消化后的DNA进行MTS1基因α、β型外显子1(E1α、E1β)的PCR扩增，扩增引物和循环条件参见有关文献，产物经EB染色，20 g/L琼脂糖电泳，荧光灯下观察结果。统计学分析采用χ2检验。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 MTS1基因的PCR-SSCP分析
对所有PCR扩增结果阳性的标本作SSCP分析，发现无1例标本的MTS1基因外显子1(E1α、E1β)和外显子2(E2)有异常电泳带，提示胃癌组织中未见有该基因的微小突变。
2.2 MTS1基因异常甲基化情况
MTS1基因发生异常甲基化的标本，MTS1序列不能被甲基化敏感酶切割，PCR扩增MTS1基因外显子，产物为阳性，而甲基化非敏感酶则可以切开此序列，PCR扩增无产物；MTS1基因没有被异常甲基化的标本用甲基化敏感酶和甲基化非敏感酶均可切割，PCR扩增MTS1基因外显子则均无产物。
2.3 胃癌组织异常甲基化分析
31例胃癌组织中有11例(35.5%)发生MTS1基因外显子1甲基化，其中5例(16.1%)在SmaⅠ位点发生异常甲基化，另外6(19.4%)例在SmaⅠ和HpaⅡ位点均有异常甲基化(图1)；19例正常胃粘膜组织中只有1例发生SmaⅠ位点甲基化，胃癌与正常组织之间比较有显著性差异(P<0.05)(表1)。
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3 讨 论
3.1 启动子区CpG岛异常甲基化与mRNA转录抑制
图1 胃癌组织MTS1基因PCR-甲基化检测
Fig.1 PCR-based methylation assay results of MTS1 gene
in gastric cancer tissues
M: Marker
1,3,5～9,16 have no de novo methylation of MTS1 gene , so that PCR-based Methylation Assay showed negative PCR productions
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2,4,10～15,17 have hypermethylation of MTS1 gene so that PCR-based Methylation Assay showed positive PCR productions
表1 原发性胃癌与正常胃粘膜中MTS1基因
异常甲基化的比较
Table 1 de nove methylation of MTS1 gene in primary
gastric cancer and normal tissues n(%) MTS1
Methylation
Gastric Cancer
, 百拇医药
Control
χ2
P
+
11(35.5)
1(5.3)
-
20(64.5)
18(94.7)
4.36
<0.05
Total
31
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19
肿瘤组织DNA常常有异常甲基化的作用，包括与细胞增殖周期密切相关的癌基因低甲基化和抑癌基因高甲基化改变，这些异常甲基化改变一方面可激活癌基因，另一方面可使抑癌基因由于5′端启动子调控区CpG岛异常高甲基化而抑制mRNA转录作用[3,4]，导致该基因的失活。
3.2 MTS1基因CpG岛异常甲基化是其在胃癌中的主要灭活机制
多肿瘤抑制基因MTS1在人的众多类型的恶性肿瘤中有高频率的变异，包括突变、缺失甲基化[5,6]、染色体易位等，这些变异导致该基因的正常抑制细胞增殖的功能丧失(即灭活或失活)与癌的发生发展密切相关。但MTS1基因在原发性胃癌中的变异情况却报道较少，并且缺失率较低，没有发现突变的存在，提示可能MTS1基因在胃癌组织中有其他的失活机制[7]。为探讨抑癌基因MTS1与原发性胃癌的关系及其在胃癌中的灭活机制，我们在用PCR-SSCP法研究了胃癌组织中MTS1基因突变缺失的基础上，首次检测了胃癌和正常胃粘膜组织中MTS1基因5′端CpG岛异常甲基化的情况。CpG岛为启动子区一段富含C和G的序列，该序列的甲基化状态与其转录水平密切相关。CpG岛的高甲基化可抑制该基因的转录。抑癌基因启动子区CpG岛如存在异常高甲基化，则可由于该基因的转录抑制而导致功能失活。 本检测结果发现35.5%的原发性胃癌有MTS1基因5′端CpG岛异常甲基化现象，与正常胃组织相比有显著性差异(P<0.05)，说明胃癌中有MTS1基因的变异，5′端CpG岛异常甲基化是其在胃癌中的主要灭活机制。
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3.3 PCR-甲基化检测法的影响因素
PCR-甲基化检测法[8]的原理是根据一些限制性内切酶的识别位点都包含CG，如果C被甲基化后，切割作用则不能产生。PCR扩增这一序列，未被切割的为扩增阳性，反之则为阴性。甲基化敏感酶HpaⅡ和SmaⅠ只能切割CCGG和CCCGGG序列，而不能切割CmCGG和CCmCGGG序列；甲基化非敏感酶Mps Ⅰ则可切割CCGG和CmCGG序列而作为对照。此法检测序列5′端CpG岛异常甲基化现象灵敏度高，但可能由于酶切不完全而出现假阳性。本研究用过量的酶量(每1 μg DNA加40 U酶)完全消化组织DNA以避免出现假阳性结果。实验结果表明在胃癌中MTS1基因甲基化的序列主要在CmCGG和CCmCGGG。
本实验：①首次检测了原发性胃癌和正常胃粘膜组织中MTS1基因5′端CpG岛异常甲基化的情况；②首次发现35.5%的胃癌有MTS1基因异常甲基化，与正常胃组织相比有显著性差异(P<0.05)，认为MTS1基因甲基化与原发性胃癌的发生发展密切相关，CpG岛异常甲基化是MTS1基因在胃癌中的主要失活机制；③胃癌中MTS1基因甲基化的序列主要为CmCGG和CCmCGGG。
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基金项目：广东省博士后基金资助项目(1999年)
作者简介：全欣鑫(1972-)，女，陕西蒲城人，医学博士, 博士后, 主治医师；现在中山医科大学孙逸仙纪念医院博士后流动站工作；主要研究：①消化系肿瘤的发病机制与治疗，②丙型肝炎病毒的复制机理.
参考文献：
[1] Kamb A,Gruis N A,Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types[J].Science,1994,264(15):436.
[2] Mao L, Merio A, Bedi G, et al. A novel p16INK4A transcript[J]. Cancer Res. 1995, 55: 2995.
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[3] Costello J F, Berger M S, Huang H S, et al. Silencing of p16/CDKN2 expression in human gliomas by methylation and chromatin condensation[J]. Cancer Res. 1996, 56: 2405.
[4] Gonzalez-Zulueta M, Bender C M, Yang A S, et al. Methylation of 5′ CpG island of the p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing[J]. Cancer Res. 1995, 55: 4531.
[5] Herman J G, Merlo A, Mao L, et al. Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers[J]. Cancer Res. 1995, 55: 4525.
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[6] Reed A L, Califano J, Cairns P, et al. High frequency of p16(CDKN2/MTS1/INK4A) inactivation in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Cancer Res, 1996, 56: 3630.
[7] Sakata K, Tamura G, Maesawa C, et al. Loss of heterozygosity on the short arm of chromosome 9 without p16 gene mutation in gastric carcinomas[J]. Jpn J Cancer Res, 1995, 86(12): 333.
[8] Maesawa C, Tamura G, Nishizuka S, et al. Inactivation of the CDKN2 gene by homozygous deletion and de novo methylation is associated with advanced stage esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer Res, 1996, 56: 3875.
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