基因打靶及其在神经生物学的应用
作者：许增禄
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京100005
关键词：
解剖学报00zk06
【中图分类号】 R322.8；Q343.1 【 文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)-增-21
GENE TARGETING AND ITS APPLICATIONS IN NEUROBIOLOGY
1.基因打靶概述
分子生物学的方法证明，能在细胞内稳定遗传的外来基因是以两种方式整合于某一染色体上的，一是随机整合，二是定向地整合于基因组DNA的特定位点上。第2种方式即为基因打靶[1]。
, 百拇医药
基因打靶是80年代发展起来的新技术，是一种通过同源重组按预期方式改变生物活体的遗传信息的实验手段，亦称为基因定点同源重组。
活细胞染色体DNA与外源性DNA间的基因重组可为同源重组，也可为非同源重组。外源DNA片段大且同源性强者与宿主基因片段互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换的可能，称为同源重组。基因打靶选择的特定位点在基因的同源区。
小鼠胚胎干细胞(ES细胞)具有特殊且重要的生物性能。它源自小鼠早期胚胎的内细胞团，能在体外培养并保留发育的全性能。在体外进行遗传操作后，重新移植回小鼠胚胎，可发育成胚胎的各种组织。基因打靶技术结合这种ES细胞系统，已经产生了数百种带突变基因的转基因小鼠，使研究者得以从生物整体上研究高等动物基因表达、调控及生理功能，并用来研究人类疾病的分子机制和用作人类疾病的动物模型。
基因打靶的主要步骤：
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(1)重组基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因、tk基因)的载体上。此重组载体即为基因打靶载体。
(2)用电穿孔、显微注射等方法把上述重组DNA转入受体细胞核内。显微注射法命中率较高，但技术难度大；电穿孔命中率低，但易于操作。
(3)用选择性培养基筛选已击中的细胞。正负选择法双向选择，剩下的细胞为命中细胞。
(4)观察被击中细胞的生物学特征：将已击中的胚胎干细胞转入胚胎使其生长，对转基因动物进行形态学及分子生物学检测。
采用不同的策略进行打靶载体的构建，不仅能简单地使基因失活，而且能将更精细的突变引入ES细胞染色体中，如基因敲除(gene knock out)、“打了就跑”( hit and ran )、双置换法(in-out )[2]、基因敲入(gene knock in )[3]。其中基因敲除及基因敲入是最常用的策略。基因敲除的打靶载体上设有一段与欲灭活的靶基因有高度同源性的 外源基因。比较“敲除”掉某基因鼠与正常鼠的各种生物功能，为基础科研提供了方便的动物体系。在基因敲除转基因鼠的研究中，发现了一些令人惊异的现象，一些原被认为功能十分重要的基因被“敲除”后，其表型仍表现正常，提示基因产物间存在着人所未知的更复杂的相互关系，这种关系决定了一种蛋白的功能。由于传统基因敲除技术制造的某些基因的简单失活常常导致令人费解的无改变的表型，一种新方法“基因敲入” 法应运而生，以证明某些基因取代了被敲除的靶基因的功能。
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基因打靶技术是80年代后期发展起来的新兴的分子生物学技术，具有定位性强、打靶后新的基因有随染色体DNA稳定遗传的特点，具有广阔的应用前景。
神经系统基因表达模式有明显的区域性。不同的神经元具有产生不同神经递质及其受体的酶系。其他的蛋白质分布更广泛，如中间丝蛋白质神经丝或胶原纤维酸性蛋白质 或普遍存在的粘附分子、神经细胞粘附分子和整合素[4]，它们在神经系统之外也有丰富的表达。因此，基因打靶能影响这些神经元的生物学特征，而表达基因的缺失能有更严重的基因表型结果，包括胚胎致死。如基因打靶在csk位点可导致神经管缺陷和胚胎死亡[5]。基因打靶在神经调节蛋白基因位点其表型是施万细胞前体和脑神经节缺失、心脏畸形、胚胎死亡[6]。
基因打靶技术近期令人兴奋的进展是由Cre介导的loxP特异重组[7]。该系统允许进行时空控制的遗传修饰应用Cre-loxP技术，通过基因敲除克服早期胚胎死亡，在胚胎发育后期研究基因失活作用。可应用Cre-loxP技术产生特异顺序的基因敲除，例如具有不同组织分布和功能的剪接变体。
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2.小鼠无效突变体
目前，在胚胎干细胞应用同源重组的基因打靶是一项广泛采用的技术[8]。用打靶载体转染多能胚胎干细胞，并将以同源重组进行基因打靶的细胞注射进胚泡，这些细胞能对组织发挥作用。
设计基因打靶策略时，要考虑许多参数。应用若干千碱基同源DNA进行基因打靶大大增加了胚胎干细胞基因打靶效率[9]。研究者已从基因组129/SV文库中克隆了许多整合素(integrin)基因并成功进行了基因打靶。图1给出2个能应用的打靶载体的例子。含有ATG开始密码的关键外显子(图1a)可被打靶载体选择性标志物置换(图1b)。换言之，将可选择性标志物置于外显子内侧(图1c)。多数情况，在普遍存在的启动子如小鼠蛋白激酶-1启动子(PKG-1)的控制下，使用潮霉素[10]或新霉素[11]抗性基因进行基因打靶。打靶位点含有一个选择标志物时，内源基因的转录受到干扰。已有许多文章报道同源重组，将单纯泡疹病毒(HSV)胸腺嘧啶蛋白盒置于结构的末端[12]，允许对任意整合事件的负选择，常规应用没有上述盒的结构。研究者使用的结构由3～7千碱基的同源顺序，侧翼有选择性标志物盒，基因打靶效率从10%达60%，但同源重组效率可以取决于序列、甲基化或染色质结构。
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图1示2个不同基因打靶载体产生的小鼠基因
a.1个或更多关键外显子将使基因失活
b.含有ATG开始密码的外显子和部分启动子被PGK-neo-(A)n盒 置换
c.将同样的盒引导入外显子，防止内源基因的转录，选择剪切可形成部分功能基因产物
3.Cre-loxP系统在外显子特异的基因敲除 小鼠中的应用
小鼠的基因打靶经常导致胚胎死亡[13]。与此相反，其他情况未观察到明显的表现型。以调节发育的方式表达的特异剪接变体可能不需要完全的基因破坏。此时，特异外显子的基因敲除可达到此目的。从图1可见，不能使用外显子缺失由选择性标志物替换的打靶载体，因为这将导致完全的基因敲除。需要更精密的方法，应用Cre-loxP系统。Cre是38kD重组酶蛋白，由大肠杆菌噬菌体P1编码。它能识别loxP，1个34bp序列，含有2个13bp反向重复片段，由8bp间隙分隔开,它们一起形成Cre重组酶的两个连接位点[14]。假如两个loxP位点存在于DNA片段，Cre介导的重组可能导致倒位或去除loxP侧翼DNA片段。Cre介导在loxP位点特异位点的重组已在原核细胞中广泛研究[15]，也在哺乳动物离体细胞中进行了观察。Cre的表达导致了在loxP位点的重组，并且去除了loxP侧翼的序列，明确了真核细 胞体系也能应用基因打靶方法。
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图2a表明外显子特异的基因敲除策略。打靶载体由同源序列组成，缺失的外显子将被新霉素抗性基因(neor-tk)盒替换(图2b)。 打靶载体整合到基因组，将参照G418对转染胚胎干细胞的抗性(图2c)。应用Southern blot分析已被确定的同源重组的克隆。这些细胞以编码Cre重组酶的质粒瞬时转染(图2d)并在含有丙氧鸟苷不含G418的培养基中培养。Cre介导的重组出现后，neor-tk盒从基因中被切除，在内显子内保留了loxP位点(图2e)。这些克隆不再表达tk并且不受丙氧鸟苷存在的影响。Southern blot分析证实选择性克隆具有正确重组。必须进一步检查Cre编码的质粒未被整合入基因组。胚胎干细胞克隆满足如下的要求，即基因组内打靶等位基因内，外显子和某些上游及下游序列由loxP位点置换。将这些细胞注射入胚泡。此基因位点的转录将最终导致信息变异体缺少1个外显子。在小鼠IgH基因应用此方法成功地去除JH片段和内显子增强子。在杂合子小鼠的B细胞，在μ基因开关区域开关重组的诱导导致免疫球蛋白同种型极大减少[16]。
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图2 特异外显子基因敲除策略
a.含有6个显子(1～6基因编码蛋白质，将去除外显子3
b.以neo-tk盒代替基因打靶载体外显子3，其两侧翼有同样方向的loxp位点(实体三角形)
c.同源重组使胚胎干细胞具有等位基因
d.编码Cre重组酶质粒瞬时表达将导致在loxp位点重组和neo-t k盒的去除
e.应用含有重组等位基因胚胎干细胞注射入胚泡，产生纯合子突变小鼠，基因转录产生截短的信使和突变蛋白质
上述方法可用于使脑来源神经营养因子(BDNF)基因座特异外显子缺失。作为替换剪接和聚腺苷酸化的结果，8个不同的mRNA由BDNF基因转录，也找到多个启动子区域的证据。证明剪接变异体有不同的表达。发现变异体在心脏和肺组织内含有外显子Ⅰ～Ⅲ，用红藻氨酸处理后其表达被上调。发现变异体在心脏和肺组织内含有外显子Ⅳ，其表达对红藻氨酸处理不敏感。通过构建基因打靶载体，根据图2的方法，使此载体的外显子缺失可能证明在脑内外显子Ⅰ～Ⅲ的功能。
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4.条件基因敲除(conditional knockouts)
Cre-loxp系统以转基因方法应用于生物体，使得小鼠遗传学的研究有了新的途径[17]，在这些情况中，基因打靶的破坏是致死性的。组织特异基因敲除方法可用于细胞或组织的表型分析，删除小鼠的DNA聚合酶β基因导致致死表型。应用条件基因敲除方法可指导特异的T细胞的某种基因的完全敲除[18]。此方法基于细胞特异类型表达的Cre重组酶转基因，由T细胞特异启动子lck驱动。利用内在特异组织表达白细胞介素-2受体γ链基因获得特异组织的基因敲除。Cre重组酶转基因的表达只影响正常合成这种受体的亚细胞[19]。在神经系统有高度特化的亚细胞口可以应用此方法。以这种方式。通过在loxP位点Cre介导重组，一种特异的启动子能驱动破坏只在那些神经元中普遍表达的基因。
条件基因敲除打靶载体结构比用于特异序列基因敲除的更复杂。neor-tk盒侧翼有两个同样方向的loxP位点位于将被删除序列的一侧。在同一方向的另一侧，有第3个loxP位点(图3b)。loxP位点可以通过亚克隆导入，也可以应用含有loxP序列的引物通过基因序列的PCR扩增 ，继之亚克隆。此结构的整合参照胚胎干细胞对G418的抗性，已由Southern blot分析证实适当的基因打靶(图3c)。已同源重组的克隆，应用Cre编码的质粒(图3d)瞬时转染，并在含有丙氧鸟苷不含G418的培养基中选择。Cre基因表达将导致3种类型特异定点重组事件。保留了Ⅰ型重组neor-tk盒(图3e)，这些克隆在选择培养基中将不存活。Ⅱ型重组，只有neor-tk盒被除去，产生了携带有突变等位基因能存活的细胞，等位基因序列侧翼有2个loxP位点可行基因打靶(图3f)。第3种类型的重组去除了相距最远的loxP位点间的插入，这也产生了抗丙氧鸟苷的细胞。应用Southern blot分析这两种类型幸存者之间 的区别，显而易见的原因是Cre编码的质粒没有被整合入基因组。将图3f描述的携带1 个突变的等位基因的胚胎干细胞注射入胚泡，在嵌合动物回交后，小鼠将获得1个突变等位 基因。所产生的转基因小鼠含有特异组织启动子驱动的Cre重组酶(图3g)。携带lox P侧翼序列的杂合子突变小鼠与稳定表达Cre转基因小鼠杂交。所产生的子代小鼠有携带loxP侧翼序列的杂合子，也具有Cre转基因。在这些小鼠中，在loxP定位的Cre介导的重组将导致只在Cre存在的细胞中去除loxP侧翼基因片段。换言之，特异组织启动于驱动Cre的表达，随后的重组产生特异组织基因敲除小鼠(图3h)。
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第一件事涉及含有loxP侧翼序列。研究证实，仅仅loxP位点存在对基因的内源表达没有影响。在带有loxP等位基因纯合子的小鼠中可进行实验。第二件事涉及具有启动子Cre的转基因小鼠。在loxP位点通过Cre驱动的启动子的渗漏不合适重组，能导致不需要的副作用，如提前重组和随后的胚胎死亡。由于在loxP位点Cre介导的重组是很有效的反应，低水平的Cre足 以进行重组。通过报道基因小鼠选择启动子本底活性低的，在LoxP位点Cre介导的重组将使LacZ或编码胶质酸性蛋白质(GFP)的基因转录。产生的重组报道动物的组织切片报道基因的形态观察有力的说明了启动子的组织特异性和重组的效率。应用 施万细胞特异的髓鞘蛋白质(Po)基因和人生长激素基因组成的结构产生转基因动物，作为报道动物[19]。在转基因小鼠中，报道基因只能在形成髓鞘的施万细胞中检测到，在中枢神经系统和其他组织检测不到。人生长激素的表达伴随着髓鞘发育调节时间进程。将Po启动子置于白喉毒素A链基因上游，转基因动物的形成髓鞘施万细胞死于毒素编码基因表达的结果，小鼠发生了延及全身的髓鞘形成减少的周围神经病变[19] 。
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图3 组织特异基因敲除策略
a.在某些组织中要删除的基因，含有ATG开始密码的外显子1将被删除
b.构成基因打靶载体，外显子1两侧翼有loxP，neo-tk盒插入到另一侧
c.含有3个loxP和1个neo-tk盒的突变等位基因
d.Cre编码质粒瞬时表达产生3种类型特异位点的重组
e.第1种类型重组，去除了外显子1
f.第2种类型重组，去除neo-tk盒
g.产生了转基因小鼠，有组织特异启动子P驱动Cre重组酶表达，通过回交，获得显示在(f)中等位基因的纯合子，并具有Cre转基因
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h.在这些动物中，Cre组织特异表达将导致组织特异去除外显子1，保留了 loxP位点
可应用组织特异基因敲除小鼠的方法研究神经系统特殊部位一种普遍存在的基因作用。许多报道已证明了神经系统与细胞外基质蛋白质的密切关系，如在神经系统发育过程中神经嵴细胞迁移涉及的迁维粘连蛋白(fibronectin)、层粘连蛋白(laminin)和整合素型的细胞基质粘附受体[20]。在这些粘附过程中，整合素α5β1可能起关键作用。已有的研究表明，完全删除整合素β1基因可导致植入后死亡，而整合素α5基因的失活引起胚胎致死。假如基因失活引起胚胎致死，通过神经嵴特异的整合素基因敲除小鼠可以研究整合α5或β1的作用。
5.组织特异和诱导型启动子
研究者们已克隆和鉴定了各种神经系统特异启动子或5’侧翼区域。假如loxP侧翼DNA序列存在于基因组中，含有这些启动子的结构和Cre编码的基因将允许Cre组织特异表达及随后在这些组织内于loxP位点的重组。
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如果可以选择重组的时间点，则可以扩展Cre-loxP系统的应用，在HeLe细胞中，利用含有大肠杆菌Tn 10抗四环素操纵子的控制元件获得第1个结果。通过在t et阻抑物和激活的单纯疱疹病毒蛋白质16之间融合基因上游插入巨细胞病毒IE启动子， 获得了四环素调控的反式激活蛋白片段。报道基因与该反式激活蛋白片段的同时存在激发了 四环素依赖的报道基活性。通过改变四环素的浓度可调节转录的开关。四环素诱导基因活化 的效率取决于所应用的诱导物和细胞类型[21]，最近在转基因动物中证明了四环素诱导型基因活化的应用。Furth 等[22]的实验表明，应用四环素处理可以激活两种不同的报道基因荧光素酶和LacZ[22]。
最近报道了一种诱导型体系，将人雌激素受体的配体结合片段连接到Cre基因[23]。应用雌激素的拮抗剂4-羟三苯氧氨处理可激活Cre的表达。在胚胎癌 细胞中，引起以前基因打靶的等位基因的视黄酸X受体的loxP特异重组。
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6.展望
随着基因打靶研究工作的进展，在体和离体的时空可控的基因打靶的应用具有广阔的前景。在一定的条件下，胚胎干细胞可以分化为表达离体培养神经元性质的细胞[24]。胚胎干细胞聚集生长，用视黄酸处理后，它们表达对神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞特异的抗原并建立神经元网络。这些神经元样细胞显示潜在的作用，在它们表面表达河豚毒素钠通道[24]，并形成功能突触[25]。将聚集的胚胎干细胞分离并单层培养，可离体研究神经元的性质。该方法极大地扩展了神经元细胞研究的范围，有利于探索神经生物学问题。应用复制缺损腺病毒[7]或逆转录病毒[26]将Cre编码基因导入供体基因组可获得对在体Cre介导loxP特异重组加强控制。该系统的有效性已在离体的哺乳动物细胞中得到证实。在不久的将来，该系统在动物体内的使用不会存在技术障碍。将上述方法和诱导型启动子系统结合可以产生条件无效突变小鼠，能够精确地控制基因失活的区域和开始。
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注：图1～3仿自Ronald van der Neut[27]
【作者简介】许增禄(1945—)，男(汉族)，河北省铙阳县人，教 授，博士生导师，室主任
参考文献
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【收稿日期】2000-07-17, 百拇医药
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京100005
关键词：
解剖学报00zk06
【中图分类号】 R322.8；Q343.1 【 文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)-增-21
GENE TARGETING AND ITS APPLICATIONS IN NEUROBIOLOGY
1.基因打靶概述
分子生物学的方法证明，能在细胞内稳定遗传的外来基因是以两种方式整合于某一染色体上的，一是随机整合，二是定向地整合于基因组DNA的特定位点上。第2种方式即为基因打靶[1]。
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基因打靶是80年代发展起来的新技术，是一种通过同源重组按预期方式改变生物活体的遗传信息的实验手段，亦称为基因定点同源重组。
活细胞染色体DNA与外源性DNA间的基因重组可为同源重组，也可为非同源重组。外源DNA片段大且同源性强者与宿主基因片段互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换的可能，称为同源重组。基因打靶选择的特定位点在基因的同源区。
小鼠胚胎干细胞(ES细胞)具有特殊且重要的生物性能。它源自小鼠早期胚胎的内细胞团，能在体外培养并保留发育的全性能。在体外进行遗传操作后，重新移植回小鼠胚胎，可发育成胚胎的各种组织。基因打靶技术结合这种ES细胞系统，已经产生了数百种带突变基因的转基因小鼠，使研究者得以从生物整体上研究高等动物基因表达、调控及生理功能，并用来研究人类疾病的分子机制和用作人类疾病的动物模型。
基因打靶的主要步骤：
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(1)重组基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因、tk基因)的载体上。此重组载体即为基因打靶载体。
(2)用电穿孔、显微注射等方法把上述重组DNA转入受体细胞核内。显微注射法命中率较高，但技术难度大；电穿孔命中率低，但易于操作。
(3)用选择性培养基筛选已击中的细胞。正负选择法双向选择，剩下的细胞为命中细胞。
(4)观察被击中细胞的生物学特征：将已击中的胚胎干细胞转入胚胎使其生长，对转基因动物进行形态学及分子生物学检测。
采用不同的策略进行打靶载体的构建，不仅能简单地使基因失活，而且能将更精细的突变引入ES细胞染色体中，如基因敲除(gene knock out)、“打了就跑”( hit and ran )、双置换法(in-out )[2]、基因敲入(gene knock in )[3]。其中基因敲除及基因敲入是最常用的策略。基因敲除的打靶载体上设有一段与欲灭活的靶基因有高度同源性的 外源基因。比较“敲除”掉某基因鼠与正常鼠的各种生物功能，为基础科研提供了方便的动物体系。在基因敲除转基因鼠的研究中，发现了一些令人惊异的现象，一些原被认为功能十分重要的基因被“敲除”后，其表型仍表现正常，提示基因产物间存在着人所未知的更复杂的相互关系，这种关系决定了一种蛋白的功能。由于传统基因敲除技术制造的某些基因的简单失活常常导致令人费解的无改变的表型，一种新方法“基因敲入” 法应运而生，以证明某些基因取代了被敲除的靶基因的功能。
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基因打靶技术是80年代后期发展起来的新兴的分子生物学技术，具有定位性强、打靶后新的基因有随染色体DNA稳定遗传的特点，具有广阔的应用前景。
神经系统基因表达模式有明显的区域性。不同的神经元具有产生不同神经递质及其受体的酶系。其他的蛋白质分布更广泛，如中间丝蛋白质神经丝或胶原纤维酸性蛋白质 或普遍存在的粘附分子、神经细胞粘附分子和整合素[4]，它们在神经系统之外也有丰富的表达。因此，基因打靶能影响这些神经元的生物学特征，而表达基因的缺失能有更严重的基因表型结果，包括胚胎致死。如基因打靶在csk位点可导致神经管缺陷和胚胎死亡[5]。基因打靶在神经调节蛋白基因位点其表型是施万细胞前体和脑神经节缺失、心脏畸形、胚胎死亡[6]。
基因打靶技术近期令人兴奋的进展是由Cre介导的loxP特异重组[7]。该系统允许进行时空控制的遗传修饰应用Cre-loxP技术，通过基因敲除克服早期胚胎死亡，在胚胎发育后期研究基因失活作用。可应用Cre-loxP技术产生特异顺序的基因敲除，例如具有不同组织分布和功能的剪接变体。
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2.小鼠无效突变体
目前，在胚胎干细胞应用同源重组的基因打靶是一项广泛采用的技术[8]。用打靶载体转染多能胚胎干细胞，并将以同源重组进行基因打靶的细胞注射进胚泡，这些细胞能对组织发挥作用。
设计基因打靶策略时，要考虑许多参数。应用若干千碱基同源DNA进行基因打靶大大增加了胚胎干细胞基因打靶效率[9]。研究者已从基因组129/SV文库中克隆了许多整合素(integrin)基因并成功进行了基因打靶。图1给出2个能应用的打靶载体的例子。含有ATG开始密码的关键外显子(图1a)可被打靶载体选择性标志物置换(图1b)。换言之，将可选择性标志物置于外显子内侧(图1c)。多数情况，在普遍存在的启动子如小鼠蛋白激酶-1启动子(PKG-1)的控制下，使用潮霉素[10]或新霉素[11]抗性基因进行基因打靶。打靶位点含有一个选择标志物时，内源基因的转录受到干扰。已有许多文章报道同源重组，将单纯泡疹病毒(HSV)胸腺嘧啶蛋白盒置于结构的末端[12]，允许对任意整合事件的负选择，常规应用没有上述盒的结构。研究者使用的结构由3～7千碱基的同源顺序，侧翼有选择性标志物盒，基因打靶效率从10%达60%，但同源重组效率可以取决于序列、甲基化或染色质结构。
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图1示2个不同基因打靶载体产生的小鼠基因
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c.将同样的盒引导入外显子，防止内源基因的转录，选择剪切可形成部分功能基因产物
3.Cre-loxP系统在外显子特异的基因敲除 小鼠中的应用
小鼠的基因打靶经常导致胚胎死亡[13]。与此相反，其他情况未观察到明显的表现型。以调节发育的方式表达的特异剪接变体可能不需要完全的基因破坏。此时，特异外显子的基因敲除可达到此目的。从图1可见，不能使用外显子缺失由选择性标志物替换的打靶载体，因为这将导致完全的基因敲除。需要更精密的方法，应用Cre-loxP系统。Cre是38kD重组酶蛋白，由大肠杆菌噬菌体P1编码。它能识别loxP，1个34bp序列，含有2个13bp反向重复片段，由8bp间隙分隔开,它们一起形成Cre重组酶的两个连接位点[14]。假如两个loxP位点存在于DNA片段，Cre介导的重组可能导致倒位或去除loxP侧翼DNA片段。Cre介导在loxP位点特异位点的重组已在原核细胞中广泛研究[15]，也在哺乳动物离体细胞中进行了观察。Cre的表达导致了在loxP位点的重组，并且去除了loxP侧翼的序列，明确了真核细 胞体系也能应用基因打靶方法。
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图2a表明外显子特异的基因敲除策略。打靶载体由同源序列组成，缺失的外显子将被新霉素抗性基因(neor-tk)盒替换(图2b)。 打靶载体整合到基因组，将参照G418对转染胚胎干细胞的抗性(图2c)。应用Southern blot分析已被确定的同源重组的克隆。这些细胞以编码Cre重组酶的质粒瞬时转染(图2d)并在含有丙氧鸟苷不含G418的培养基中培养。Cre介导的重组出现后，neor-tk盒从基因中被切除，在内显子内保留了loxP位点(图2e)。这些克隆不再表达tk并且不受丙氧鸟苷存在的影响。Southern blot分析证实选择性克隆具有正确重组。必须进一步检查Cre编码的质粒未被整合入基因组。胚胎干细胞克隆满足如下的要求，即基因组内打靶等位基因内，外显子和某些上游及下游序列由loxP位点置换。将这些细胞注射入胚泡。此基因位点的转录将最终导致信息变异体缺少1个外显子。在小鼠IgH基因应用此方法成功地去除JH片段和内显子增强子。在杂合子小鼠的B细胞，在μ基因开关区域开关重组的诱导导致免疫球蛋白同种型极大减少[16]。
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图2 特异外显子基因敲除策略
a.含有6个显子(1～6基因编码蛋白质，将去除外显子3
b.以neo-tk盒代替基因打靶载体外显子3，其两侧翼有同样方向的loxp位点(实体三角形)
c.同源重组使胚胎干细胞具有等位基因
d.编码Cre重组酶质粒瞬时表达将导致在loxp位点重组和neo-t k盒的去除
e.应用含有重组等位基因胚胎干细胞注射入胚泡，产生纯合子突变小鼠，基因转录产生截短的信使和突变蛋白质
上述方法可用于使脑来源神经营养因子(BDNF)基因座特异外显子缺失。作为替换剪接和聚腺苷酸化的结果，8个不同的mRNA由BDNF基因转录，也找到多个启动子区域的证据。证明剪接变异体有不同的表达。发现变异体在心脏和肺组织内含有外显子Ⅰ～Ⅲ，用红藻氨酸处理后其表达被上调。发现变异体在心脏和肺组织内含有外显子Ⅳ，其表达对红藻氨酸处理不敏感。通过构建基因打靶载体，根据图2的方法，使此载体的外显子缺失可能证明在脑内外显子Ⅰ～Ⅲ的功能。
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4.条件基因敲除(conditional knockouts)
Cre-loxp系统以转基因方法应用于生物体，使得小鼠遗传学的研究有了新的途径[17]，在这些情况中，基因打靶的破坏是致死性的。组织特异基因敲除方法可用于细胞或组织的表型分析，删除小鼠的DNA聚合酶β基因导致致死表型。应用条件基因敲除方法可指导特异的T细胞的某种基因的完全敲除[18]。此方法基于细胞特异类型表达的Cre重组酶转基因，由T细胞特异启动子lck驱动。利用内在特异组织表达白细胞介素-2受体γ链基因获得特异组织的基因敲除。Cre重组酶转基因的表达只影响正常合成这种受体的亚细胞[19]。在神经系统有高度特化的亚细胞口可以应用此方法。以这种方式。通过在loxP位点Cre介导重组，一种特异的启动子能驱动破坏只在那些神经元中普遍表达的基因。
条件基因敲除打靶载体结构比用于特异序列基因敲除的更复杂。neor-tk盒侧翼有两个同样方向的loxP位点位于将被删除序列的一侧。在同一方向的另一侧，有第3个loxP位点(图3b)。loxP位点可以通过亚克隆导入，也可以应用含有loxP序列的引物通过基因序列的PCR扩增 ，继之亚克隆。此结构的整合参照胚胎干细胞对G418的抗性，已由Southern blot分析证实适当的基因打靶(图3c)。已同源重组的克隆，应用Cre编码的质粒(图3d)瞬时转染，并在含有丙氧鸟苷不含G418的培养基中选择。Cre基因表达将导致3种类型特异定点重组事件。保留了Ⅰ型重组neor-tk盒(图3e)，这些克隆在选择培养基中将不存活。Ⅱ型重组，只有neor-tk盒被除去，产生了携带有突变等位基因能存活的细胞，等位基因序列侧翼有2个loxP位点可行基因打靶(图3f)。第3种类型的重组去除了相距最远的loxP位点间的插入，这也产生了抗丙氧鸟苷的细胞。应用Southern blot分析这两种类型幸存者之间 的区别，显而易见的原因是Cre编码的质粒没有被整合入基因组。将图3f描述的携带1 个突变的等位基因的胚胎干细胞注射入胚泡，在嵌合动物回交后，小鼠将获得1个突变等位 基因。所产生的转基因小鼠含有特异组织启动子驱动的Cre重组酶(图3g)。携带lox P侧翼序列的杂合子突变小鼠与稳定表达Cre转基因小鼠杂交。所产生的子代小鼠有携带loxP侧翼序列的杂合子，也具有Cre转基因。在这些小鼠中，在loxP定位的Cre介导的重组将导致只在Cre存在的细胞中去除loxP侧翼基因片段。换言之，特异组织启动于驱动Cre的表达，随后的重组产生特异组织基因敲除小鼠(图3h)。
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第一件事涉及含有loxP侧翼序列。研究证实，仅仅loxP位点存在对基因的内源表达没有影响。在带有loxP等位基因纯合子的小鼠中可进行实验。第二件事涉及具有启动子Cre的转基因小鼠。在loxP位点通过Cre驱动的启动子的渗漏不合适重组，能导致不需要的副作用，如提前重组和随后的胚胎死亡。由于在loxP位点Cre介导的重组是很有效的反应，低水平的Cre足 以进行重组。通过报道基因小鼠选择启动子本底活性低的，在LoxP位点Cre介导的重组将使LacZ或编码胶质酸性蛋白质(GFP)的基因转录。产生的重组报道动物的组织切片报道基因的形态观察有力的说明了启动子的组织特异性和重组的效率。应用 施万细胞特异的髓鞘蛋白质(Po)基因和人生长激素基因组成的结构产生转基因动物，作为报道动物[19]。在转基因小鼠中，报道基因只能在形成髓鞘的施万细胞中检测到，在中枢神经系统和其他组织检测不到。人生长激素的表达伴随着髓鞘发育调节时间进程。将Po启动子置于白喉毒素A链基因上游，转基因动物的形成髓鞘施万细胞死于毒素编码基因表达的结果，小鼠发生了延及全身的髓鞘形成减少的周围神经病变[19] 。
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图3 组织特异基因敲除策略
a.在某些组织中要删除的基因，含有ATG开始密码的外显子1将被删除
b.构成基因打靶载体，外显子1两侧翼有loxP，neo-tk盒插入到另一侧
c.含有3个loxP和1个neo-tk盒的突变等位基因
d.Cre编码质粒瞬时表达产生3种类型特异位点的重组
e.第1种类型重组，去除了外显子1
f.第2种类型重组，去除neo-tk盒
g.产生了转基因小鼠，有组织特异启动子P驱动Cre重组酶表达，通过回交，获得显示在(f)中等位基因的纯合子，并具有Cre转基因
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h.在这些动物中，Cre组织特异表达将导致组织特异去除外显子1，保留了 loxP位点
可应用组织特异基因敲除小鼠的方法研究神经系统特殊部位一种普遍存在的基因作用。许多报道已证明了神经系统与细胞外基质蛋白质的密切关系，如在神经系统发育过程中神经嵴细胞迁移涉及的迁维粘连蛋白(fibronectin)、层粘连蛋白(laminin)和整合素型的细胞基质粘附受体[20]。在这些粘附过程中，整合素α5β1可能起关键作用。已有的研究表明，完全删除整合素β1基因可导致植入后死亡，而整合素α5基因的失活引起胚胎致死。假如基因失活引起胚胎致死，通过神经嵴特异的整合素基因敲除小鼠可以研究整合α5或β1的作用。
5.组织特异和诱导型启动子
研究者们已克隆和鉴定了各种神经系统特异启动子或5’侧翼区域。假如loxP侧翼DNA序列存在于基因组中，含有这些启动子的结构和Cre编码的基因将允许Cre组织特异表达及随后在这些组织内于loxP位点的重组。
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如果可以选择重组的时间点，则可以扩展Cre-loxP系统的应用，在HeLe细胞中，利用含有大肠杆菌Tn 10抗四环素操纵子的控制元件获得第1个结果。通过在t et阻抑物和激活的单纯疱疹病毒蛋白质16之间融合基因上游插入巨细胞病毒IE启动子， 获得了四环素调控的反式激活蛋白片段。报道基因与该反式激活蛋白片段的同时存在激发了 四环素依赖的报道基活性。通过改变四环素的浓度可调节转录的开关。四环素诱导基因活化 的效率取决于所应用的诱导物和细胞类型[21]，最近在转基因动物中证明了四环素诱导型基因活化的应用。Furth 等[22]的实验表明，应用四环素处理可以激活两种不同的报道基因荧光素酶和LacZ[22]。
最近报道了一种诱导型体系，将人雌激素受体的配体结合片段连接到Cre基因[23]。应用雌激素的拮抗剂4-羟三苯氧氨处理可激活Cre的表达。在胚胎癌 细胞中，引起以前基因打靶的等位基因的视黄酸X受体的loxP特异重组。
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6.展望
随着基因打靶研究工作的进展，在体和离体的时空可控的基因打靶的应用具有广阔的前景。在一定的条件下，胚胎干细胞可以分化为表达离体培养神经元性质的细胞[24]。胚胎干细胞聚集生长，用视黄酸处理后，它们表达对神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞特异的抗原并建立神经元网络。这些神经元样细胞显示潜在的作用，在它们表面表达河豚毒素钠通道[24]，并形成功能突触[25]。将聚集的胚胎干细胞分离并单层培养，可离体研究神经元的性质。该方法极大地扩展了神经元细胞研究的范围，有利于探索神经生物学问题。应用复制缺损腺病毒[7]或逆转录病毒[26]将Cre编码基因导入供体基因组可获得对在体Cre介导loxP特异重组加强控制。该系统的有效性已在离体的哺乳动物细胞中得到证实。在不久的将来，该系统在动物体内的使用不会存在技术障碍。将上述方法和诱导型启动子系统结合可以产生条件无效突变小鼠，能够精确地控制基因失活的区域和开始。
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注：图1～3仿自Ronald van der Neut[27]
【作者简介】许增禄(1945—)，男(汉族)，河北省铙阳县人，教 授，博士生导师，室主任
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【收稿日期】2000-07-17, 百拇医药