大鼠下丘脑视前区前胸腺素α1-mRNA的表达
作者：何威 王笑海 韩笑宁 关晓伟 张丽雁
单位：何威 王笑海 韩笑宁 关晓伟(中国医科大学组织学胚胎学教研室，沈阳 110001)；张丽雁(辽宁省基础 医学研究所解剖学教研室，沈阳 110005)
关键词：前胸腺素α1-mRNA；下丘脑视前区；RT-PCR；原位杂交；大鼠
解剖学报00zk16
【摘要】目的 探讨胸腺素对下丘脑的作用机制。 方法 RT-PCR和原位杂交组织化学技术。 结果 RT-PCR检测结果表明，大鼠视前区有前胸腺素α1-mRNA的表达； 原位杂交检测结果表明，下丘脑视前区大细胞核、室周核及视交叉上核部分神经元表达前 胸 腺素α1-mRNA。此外，在第三脑室壁附近的小胶质细胞和皮层部分中、小型锥体细胞也 观察到前胸腺素α1-mRNA的阳性信号。结论 大鼠下 丘脑视前区以局部分泌形式产生前胸腺素α1，提示前胸腺素α1可能参与下丘脑功能的 调节。
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【中图分类号】R338.2 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)-增-61
THE EXPRESSION OF PROTHYMOSIN α1-mRNA IN PREOPTIC AREA OF RAT HYPOTHALAMUS
HE Wei WANG Xiao-hai HAN Xiao-ning GUAN Xiao-wei
(Department of Histology and Embryology,China Medical University,She nyang 110001;)
ZHANG Li-yan
(Department of Anatomy,Liaoning Institute of Basic Medicine,She nyang 110005,China)
, 百拇医药
【Abstract】Objective In order to explore the mecha nizms of thymosin action on hypothalamus.Methods RT-PCR and in situ hybridization histochemistry (ISHH)were used.Results The expression of prothymosin α1-mRNA was detected in pre optic area of hypothalamus by using RT-PCR technique.The results of ISHH s howed that prothymosin α1-mRNA was expressed in the preoptic magnocellular n ucleus,suprachiasmatic nuclei and paraventricular nuclei of hypothalamus.In addi t ion,the positive signal of prothymosin α1-mRNA was also observed both in the microglicyte near the third ventricle and in medium to small sized pyramidal cel ls in cerebral cortex.Conclusion Prothymosin α1 is produced i n preoptic area of the hypothalamus by means of paracrine,which indicates that prothymosin α1 participates in the regulation of hypothalamic function.
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【Key words】Prothymosin α1-mRNA; Preoptic area of the hypothalamus; RT-PCR; in situ hybridization; Rat 许多研究结果提示，胸腺与下丘脑-垂体-性腺轴关系密切 [1] 。在新生儿期切除胸腺的鼠或先天性无胸腺的裸鼠，其子宫和卵巢的成熟显著延迟，青春期 的出现受到抑制，但是胸腺移植可恢复卵巢功能[2]。有学者[3]用放射免 疫分析法证明，在下丘脑和垂体提取物中似有内源性胸腺素(thymosin)的存在，脑室内灌流 胸腺素能刺激小鼠下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的分泌。Sakabe等[4]报道， 在大鼠胚 胎早期下丘脑就存在胸腺素样免疫活性细胞。但是，下丘脑内的胸腺素是由胸腺分泌经血液 循环而来，还是在下丘脑以局部分泌方式产生，尚不清楚。一般认为，胸腺上皮细胞首先产 生前胸腺素 α1(prothymosin α1)，前胸腺素α1经转录后的修饰过程，其N-端 乙 酰化，生成胸腺素α1[3]，从胸腺分泌入血。为探讨胸腺素对下丘脑-垂体-性 腺 轴的作用机制，本研究用RT-PCR和原位杂交组织化学方法观察了大鼠下丘脑促性腺激素释 放激素GnRH神经元胞体所在的视前区内前胸腺素α1-mRNA的表达。
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材料和方法
1.试剂和材料
RNA提取试剂盒购自美国QIAGEN；RT-PCR试剂盒、原位杂交用地高辛标记prothymosin α 1 合成寡核苷酸探针及GnRH合成寡核苷酸探针均购自日本TaKaRa；抗地高辛抗体(工作浓度1∶ 1 000)和碱性磷酸酶显色剂NBT/BCIP(工作浓度1∶100)购自美国LIFE TECH。
7周龄近交系雌性SD大鼠8只，为了排除性周期对实验结果的影响，进行卵巢切除。切除术1 周 后，戊巴比妥钠(40mg/kg)腹膜腔注射麻醉下，取4只鼠下丘脑视前区脑组织及胸腺，-70℃ 冷冻保存，用于RT-PCR；另4只鼠经左心室4%多聚甲醛灌流固定，取全脑，相同固定液后固 定48h(4℃)后，石蜡包埋，连续切片(厚8μm)，裱片，甲苯胺蓝染色进行核团定位后用于原 位杂交组织化学染色。
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2.RT-PCR检测程序
提取视前区脑组织总RNA。作为prothymosin α1的阳性组织对照，同时提取胸腺组织总RN A。用1μg RNA加20μl 的反应液(5 mmol/L MgC12，RNA PCR 缓冲液，1 mmol/L dNTP Mi xtur e,1×106IU/L RNase Inhibitor,0.25×106IU/L Reverse Transcriptase,2.5μmol/ L Random 9mers),30℃ 10min,50℃ 50min，进行逆转录。99℃ 6min使逆转录酶失活后， 脑组 织和胸腺组织的cDNA于-20℃保存，以进行PCR。根据大鼠 prothymosin α1基因序列设 计 引物[5]，上游：5’-ATGTCAGACGCGGCAGTGGA-CACCAGCTCCG-3’，下游：5’-G TCTA GTCATCCTCATCAG-3。由此对引物扩增出的DNA片段长339bp。PCR扩增条件是：94℃ 2min 预变性 后，94℃变性30s；64℃退火30s；72℃延伸1min；循环35次。最后经72℃延伸5min完成反应 。此外，由于GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase)几乎存在于所有细胞 中 ，为检测所提取的总RNA的完整性，设计了一对GAPDH 的 PCR引物[6]。上游： 5’-CTCAA GATTGTCAGCAATGC-3’，下游：5’-CAGGATGCCCTTTAGTGGGC-3’。由此对引物扩增出的DNA片段长393bp。PCR扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，0.5mg/L溴化乙锭染色后，紫外线观察并摄片。
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3.原位杂交组织化学染色程序
脑片脱蜡至水后，2×SSC 60℃漂洗5min×2次，蛋白酶K(15mg/L)37℃孵育20min(于0.05mol/L Tris*HCl pH8.0；0.05mol/L EDTA缓冲液中)；0.01mol/L冷PBS漂洗5min×3次，在不含探针的预杂交液(50%去离子甲酰胺；5×SSC；5×Denhardt液；变性的鲱鱼精子DNA 100mg/L )中孵育1h(37℃)后，切片在含有0.1mg/L地高辛标记的prothymosin α1寡核苷酸探针的杂交液中37℃孵育过夜，相邻切片在含有0.1mg/L地高辛标记的GnRH寡核苷酸探针[ 1]的杂交液中同样条件过夜。次日，4×→2×→0.2×SSC/30%formamide中各漂洗5min×2次(37℃)，0.01mol/LPBS中5min×3次(37℃)，Bloking solution室温30min，将切片转入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体中孵育室温1h，TBS漂洗5min×3次，NBT/BCIP显色液显色[7]1～2h(37℃)，水性封固剂封片。
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阴性对照：1.将切片用RNA酶进行预处理后杂交；2.以不含探针的预杂交液进行杂交；3.以正常羊血清代替羊抗Dig抗体-AP复合物，染色结果均为阴性。
结 果
1.RT-PCR
将大鼠下丘脑视前区prothymosin α1的PCR产物及GAPDH的PCR产物与胸腺prothymosin α1的PCR产物同时进行电泳，结果在视前区出现与组织阳性对照的胸腺prothymosin α1(图1B)同样清晰的339bp的谱带(图1C)，即预期的prothymosin α1谱带，说明在大鼠下丘脑视前区有很强的prothymosin α1-mRNA信号表达。
脑组织RNA阳性对照的GAPDH-PCR检测结果，出现了预期的393bp的谱带(图1D)，表明本实验结果不是由于基因组DNA污染所造成的假阳性结果。
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把大鼠下丘脑视前区RNA作为样品添加设立的PCR阴性对照检测结果，没有出现任何谱带(图1E)。
图1 RT-PCR检测结果
A.DNA分子量标准 B.胸腺组织前胸腺素α1R T-PCR产物，339bp C.下丘脑视前区前胸腺素α1RT-PCR产物，339bp D.下丘脑视 前区GAPDH RT-PCR产物，393bp E.PCR阴性对照
Fig.1 Analysis of prothymosinα1mRNA expression by RT-PCR.
A,DNA marker B,The Prothymosinα1RT-PCR product of thymus,showing 339bp ban ds C,The prothymosin α1 RT-PCR product of preoptic area of the hypothalamus, showing 339bp bands D,The GAPDH RT-PCR product of preoptic area of the hypothalamus,showing 393bp bands E,Negative control of PCR reaction
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2.原位杂交组织化学染色
用地高辛标记的prothymosin α1合成寡核苷酸探针对脑组织切片进行原位杂交组织化学染色，结果表明在大鼠下丘脑视前区大细胞核部分神经元有很强的prothymosin α1-mRNA的表达，阳性神经元的胞质内充满蓝紫色的阳性杂交产物(图2)；在位于同一核团的相邻切片，用地高辛标记的GnRH合成寡核苷酸探针进行原位杂交的结果表明，该核团内的部分神经元表达GnRH-mRNA(图3)。在视前室周核(图4)及视交叉上核(图5)的部分神经元同时有prothymosin α1-mRNA的表达。此外，在第三脑室附近的小胶质细胞(图6)和皮层部分中、小型锥体细胞(图7)也观察到prothymosin α1-mRNA的阳性信号。
讨 论
本研究用RT-PCR和原位杂交组织化学方法证明，在大鼠下丘脑视前区有前胸腺素α1-mRNA的表达，这些阳性信号分布在视前大细胞核、视前室周核及视交叉上核等处，提示这些部分以局部分泌形式产生前胸腺素α1。
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前胸腺素α 1来源于胸腺，由113个氨基酸组成并含有完整的胸腺素α1片段。前胸腺素经转录后的修饰过程，其N-端乙酰化，生成分子量为3180道尔顿，由28个氨基酸组成的胸腺素α1[3]。胸腺素α1是一种有效的T细胞诱导剂，参与T细胞的分化过程，并能诱导γ-干扰素和IL-2的产生和IL-2受体的表达[8]。
近几年胸腺素α1的胸腺外作用引人注目。胸腺素α1能增加个体发生过程中中枢神经系统内神经生长因子的水平及其受体的表达[9]，并能促进垂体激素TSH、PRL及ACTH的释放[10]。脑室内灌流胸腺素能刺激小鼠下丘脑GnRH的分泌[3]。还有学者用免疫组织化学方法证明，在正常人脑有胸腺素α1免疫活性星形胶质细胞的存在[11]。基于上述事实，有学者提出了胸腺-下丘脑-垂体轴的概念，表明了胸腺素对下丘脑-垂体轴的调节作用[10]。许多研究结果表明，胸腺素α1在中枢神经系统具有与胸腺不同的生物活性。本研究在作为在脑-生殖轴中起着首位链接作用的GnRH神经元胞体所在的下丘脑视前区的诸多神经核团中检测出前胸腺素α1-mRNA的表达，从转录水平证明了这些部位以局部分泌形式产生前胸腺素α1。本研究结果提示，胸腺素α1在下丘脑可能起着神经内分泌调节因子的作用。这种免疫因子在神经内分泌的控制中枢以局部分泌形式产生并调节其功能的事实，进一步证明了免疫、神经、内分泌系统之间的相互影响，说明了“神经-内分泌-免疫网络学说”的正确性。这种下丘脑来源的前胸腺素α1在分子生物学特性上是否与胸腺来源的相同，尚有待于进一步的研究阐明。
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图2 视前大细胞核部分神经元表达前胸腺素α1-mRNA(↑)。×160 图3 视前大 细胞核部分神经元表达GnRH-mRNA(↑)。×160
图4 视前室周核部分神经元表达前胸腺素α1-mRNA(↑)。×200图5 视交叉上核部 分神经元表达前胸腺素α1-mRNA(↑)。×52
图6 第三脑室附近小胶质细胞表达前胸腺素α1-mRNA(↑)。×200图7 皮层部分 锥体细胞表达前胸腺素α1-mRNA(↑)。×400
Fig.2 Part of neurons of preoptic magnocellular nucleus expressing prothymosin α1-mRNA(↑). ×160
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Fig.3 Part of neurons of preoptic magnocellular nucleus expressing GnRH -mR NA(↑). ×160
Fig.4 Part of paraventricular nucleus expressing prothymosin α1-mRNA(↑). × 200
Fig.5 Part of suprachiasmatic nuclei expressing prothymosin α1-mRNA(↑). × 52
Fig.6 Microgliocyte near the paries of ventricle Ⅲ of cerebrum expressi ng prothymosin α1-mRNA(↑). ×200
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Fig.7 Part of pyramidal cells in cerebral cortex expressing prothymosin α1-m RNA(↑). ×400
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39970382)；高等院校骨干教师 资助计划[教技司2000(65)号]
【作者简介】何威(1955—)，女(满族)，辽宁省沈阳市人，医学博士，教 授，博士生导师
参考文献
[1]何威，王占友，石玉秀，等.大鼠胸腺内促性腺激素释放激素-mRNA的表达[J].解剖学报,2000,31(1):90～91.
[2]Hall NR,Grady MP,Menzies RA,Thymic regulation of hypothalamus-pitu itary-gonadal axis.[J]Int J Immunopharmacol,1992,14(3):353-359.
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[4]Sakabe K,Seiki K,Sakai N,et al.Establishment of`crosstalk'betwe en the thymus and brain at an early stage of fetal life in the rat [J].Med Sci Res,1996,24(7):439-442.
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[6]Tso J Y,Sun X H,Kao T H,et al.Isolation and characterization of rat and human glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase cDNAs:Genomic complexity and molecular evolution of the gene[J].Nucleic Acids Res,1985,13(7):2485-2502.
[7]蔡文琴，王伯NB023主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术[ M].成都：四川科学技术出版社，1994：354～432.
[8]Goya KG,Bilognani F.Homeostasis,thymic hormones and aging[J].Gero ntology,1999,45(3):174-178.
[9]Turrini P,Aloe L.Evidence that endogenous thymosin alpha-l in pres ent in the rat central nervous sysem[J].Neurochem Int,1999,35(6):463-470.
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[10]Savino W,Arzt E,Dardenne M.Immunoneuroendocrine connectivity:the paradigm of the thymus-hypothalamus/pituitary axis [J].Neuroimmunomodulation,1999,6:126-136.
[11]Su YL,Ho KL,Dalakas MC,et al.Localization of Immunoreactive Thym osin α1in Astrocytes of Normal Human Brain [J].Annals of Neurology,1989,26 (2): 277-280.
【收稿日期】2000-07-04 【修回日期】2000-8-10, 百拇医药
单位：何威 王笑海 韩笑宁 关晓伟(中国医科大学组织学胚胎学教研室，沈阳 110001)；张丽雁(辽宁省基础 医学研究所解剖学教研室，沈阳 110005)
关键词：前胸腺素α1-mRNA；下丘脑视前区；RT-PCR；原位杂交；大鼠
解剖学报00zk16
【摘要】目的 探讨胸腺素对下丘脑的作用机制。 方法 RT-PCR和原位杂交组织化学技术。 结果 RT-PCR检测结果表明，大鼠视前区有前胸腺素α1-mRNA的表达； 原位杂交检测结果表明，下丘脑视前区大细胞核、室周核及视交叉上核部分神经元表达前 胸 腺素α1-mRNA。此外，在第三脑室壁附近的小胶质细胞和皮层部分中、小型锥体细胞也 观察到前胸腺素α1-mRNA的阳性信号。结论 大鼠下 丘脑视前区以局部分泌形式产生前胸腺素α1，提示前胸腺素α1可能参与下丘脑功能的 调节。
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【中图分类号】R338.2 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)-增-61
THE EXPRESSION OF PROTHYMOSIN α1-mRNA IN PREOPTIC AREA OF RAT HYPOTHALAMUS
HE Wei WANG Xiao-hai HAN Xiao-ning GUAN Xiao-wei
(Department of Histology and Embryology,China Medical University,She nyang 110001;)
ZHANG Li-yan
(Department of Anatomy,Liaoning Institute of Basic Medicine,She nyang 110005,China)
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【Abstract】Objective In order to explore the mecha nizms of thymosin action on hypothalamus.Methods RT-PCR and in situ hybridization histochemistry (ISHH)were used.Results The expression of prothymosin α1-mRNA was detected in pre optic area of hypothalamus by using RT-PCR technique.The results of ISHH s howed that prothymosin α1-mRNA was expressed in the preoptic magnocellular n ucleus,suprachiasmatic nuclei and paraventricular nuclei of hypothalamus.In addi t ion,the positive signal of prothymosin α1-mRNA was also observed both in the microglicyte near the third ventricle and in medium to small sized pyramidal cel ls in cerebral cortex.Conclusion Prothymosin α1 is produced i n preoptic area of the hypothalamus by means of paracrine,which indicates that prothymosin α1 participates in the regulation of hypothalamic function.
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【Key words】Prothymosin α1-mRNA; Preoptic area of the hypothalamus; RT-PCR; in situ hybridization; Rat 许多研究结果提示，胸腺与下丘脑-垂体-性腺轴关系密切 [1] 。在新生儿期切除胸腺的鼠或先天性无胸腺的裸鼠，其子宫和卵巢的成熟显著延迟，青春期 的出现受到抑制，但是胸腺移植可恢复卵巢功能[2]。有学者[3]用放射免 疫分析法证明，在下丘脑和垂体提取物中似有内源性胸腺素(thymosin)的存在，脑室内灌流 胸腺素能刺激小鼠下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的分泌。Sakabe等[4]报道， 在大鼠胚 胎早期下丘脑就存在胸腺素样免疫活性细胞。但是，下丘脑内的胸腺素是由胸腺分泌经血液 循环而来，还是在下丘脑以局部分泌方式产生，尚不清楚。一般认为，胸腺上皮细胞首先产 生前胸腺素 α1(prothymosin α1)，前胸腺素α1经转录后的修饰过程，其N-端 乙 酰化，生成胸腺素α1[3]，从胸腺分泌入血。为探讨胸腺素对下丘脑-垂体-性 腺 轴的作用机制，本研究用RT-PCR和原位杂交组织化学方法观察了大鼠下丘脑促性腺激素释 放激素GnRH神经元胞体所在的视前区内前胸腺素α1-mRNA的表达。
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材料和方法
1.试剂和材料
RNA提取试剂盒购自美国QIAGEN；RT-PCR试剂盒、原位杂交用地高辛标记prothymosin α 1 合成寡核苷酸探针及GnRH合成寡核苷酸探针均购自日本TaKaRa；抗地高辛抗体(工作浓度1∶ 1 000)和碱性磷酸酶显色剂NBT/BCIP(工作浓度1∶100)购自美国LIFE TECH。
7周龄近交系雌性SD大鼠8只，为了排除性周期对实验结果的影响，进行卵巢切除。切除术1 周 后，戊巴比妥钠(40mg/kg)腹膜腔注射麻醉下，取4只鼠下丘脑视前区脑组织及胸腺，-70℃ 冷冻保存，用于RT-PCR；另4只鼠经左心室4%多聚甲醛灌流固定，取全脑，相同固定液后固 定48h(4℃)后，石蜡包埋，连续切片(厚8μm)，裱片，甲苯胺蓝染色进行核团定位后用于原 位杂交组织化学染色。
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2.RT-PCR检测程序
提取视前区脑组织总RNA。作为prothymosin α1的阳性组织对照，同时提取胸腺组织总RN A。用1μg RNA加20μl 的反应液(5 mmol/L MgC12，RNA PCR 缓冲液，1 mmol/L dNTP Mi xtur e,1×106IU/L RNase Inhibitor,0.25×106IU/L Reverse Transcriptase,2.5μmol/ L Random 9mers),30℃ 10min,50℃ 50min，进行逆转录。99℃ 6min使逆转录酶失活后， 脑组 织和胸腺组织的cDNA于-20℃保存，以进行PCR。根据大鼠 prothymosin α1基因序列设 计 引物[5]，上游：5’-ATGTCAGACGCGGCAGTGGA-CACCAGCTCCG-3’，下游：5’-G TCTA GTCATCCTCATCAG-3。由此对引物扩增出的DNA片段长339bp。PCR扩增条件是：94℃ 2min 预变性 后，94℃变性30s；64℃退火30s；72℃延伸1min；循环35次。最后经72℃延伸5min完成反应 。此外，由于GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase)几乎存在于所有细胞 中 ，为检测所提取的总RNA的完整性，设计了一对GAPDH 的 PCR引物[6]。上游： 5’-CTCAA GATTGTCAGCAATGC-3’，下游：5’-CAGGATGCCCTTTAGTGGGC-3’。由此对引物扩增出的DNA片段长393bp。PCR扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，0.5mg/L溴化乙锭染色后，紫外线观察并摄片。
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3.原位杂交组织化学染色程序
脑片脱蜡至水后，2×SSC 60℃漂洗5min×2次，蛋白酶K(15mg/L)37℃孵育20min(于0.05mol/L Tris*HCl pH8.0；0.05mol/L EDTA缓冲液中)；0.01mol/L冷PBS漂洗5min×3次，在不含探针的预杂交液(50%去离子甲酰胺；5×SSC；5×Denhardt液；变性的鲱鱼精子DNA 100mg/L )中孵育1h(37℃)后，切片在含有0.1mg/L地高辛标记的prothymosin α1寡核苷酸探针的杂交液中37℃孵育过夜，相邻切片在含有0.1mg/L地高辛标记的GnRH寡核苷酸探针[ 1]的杂交液中同样条件过夜。次日，4×→2×→0.2×SSC/30%formamide中各漂洗5min×2次(37℃)，0.01mol/LPBS中5min×3次(37℃)，Bloking solution室温30min，将切片转入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体中孵育室温1h，TBS漂洗5min×3次，NBT/BCIP显色液显色[7]1～2h(37℃)，水性封固剂封片。
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阴性对照：1.将切片用RNA酶进行预处理后杂交；2.以不含探针的预杂交液进行杂交；3.以正常羊血清代替羊抗Dig抗体-AP复合物，染色结果均为阴性。
结 果
1.RT-PCR
将大鼠下丘脑视前区prothymosin α1的PCR产物及GAPDH的PCR产物与胸腺prothymosin α1的PCR产物同时进行电泳，结果在视前区出现与组织阳性对照的胸腺prothymosin α1(图1B)同样清晰的339bp的谱带(图1C)，即预期的prothymosin α1谱带，说明在大鼠下丘脑视前区有很强的prothymosin α1-mRNA信号表达。
脑组织RNA阳性对照的GAPDH-PCR检测结果，出现了预期的393bp的谱带(图1D)，表明本实验结果不是由于基因组DNA污染所造成的假阳性结果。
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把大鼠下丘脑视前区RNA作为样品添加设立的PCR阴性对照检测结果，没有出现任何谱带(图1E)。
图1 RT-PCR检测结果
A.DNA分子量标准 B.胸腺组织前胸腺素α1R T-PCR产物，339bp C.下丘脑视前区前胸腺素α1RT-PCR产物，339bp D.下丘脑视 前区GAPDH RT-PCR产物，393bp E.PCR阴性对照
Fig.1 Analysis of prothymosinα1mRNA expression by RT-PCR.
A,DNA marker B,The Prothymosinα1RT-PCR product of thymus,showing 339bp ban ds C,The prothymosin α1 RT-PCR product of preoptic area of the hypothalamus, showing 339bp bands D,The GAPDH RT-PCR product of preoptic area of the hypothalamus,showing 393bp bands E,Negative control of PCR reaction
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2.原位杂交组织化学染色
用地高辛标记的prothymosin α1合成寡核苷酸探针对脑组织切片进行原位杂交组织化学染色，结果表明在大鼠下丘脑视前区大细胞核部分神经元有很强的prothymosin α1-mRNA的表达，阳性神经元的胞质内充满蓝紫色的阳性杂交产物(图2)；在位于同一核团的相邻切片，用地高辛标记的GnRH合成寡核苷酸探针进行原位杂交的结果表明，该核团内的部分神经元表达GnRH-mRNA(图3)。在视前室周核(图4)及视交叉上核(图5)的部分神经元同时有prothymosin α1-mRNA的表达。此外，在第三脑室附近的小胶质细胞(图6)和皮层部分中、小型锥体细胞(图7)也观察到prothymosin α1-mRNA的阳性信号。
讨 论
本研究用RT-PCR和原位杂交组织化学方法证明，在大鼠下丘脑视前区有前胸腺素α1-mRNA的表达，这些阳性信号分布在视前大细胞核、视前室周核及视交叉上核等处，提示这些部分以局部分泌形式产生前胸腺素α1。
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前胸腺素α 1来源于胸腺，由113个氨基酸组成并含有完整的胸腺素α1片段。前胸腺素经转录后的修饰过程，其N-端乙酰化，生成分子量为3180道尔顿，由28个氨基酸组成的胸腺素α1[3]。胸腺素α1是一种有效的T细胞诱导剂，参与T细胞的分化过程，并能诱导γ-干扰素和IL-2的产生和IL-2受体的表达[8]。
近几年胸腺素α1的胸腺外作用引人注目。胸腺素α1能增加个体发生过程中中枢神经系统内神经生长因子的水平及其受体的表达[9]，并能促进垂体激素TSH、PRL及ACTH的释放[10]。脑室内灌流胸腺素能刺激小鼠下丘脑GnRH的分泌[3]。还有学者用免疫组织化学方法证明，在正常人脑有胸腺素α1免疫活性星形胶质细胞的存在[11]。基于上述事实，有学者提出了胸腺-下丘脑-垂体轴的概念，表明了胸腺素对下丘脑-垂体轴的调节作用[10]。许多研究结果表明，胸腺素α1在中枢神经系统具有与胸腺不同的生物活性。本研究在作为在脑-生殖轴中起着首位链接作用的GnRH神经元胞体所在的下丘脑视前区的诸多神经核团中检测出前胸腺素α1-mRNA的表达，从转录水平证明了这些部位以局部分泌形式产生前胸腺素α1。本研究结果提示，胸腺素α1在下丘脑可能起着神经内分泌调节因子的作用。这种免疫因子在神经内分泌的控制中枢以局部分泌形式产生并调节其功能的事实，进一步证明了免疫、神经、内分泌系统之间的相互影响，说明了“神经-内分泌-免疫网络学说”的正确性。这种下丘脑来源的前胸腺素α1在分子生物学特性上是否与胸腺来源的相同，尚有待于进一步的研究阐明。
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图2 视前大细胞核部分神经元表达前胸腺素α1-mRNA(↑)。×160 图3 视前大 细胞核部分神经元表达GnRH-mRNA(↑)。×160
图4 视前室周核部分神经元表达前胸腺素α1-mRNA(↑)。×200图5 视交叉上核部 分神经元表达前胸腺素α1-mRNA(↑)。×52
图6 第三脑室附近小胶质细胞表达前胸腺素α1-mRNA(↑)。×200图7 皮层部分 锥体细胞表达前胸腺素α1-mRNA(↑)。×400
Fig.2 Part of neurons of preoptic magnocellular nucleus expressing prothymosin α1-mRNA(↑). ×160
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Fig.3 Part of neurons of preoptic magnocellular nucleus expressing GnRH -mR NA(↑). ×160
Fig.4 Part of paraventricular nucleus expressing prothymosin α1-mRNA(↑). × 200
Fig.5 Part of suprachiasmatic nuclei expressing prothymosin α1-mRNA(↑). × 52
Fig.6 Microgliocyte near the paries of ventricle Ⅲ of cerebrum expressi ng prothymosin α1-mRNA(↑). ×200
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Fig.7 Part of pyramidal cells in cerebral cortex expressing prothymosin α1-m RNA(↑). ×400
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39970382)；高等院校骨干教师 资助计划[教技司2000(65)号]
【作者简介】何威(1955—)，女(满族)，辽宁省沈阳市人，医学博士，教 授，博士生导师
参考文献
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【收稿日期】2000-07-04 【修回日期】2000-8-10, 百拇医药