食管癌手术切缘组织p53突变研究
作者：邵根泽 申延琴 李 任运生 张少英
单位：邵根泽 李王景 任运生 汕头大学医学院生化教研室汕头市(515031)；申延琴 张少英 汕头大学医学院病理教研室
关键词：食管鳞状细胞癌；p53；突变
癌症99zk09 邵根泽 申延琴 李 任运生 张少英
【摘要】目的：检测食管癌手术切缘组织p53基因突变，确定其“分子边缘”，并探讨与食管癌预后的关系；方法：采用PCRSSCP对原癌组织、切缘组织p53基因第5～9外显子进行突变分析，并对其切缘组织进行病理学检查；结果：28例原癌组织p53基因突变患者中23例切缘HE镜检未见癌；在这23例患者中，13例(565%)切缘组织检测到p53基因的突变。切缘组织p53突变患者预后差，其肿瘤复发率为46%(6/13)；而p53基因无突变者无一复发，两组复发率存在显著性差异(P<0.05)。结论：检测切缘组织P53基因突变有助于食管癌手术评估和预后判断。
, http://www.100md.com
中图号：R735.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)s0-0027-03
p53 gene mutations in surgical margins with esophageal squamous cell carcinoma
SHAO Gen-ze， SHEN Yan-qin， LI Jing, et al.
Department of Biochemistry,Shantou University Medical College,Shantou 515031,P.R.China
【Abstract】 Objective： To detect mutations of p53 gene in surgical margins with esophageal squamous cell carcinoma and to explore its importance of prognosis. Methods： PCR-SSCP was used to detect mutations of p53 gene in tumor tissue and surgical margins,patients were histopathologically examined in surgical margins. Results： 23 of the 28 patients containing p53 mutations were histopathologically examined negatively in surgical margins.In 13 of these 23 patients,mutations of p53 gene were detected in at least one tumor margin by PCR-SSCP,and they have a much higher rate of recurrence(46% )as well as a poor prognosis.While patients who were negative for p53 mutations in surgical margins have no recurrence of the carcinoma. Conclusions： molecular analysis of surgical margins is useful to identify the position of the sections,it plays an important role in the assessment of tumor s resection,and may help to predict the recurrence of the tumor.
, http://www.100md.com
Key words： Esophageal squamous cell carcinoma； p53； Mutation
潮汕地区是我国南方沿海食管癌高发区，早期食管癌的治疗主要采用外科手术切除。然而手术后仍有近半数患者出现肿瘤复发和转移，传统的方法又无法预测哪一部分人将复发，因而无法制定和实施最佳的术后辅助治疗方案。本研究对HE镜检未见癌侵犯的手术切缘组织进行p53基因突变分析，有助于食管癌手术异常“分子切缘”的确定，对食管癌术后治疗有重要的意义。
1材料和方法
1.1标本
经临床病理检查确诊为食管鳞癌患者88例，其中男53例，女35例，年龄30～70岁。标本来源于汕头大学医学院附属肿瘤医院，为新鲜手术标本，正常对照食管标本取自尸检标本。
, http://www.100md.com 1.2病理组织学检查
每例标本分别取自癌组织、两端切缘组织。OCT包埋，冰冻切片。为确保用作p53基因突变分析的DNA处在HE镜检范围内，对切缘组织按以下方法切片。首先切2～3片(约5μm厚)HE染色光镜检查；再切下10片(25μm厚)在SDS/蛋白酶K混合液中消化，酚/氯仿抽提，提取基因组DNA，用作p53突变分析。再切下2～3片HE染色镜检。
1.3p53基因突变分析
p53基因第5～9外显子引物见表1。以PCRSSCP法分析p53基因突变，方法参见文献〔1，2〕。首先分析癌组织，筛选出p53基因异常病例。再对其中切缘组织HE病理检查未见癌侵犯的病例进行PCR-SSCP分析，观察p53基因突变。
表1 p53基因第5～9外显子引物序列
外显子
, http://www.100md.com
引物序列
长度bp
5
5-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA-3’
181
5-CGCTATCTGAGCAGCGCTCATG-3’
6
5-GATTGCTCTTAGGTCTGGCCCCTCCTCAGC-3
131
5-CAGACCTCAGGCGGCTCATAGG-3’
7
, 百拇医药
5-CTAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCC-3’
118
5-TGACCTGGAGTCTTCCAGTGTG-3’
8
5-GTAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGC-3’
142
5-CTCGTCTAGTGCTCCCTGGGGGC-3’
9
5-TTCCTAGCACTGCCCAACAAC-3’
79
, 百拇医药
5-CTTAGTACCTGAAGGGTGAAATATTC-3’
2结果
以PCR-SSCP法分析88例标本癌组织，发现其中28例存在p53基因第5～9不同外显子突变，突变率为32%。对这28例标本切缘进一步分析，结果如下：
病理学检查：对切缘组织冰冻切片，HE染色镜检，发现其中5例(5/28)有癌细胞残留；余23例切缘未见癌。
分子分析：对上述23例未见癌的切缘组织进行突变分析，发现其中13例切缘存在p53基因突变。手术后随访两年，发现有6例复发；而另10例切缘p53无突变者无一复发，两组病人肿瘤复发率存在显著差异(表2)。
表2 切缘组织p53突变阳性组与阴性组肿瘤复发率比较
, 百拇医药 p53突变
例数
复发例数
复发率
阳性
13
6
46%
阴性
10
0
0
χ2检验：P<0.05
, http://www.100md.com
全部标本的临床病理资料及p53突变分析见表3。
表3 食管癌临床病理特征和p53突变分析
病例
年龄/性别
临床分期/病理分级
切缘镜检
P53突变
预后
1
56/F
T3N0M0/Ⅰ级
, 百拇医药
-，SN
8(M1)
2
59/M
T1N0M0/Ⅱ级
-，SM
3
63/M
T2N0M0/Ⅰ级
-，SN
5(M2)
, http://www.100md.com
4
60/M
T3N1M0/Ⅱ级
-，SN
5(M2)
5
53/F
T1N1M0/Ⅱ级
-，SN
8(M1)
R
, 百拇医药
6
56/M
T4N1M0/Ⅱ级
-，SM
7(M2)
R
7
65/M
T4N0M0/Ⅱ级
-，SN
6(M2)
, 百拇医药
8
67/F
T4N1M0/Ⅲ级
-，SN
8(M2)
9
64/M
T1N0M0/Ⅰ级
-，SN
10
59/F
, http://www.100md.com
T1N0M0/Ⅱ级
-，SN
11
68/M
T2N0M0/Ⅰ级
-，SN
5(M1)
12
62/M
T1N1M0/Ⅱ级
, http://www.100md.com
-，SN
9(M1)
R
13
72/M
T3N0M0/Ⅱ级
-，SN
14
65/F
T3N1M0/Ⅱ级
-，SN
, 百拇医药
5(M2)
R
15
57/M
T2N0M0/Ⅰ-Ⅱ级
-，SN
16
54/M
T1N0M0/Ⅲ级
-，SN
17
, 百拇医药
49/M
T1N1M0/Ⅲ级
-，SN
5(M2)
R
18
51/F
T3N0M0/Ⅱ级
-，SN
19
58/M
, http://www.100md.com
T4N1M0/Ⅲ级
-，SN
20
69/M
T1N1M0/Ⅰ级
-，SN
6(M1)
21
61/M
T2N0M0/Ⅰ级
, 百拇医药
-，SN
8(M1)
R
22
53/F
T4N0M0/Ⅰ级
-，SN
23
55/F
T1N0M0/Ⅰ-Ⅱ级
-，SN
, 百拇医药
M1：上端切缘；M2：下端切缘；R：肿瘤复发；-：癌阴性；SN：粘膜正常；SM：粘膜上皮轻度增生，SS：粘膜上皮中度增生
3讨论
手术切除是食管癌早期治疗的重要手段，切缘干净与否是肿瘤预后的主要因素。传统方法对于手术切除是否干净的判断主要基于对切缘组织的细胞形态学观察，即病理组织切片HE染色光镜检查。这种方法根据癌细胞和正常细胞在形态学上的差异进行区分，并根据肿瘤大小、癌细胞的数量、浸润程度、淋巴结转移与否等，对食管癌进行病理分级、临床分期和预后判断，并据此制定治疗对策。此法存在局限性，对于在表型上与正常细胞无可见差异的癌前细胞或具有潜在转化能力的“正常”细胞没有区分力。另一方面，当癌细胞数量只占正常细胞少量的时候或微癌灶只存在于切缘组织某个区域时，极易造成漏检。而病理检查时又不可能对切缘组织全部切片逐片观察。对于一个1cm厚的组织块来说，5μm厚的切片只占其1/2000。因此即使常规病理检查未见癌的患者也常常有肿瘤的复发，预后差。
, http://www.100md.com
现代分子技术的介入和应用，弥补了传统方法的不足，给肿瘤的诊治、预后判断提供了更为客观的科学依据。PCRSSCP是一种基因突变分析手段，具有客观、快速、灵敏的特点，能从成千上万个正常细胞中检测到一个异常的癌细胞〔3〕。肿瘤的发生和演进过程中，细胞将发生一系列遗传学的改变，如一些癌基因激活和抑癌基因失活。而其中某些基因的分子遗传学改变可能就是细胞癌变的标志。寻找建立肿瘤特异的分子标志对肿瘤诊治预防有重要意义〔4〕。近年来研究表明，p53基因是一个肿瘤高度相关的基因，在食管癌中，有30%～50%的患者存在p53基因的突变〔5〕。p53基因突变可能是食管细胞癌变的一个早期事件〔2，6〕。一些貌似正常的癌前细胞可以通过PCRSSCP检测到p53基因的异常。本文以PCR-SSCP技术对经病理组织学检查未见癌的切缘进行p53基因突变分析，以确定其异常的“分子边缘”。研究结果表明，半数切缘镜检未见癌者出现p53基因突变，有趣的是，这部分患者有46%在术后(中位数15月)随访中出现肿瘤复发。而切缘p53基因无突变者(癌组织存在p53基因突变)无一复发。两组病人术后肿瘤复发率有统计学显著差异。肿瘤的复发与癌细胞的扩散和转移密切相关，在病检未见癌的切缘组织中检测到p53基因突变表明，手术切缘有可能残留少量癌细胞或存在具有潜在转化能力的癌前细胞——形态貌似正常但已有分子遗传学的改变，这可能是复发的原因之一；另一个原因是癌细胞的淋巴结转移，从表3可看出，癌细胞淋巴结转移患者具有较高的复发倾向。因此对切缘组织进行p53突变分析，界定其“分子边缘”，并结合肿瘤的临床病理资料，尤其是癌细胞的淋巴结转移，将有助于对食管癌手术的预后判断。应用分子技术探测原癌组织、切缘组织、淋巴结组织乃至血液、唾液、尿液、粪便等临床标本各种可能的细胞分子遗传学的变异，不但能揭示肿瘤产生的机制和演进过程，同时对临床治疗、预后有重要意义〔7〕。
, 百拇医药
基金项目：汕大医学院硕士启动基金资助课题
〔参考文献〕
1 Orita M,Iwahana H,Kanazawa H,et al.Detection of Polymorphisms of Human DNA by Gel Electrophoresis as Single Strand Conformation Polymorphism.Proc.Natl.Acad Sci〔J〕 .USA,1989,86(8):2766.
2 邵根泽，任运生，张少英，等.食管癌p53基因突变与int-2癌基因扩增的关系〔J〕.中华医学遗传学杂志，1997，14(5)：316.
3 Brennan JA,Mao L,Hruban RH,et al.Molecular Assessment of Histopathological Staging in Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck〔 J〕 .N Eng1 J Med.1995,332:429.
, http://www.100md.com
4 Koch WM,Boyle JO,Mao L,et al.p53 Gene Mutations as Markers of Tumor Spread in Synchronous Oral Cancers〔 J〕 .Arch Otolaryngol Head Neck Surg.1994,120:943
5 Hollstein M,Sidransky D,Vogelstein B,et al.p53 Mutations in Human Cancer〔J〕 .Science,1991,253:49.
6 李华川，陆士新.食管癌和贲门癌组织中p53基因突变的研究〔J〕中华肿瘤杂志，1994，16(3)：172.
7 Boyle JO,Koch W,Sidransky D.et al.Molecular Screening:Prospects for a New Approach〔 J〕 .Arch Otolaryngol Head Neck Surg,1993,119:1187.
收稿日期：1998-04-02；修回日期：1998-10-20, 百拇医药
单位：邵根泽 李王景 任运生 汕头大学医学院生化教研室汕头市(515031)；申延琴 张少英 汕头大学医学院病理教研室
关键词：食管鳞状细胞癌；p53；突变
癌症99zk09 邵根泽 申延琴 李 任运生 张少英
【摘要】目的：检测食管癌手术切缘组织p53基因突变，确定其“分子边缘”，并探讨与食管癌预后的关系；方法：采用PCRSSCP对原癌组织、切缘组织p53基因第5～9外显子进行突变分析，并对其切缘组织进行病理学检查；结果：28例原癌组织p53基因突变患者中23例切缘HE镜检未见癌；在这23例患者中，13例(565%)切缘组织检测到p53基因的突变。切缘组织p53突变患者预后差，其肿瘤复发率为46%(6/13)；而p53基因无突变者无一复发，两组复发率存在显著性差异(P<0.05)。结论：检测切缘组织P53基因突变有助于食管癌手术评估和预后判断。
, http://www.100md.com
中图号：R735.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)s0-0027-03
p53 gene mutations in surgical margins with esophageal squamous cell carcinoma
SHAO Gen-ze， SHEN Yan-qin， LI Jing, et al.
Department of Biochemistry,Shantou University Medical College,Shantou 515031,P.R.China
【Abstract】 Objective： To detect mutations of p53 gene in surgical margins with esophageal squamous cell carcinoma and to explore its importance of prognosis. Methods： PCR-SSCP was used to detect mutations of p53 gene in tumor tissue and surgical margins,patients were histopathologically examined in surgical margins. Results： 23 of the 28 patients containing p53 mutations were histopathologically examined negatively in surgical margins.In 13 of these 23 patients,mutations of p53 gene were detected in at least one tumor margin by PCR-SSCP,and they have a much higher rate of recurrence(46% )as well as a poor prognosis.While patients who were negative for p53 mutations in surgical margins have no recurrence of the carcinoma. Conclusions： molecular analysis of surgical margins is useful to identify the position of the sections,it plays an important role in the assessment of tumor s resection,and may help to predict the recurrence of the tumor.
, http://www.100md.com
Key words： Esophageal squamous cell carcinoma； p53； Mutation
潮汕地区是我国南方沿海食管癌高发区，早期食管癌的治疗主要采用外科手术切除。然而手术后仍有近半数患者出现肿瘤复发和转移，传统的方法又无法预测哪一部分人将复发，因而无法制定和实施最佳的术后辅助治疗方案。本研究对HE镜检未见癌侵犯的手术切缘组织进行p53基因突变分析，有助于食管癌手术异常“分子切缘”的确定，对食管癌术后治疗有重要的意义。
1材料和方法
1.1标本
经临床病理检查确诊为食管鳞癌患者88例，其中男53例，女35例，年龄30～70岁。标本来源于汕头大学医学院附属肿瘤医院，为新鲜手术标本，正常对照食管标本取自尸检标本。
, http://www.100md.com 1.2病理组织学检查
每例标本分别取自癌组织、两端切缘组织。OCT包埋，冰冻切片。为确保用作p53基因突变分析的DNA处在HE镜检范围内，对切缘组织按以下方法切片。首先切2～3片(约5μm厚)HE染色光镜检查；再切下10片(25μm厚)在SDS/蛋白酶K混合液中消化，酚/氯仿抽提，提取基因组DNA，用作p53突变分析。再切下2～3片HE染色镜检。
1.3p53基因突变分析
p53基因第5～9外显子引物见表1。以PCRSSCP法分析p53基因突变，方法参见文献〔1，2〕。首先分析癌组织，筛选出p53基因异常病例。再对其中切缘组织HE病理检查未见癌侵犯的病例进行PCR-SSCP分析，观察p53基因突变。
表1 p53基因第5～9外显子引物序列
外显子
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引物序列
长度bp
5
5-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA-3’
181
5-CGCTATCTGAGCAGCGCTCATG-3’
6
5-GATTGCTCTTAGGTCTGGCCCCTCCTCAGC-3
131
5-CAGACCTCAGGCGGCTCATAGG-3’
7
, 百拇医药
5-CTAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCC-3’
118
5-TGACCTGGAGTCTTCCAGTGTG-3’
8
5-GTAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGC-3’
142
5-CTCGTCTAGTGCTCCCTGGGGGC-3’
9
5-TTCCTAGCACTGCCCAACAAC-3’
79
, 百拇医药
5-CTTAGTACCTGAAGGGTGAAATATTC-3’
2结果
以PCR-SSCP法分析88例标本癌组织，发现其中28例存在p53基因第5～9不同外显子突变，突变率为32%。对这28例标本切缘进一步分析，结果如下：
病理学检查：对切缘组织冰冻切片，HE染色镜检，发现其中5例(5/28)有癌细胞残留；余23例切缘未见癌。
分子分析：对上述23例未见癌的切缘组织进行突变分析，发现其中13例切缘存在p53基因突变。手术后随访两年，发现有6例复发；而另10例切缘p53无突变者无一复发，两组病人肿瘤复发率存在显著差异(表2)。
表2 切缘组织p53突变阳性组与阴性组肿瘤复发率比较
, 百拇医药 p53突变
例数
复发例数
复发率
阳性
13
6
46%
阴性
10
0
0
χ2检验：P<0.05
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全部标本的临床病理资料及p53突变分析见表3。
表3 食管癌临床病理特征和p53突变分析
病例
年龄/性别
临床分期/病理分级
切缘镜检
P53突变
预后
1
56/F
T3N0M0/Ⅰ级
, 百拇医药
-，SN
8(M1)
2
59/M
T1N0M0/Ⅱ级
-，SM
3
63/M
T2N0M0/Ⅰ级
-，SN
5(M2)
, http://www.100md.com
4
60/M
T3N1M0/Ⅱ级
-，SN
5(M2)
5
53/F
T1N1M0/Ⅱ级
-，SN
8(M1)
R
, 百拇医药
6
56/M
T4N1M0/Ⅱ级
-，SM
7(M2)
R
7
65/M
T4N0M0/Ⅱ级
-，SN
6(M2)
, 百拇医药
8
67/F
T4N1M0/Ⅲ级
-，SN
8(M2)
9
64/M
T1N0M0/Ⅰ级
-，SN
10
59/F
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T1N0M0/Ⅱ级
-，SN
11
68/M
T2N0M0/Ⅰ级
-，SN
5(M1)
12
62/M
T1N1M0/Ⅱ级
, http://www.100md.com
-，SN
9(M1)
R
13
72/M
T3N0M0/Ⅱ级
-，SN
14
65/F
T3N1M0/Ⅱ级
-，SN
, 百拇医药
5(M2)
R
15
57/M
T2N0M0/Ⅰ-Ⅱ级
-，SN
16
54/M
T1N0M0/Ⅲ级
-，SN
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, 百拇医药
49/M
T1N1M0/Ⅲ级
-，SN
5(M2)
R
18
51/F
T3N0M0/Ⅱ级
-，SN
19
58/M
, http://www.100md.com
T4N1M0/Ⅲ级
-，SN
20
69/M
T1N1M0/Ⅰ级
-，SN
6(M1)
21
61/M
T2N0M0/Ⅰ级
, 百拇医药
-，SN
8(M1)
R
22
53/F
T4N0M0/Ⅰ级
-，SN
23
55/F
T1N0M0/Ⅰ-Ⅱ级
-，SN
, 百拇医药
M1：上端切缘；M2：下端切缘；R：肿瘤复发；-：癌阴性；SN：粘膜正常；SM：粘膜上皮轻度增生，SS：粘膜上皮中度增生
3讨论
手术切除是食管癌早期治疗的重要手段，切缘干净与否是肿瘤预后的主要因素。传统方法对于手术切除是否干净的判断主要基于对切缘组织的细胞形态学观察，即病理组织切片HE染色光镜检查。这种方法根据癌细胞和正常细胞在形态学上的差异进行区分，并根据肿瘤大小、癌细胞的数量、浸润程度、淋巴结转移与否等，对食管癌进行病理分级、临床分期和预后判断，并据此制定治疗对策。此法存在局限性，对于在表型上与正常细胞无可见差异的癌前细胞或具有潜在转化能力的“正常”细胞没有区分力。另一方面，当癌细胞数量只占正常细胞少量的时候或微癌灶只存在于切缘组织某个区域时，极易造成漏检。而病理检查时又不可能对切缘组织全部切片逐片观察。对于一个1cm厚的组织块来说，5μm厚的切片只占其1/2000。因此即使常规病理检查未见癌的患者也常常有肿瘤的复发，预后差。
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现代分子技术的介入和应用，弥补了传统方法的不足，给肿瘤的诊治、预后判断提供了更为客观的科学依据。PCRSSCP是一种基因突变分析手段，具有客观、快速、灵敏的特点，能从成千上万个正常细胞中检测到一个异常的癌细胞〔3〕。肿瘤的发生和演进过程中，细胞将发生一系列遗传学的改变，如一些癌基因激活和抑癌基因失活。而其中某些基因的分子遗传学改变可能就是细胞癌变的标志。寻找建立肿瘤特异的分子标志对肿瘤诊治预防有重要意义〔4〕。近年来研究表明，p53基因是一个肿瘤高度相关的基因，在食管癌中，有30%～50%的患者存在p53基因的突变〔5〕。p53基因突变可能是食管细胞癌变的一个早期事件〔2，6〕。一些貌似正常的癌前细胞可以通过PCRSSCP检测到p53基因的异常。本文以PCR-SSCP技术对经病理组织学检查未见癌的切缘进行p53基因突变分析，以确定其异常的“分子边缘”。研究结果表明，半数切缘镜检未见癌者出现p53基因突变，有趣的是，这部分患者有46%在术后(中位数15月)随访中出现肿瘤复发。而切缘p53基因无突变者(癌组织存在p53基因突变)无一复发。两组病人术后肿瘤复发率有统计学显著差异。肿瘤的复发与癌细胞的扩散和转移密切相关，在病检未见癌的切缘组织中检测到p53基因突变表明，手术切缘有可能残留少量癌细胞或存在具有潜在转化能力的癌前细胞——形态貌似正常但已有分子遗传学的改变，这可能是复发的原因之一；另一个原因是癌细胞的淋巴结转移，从表3可看出，癌细胞淋巴结转移患者具有较高的复发倾向。因此对切缘组织进行p53突变分析，界定其“分子边缘”，并结合肿瘤的临床病理资料，尤其是癌细胞的淋巴结转移，将有助于对食管癌手术的预后判断。应用分子技术探测原癌组织、切缘组织、淋巴结组织乃至血液、唾液、尿液、粪便等临床标本各种可能的细胞分子遗传学的变异，不但能揭示肿瘤产生的机制和演进过程，同时对临床治疗、预后有重要意义〔7〕。
, 百拇医药
基金项目：汕大医学院硕士启动基金资助课题
〔参考文献〕
1 Orita M,Iwahana H,Kanazawa H,et al.Detection of Polymorphisms of Human DNA by Gel Electrophoresis as Single Strand Conformation Polymorphism.Proc.Natl.Acad Sci〔J〕 .USA,1989,86(8):2766.
2 邵根泽，任运生，张少英，等.食管癌p53基因突变与int-2癌基因扩增的关系〔J〕.中华医学遗传学杂志，1997，14(5)：316.
3 Brennan JA,Mao L,Hruban RH,et al.Molecular Assessment of Histopathological Staging in Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck〔 J〕 .N Eng1 J Med.1995,332:429.
, http://www.100md.com
4 Koch WM,Boyle JO,Mao L,et al.p53 Gene Mutations as Markers of Tumor Spread in Synchronous Oral Cancers〔 J〕 .Arch Otolaryngol Head Neck Surg.1994,120:943
5 Hollstein M,Sidransky D,Vogelstein B,et al.p53 Mutations in Human Cancer〔J〕 .Science,1991,253:49.
6 李华川，陆士新.食管癌和贲门癌组织中p53基因突变的研究〔J〕中华肿瘤杂志，1994，16(3)：172.
7 Boyle JO,Koch W,Sidransky D.et al.Molecular Screening:Prospects for a New Approach〔 J〕 .Arch Otolaryngol Head Neck Surg,1993,119:1187.
收稿日期：1998-04-02；修回日期：1998-10-20, 百拇医药