人癌胚抗原重组痘苗病毒在动物体内免疫原性的研究
作者：杨洁 卢方安 罗超权 伍新尧 杨英浩
单位：中山医科大学生化教研室(广州，510089)
关键词：癌胚抗原；痘苗病毒；免疫原性
癌症99zk37
中图号：Q344.13文献标识码：A
文章编号：1000-467X(1999)s0-0099-01
本文报告癌胚抗原cDNA重组痘苗病毒(CEArV)在体内能有效地表达CEA，并激活机体产生抗CEA抗体。
1.材料与方法
CEArV的构建具体见文献〔1〕。
, 百拇医药
CEArV接种新西兰兔：纯种新西兰兔21只，分为3组。(1)组实验组，选兔12只，雌雄各半，背部皮下注射接种CEArV，剂量为106PFU/次。由于每次接种后1周须取兔的接种部皮肤、肌肉和内脏(肝、脾、小肠、胃等)检测CEA的表达情况，因此将(1)组进一步分为4组，分别为(1)1～(1)4组，每只兔接种3次，前2次间隔1周，最后1次间隔2周，(2)组对照组，接种野生型痘苗病毒，选兔6只，雌雄各半，进一步分为(2)-1和(2)-2组，分别在第1次和第2次接种后1周取兔的内脏检测CEA。(3)组对照组，选兔3只，接种生理盐水。
于每次接种前抽取耳缘静脉血，用放射免疫法测定血清中CEA的含量，用表达人CEA的人类803胃癌细胞株作为抗原片，ABC免疫组化法测定抗CEA抗体的产生。并送检血常规及部分生化指标。
2.结果
CEA表达结果见表1，实验组(1)组中，将接种CEArV前后兔血清中CEA含量作秩和检验，P<0.01,接种CEA-rV前后兔血清中CEA含量存在显著差异,说明接种CEA-rV后,使兔血清中CEA的含量明显增加。对照组(2)组中，将接种野生型痘病毒前后兔血清中CEA的测定值作秩和检验，两组数值之间无差异(P>0.05)，即接种野生型痘苗病毒后对兔体内CEA的含量无影响。
, 百拇医药
表1 放射免疫法测定兔体内CEA的表达情况(μg/L，±s) 组别
接种前
第一次
第二次
第三次接种后
接种后1周
接种后1周
1周
2周
(1)-1
5.1±0.1
>80
, 百拇医药
(1)-2
4.9±0.2
>80
>80
(1)-3
5.1±0.2
>80
>80
33.5±2.1
(1)-4
5.1±0.1
>80
>80
, http://www.100md.com
35.7±1.7
9.5±0.3
(2)-1
5.1±0.1
5.1±0.3
(2)-2
5.1±0.1
5.1±0.1
5.1±0.1
(3)
5.1±0.1
5.1±0.2
, 百拇医药
5.1±0.2
免疫组化法测定兔各组织中CEA的表达：
只在接种局部皮肤组织检测到CEA的表达，其他各组织均未检测到CEA的表达。
ABC免疫组化法测定兔体内抗CEA抗体的滴度：各组兔每次接种前后血样品中抗CEA的结果为(迁)组和(3)组各兔的血样品中测不到抗体。(1)组兔于第2次接种后1周抗体滴度为1∶10，第3次接种后1周为1∶50，2周后为1∶100，3周时仍维持在1∶100。
血常规及某些生化指标的检测，接种前后的数值差异无显著性。
3.讨论
有关痘苗病毒的研究和应用，自八十年代初以来已取得很大的进展。1990年开始，美国多家实验室进行了有关CEArV的研究工作〔2～4〕，并已逐步应用到Ⅰ期临床试验，取得了良好的效果。
, 百拇医药
本实验室自1994年以来从事CEArV的研制工作，与美国不同的是我们利用在我国用于天花预防接种的痘苗病毒天坛株作为载体，其安全性和可靠性已获得公认〔5〕。所构建的CEArV接种新西兰兔后1周即有CEA的高表达(超过80μg/L，以后连续几周维持在高水平，至第3次接种后2周方下降到低于10μg/L，以后连续几周维持在高水平，至第3次接种后2周方下降到低于10μg/L，而试剂盒要求15μg/L以上就有意义。
抗CEA抗体的产生，在第2次接种CEArV后即能检测到，滴度为1∶10，第3次接种后1周升至1∶50，2周后达到1∶100，3周时测定值仍维持在1∶100的高水平。因主要目的是观察能否产生抗体，没有继续观察抗体的动态变化。产生的抗CEA抗体能与803胃癌细胞表面的CEA结合，说明所表达的CEA与天然CEA的免疫原性相同。本室曾将裸露的CEA重组真核表达质粒p91023B-CEA直接给小鼠肌肉注射，结果只能在肌肉组织局部测到CEA的微量表达，在血液和其他组织中均未能测到CEA的表达，更未测到抗CEA的抗体，这是因为CEA的糖基化程度很高，即使是真核表达质粒载体也不能对其进行有效的蛋白质翻译后加工，只有痘苗病毒才能胜任。整个实验过程未发现接种兔有毒副反应，所检测的生化指标(谷丙转氨酶，谷草转0?酶，肌苷和血尿素氮)均未出现增高，仅在接种后1周，血小板和白细胞数有所上升，但在第3次接种后1周时已恢复正常。本结果为进一步研究在实验动物体内，利用CEArV对表达CEA的肿瘤进行治疗和抗肿瘤形成提供了可靠依据。
, 百拇医药
基金项目：为广州市科委资助课题(编号98-J018-01)
〔参考文献〕
1 杨洁，罗超权，卢方安，等.人癌胚抗原的重组痘苗病毒的构建和制备〔J〕.中国生化与分子生物学报，1999，15(1)：54.
2 Kantor J, Irvine K, Abrams S, et al . Immunogenecity and safety of a recombinant vaccinia virus expressing the carcinoembryonic antigen gene in a onhuman primate〔J〕 .Cancer Res,1992,52:6917.
3 Tsang K Y,Zaremba S,NierodaC A,et al.Genetation of human cytotoxic T cells specific for human carcinoembryonic antigenepitopes from patiens immunized with recombinant vaccinia CEA vaccine〔J〕 .J Natl Cancer Inst,1995,87:982.
4 Cole D J,Wilson M C,Baron P L,et al.Phage I study of recombinant CEA vaccinia virus vaccine with post vaccination CEA peptide challenge〔J〕 .Hum Ther,1996,7:1381.
5 胡欲文.发展作疫苗用重组痘苗病毒的指导原则〔J〕.病毒学报，1986，2(3)：291.
收稿日期：1998-03-04；修回日期：1999-02-11, 百拇医药
单位：中山医科大学生化教研室(广州，510089)
关键词：癌胚抗原；痘苗病毒；免疫原性
癌症99zk37
中图号：Q344.13文献标识码：A
文章编号：1000-467X(1999)s0-0099-01
本文报告癌胚抗原cDNA重组痘苗病毒(CEArV)在体内能有效地表达CEA，并激活机体产生抗CEA抗体。
1.材料与方法
CEArV的构建具体见文献〔1〕。
, 百拇医药
CEArV接种新西兰兔：纯种新西兰兔21只，分为3组。(1)组实验组，选兔12只，雌雄各半，背部皮下注射接种CEArV，剂量为106PFU/次。由于每次接种后1周须取兔的接种部皮肤、肌肉和内脏(肝、脾、小肠、胃等)检测CEA的表达情况，因此将(1)组进一步分为4组，分别为(1)1～(1)4组，每只兔接种3次，前2次间隔1周，最后1次间隔2周，(2)组对照组，接种野生型痘苗病毒，选兔6只，雌雄各半，进一步分为(2)-1和(2)-2组，分别在第1次和第2次接种后1周取兔的内脏检测CEA。(3)组对照组，选兔3只，接种生理盐水。
于每次接种前抽取耳缘静脉血，用放射免疫法测定血清中CEA的含量，用表达人CEA的人类803胃癌细胞株作为抗原片，ABC免疫组化法测定抗CEA抗体的产生。并送检血常规及部分生化指标。
2.结果
CEA表达结果见表1，实验组(1)组中，将接种CEArV前后兔血清中CEA含量作秩和检验，P<0.01,接种CEA-rV前后兔血清中CEA含量存在显著差异,说明接种CEA-rV后,使兔血清中CEA的含量明显增加。对照组(2)组中，将接种野生型痘病毒前后兔血清中CEA的测定值作秩和检验，两组数值之间无差异(P>0.05)，即接种野生型痘苗病毒后对兔体内CEA的含量无影响。
, 百拇医药
表1 放射免疫法测定兔体内CEA的表达情况(μg/L，±s) 组别
接种前
第一次
第二次
第三次接种后
接种后1周
接种后1周
1周
2周
(1)-1
5.1±0.1
>80
, 百拇医药
(1)-2
4.9±0.2
>80
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(1)-3
5.1±0.2
>80
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33.5±2.1
(1)-4
5.1±0.1
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, http://www.100md.com
35.7±1.7
9.5±0.3
(2)-1
5.1±0.1
5.1±0.3
(2)-2
5.1±0.1
5.1±0.1
5.1±0.1
(3)
5.1±0.1
5.1±0.2
, 百拇医药
5.1±0.2
免疫组化法测定兔各组织中CEA的表达：
只在接种局部皮肤组织检测到CEA的表达，其他各组织均未检测到CEA的表达。
ABC免疫组化法测定兔体内抗CEA抗体的滴度：各组兔每次接种前后血样品中抗CEA的结果为(迁)组和(3)组各兔的血样品中测不到抗体。(1)组兔于第2次接种后1周抗体滴度为1∶10，第3次接种后1周为1∶50，2周后为1∶100，3周时仍维持在1∶100。
血常规及某些生化指标的检测，接种前后的数值差异无显著性。
3.讨论
有关痘苗病毒的研究和应用，自八十年代初以来已取得很大的进展。1990年开始，美国多家实验室进行了有关CEArV的研究工作〔2～4〕，并已逐步应用到Ⅰ期临床试验，取得了良好的效果。
, 百拇医药
本实验室自1994年以来从事CEArV的研制工作，与美国不同的是我们利用在我国用于天花预防接种的痘苗病毒天坛株作为载体，其安全性和可靠性已获得公认〔5〕。所构建的CEArV接种新西兰兔后1周即有CEA的高表达(超过80μg/L，以后连续几周维持在高水平，至第3次接种后2周方下降到低于10μg/L，以后连续几周维持在高水平，至第3次接种后2周方下降到低于10μg/L，而试剂盒要求15μg/L以上就有意义。
抗CEA抗体的产生，在第2次接种CEArV后即能检测到，滴度为1∶10，第3次接种后1周升至1∶50，2周后达到1∶100，3周时测定值仍维持在1∶100的高水平。因主要目的是观察能否产生抗体，没有继续观察抗体的动态变化。产生的抗CEA抗体能与803胃癌细胞表面的CEA结合，说明所表达的CEA与天然CEA的免疫原性相同。本室曾将裸露的CEA重组真核表达质粒p91023B-CEA直接给小鼠肌肉注射，结果只能在肌肉组织局部测到CEA的微量表达，在血液和其他组织中均未能测到CEA的表达，更未测到抗CEA的抗体，这是因为CEA的糖基化程度很高，即使是真核表达质粒载体也不能对其进行有效的蛋白质翻译后加工，只有痘苗病毒才能胜任。整个实验过程未发现接种兔有毒副反应，所检测的生化指标(谷丙转氨酶，谷草转0?酶，肌苷和血尿素氮)均未出现增高，仅在接种后1周，血小板和白细胞数有所上升，但在第3次接种后1周时已恢复正常。本结果为进一步研究在实验动物体内，利用CEArV对表达CEA的肿瘤进行治疗和抗肿瘤形成提供了可靠依据。
, 百拇医药
基金项目：为广州市科委资助课题(编号98-J018-01)
〔参考文献〕
1 杨洁，罗超权，卢方安，等.人癌胚抗原的重组痘苗病毒的构建和制备〔J〕.中国生化与分子生物学报，1999，15(1)：54.
2 Kantor J, Irvine K, Abrams S, et al . Immunogenecity and safety of a recombinant vaccinia virus expressing the carcinoembryonic antigen gene in a onhuman primate〔J〕 .Cancer Res,1992,52:6917.
3 Tsang K Y,Zaremba S,NierodaC A,et al.Genetation of human cytotoxic T cells specific for human carcinoembryonic antigenepitopes from patiens immunized with recombinant vaccinia CEA vaccine〔J〕 .J Natl Cancer Inst,1995,87:982.
4 Cole D J,Wilson M C,Baron P L,et al.Phage I study of recombinant CEA vaccinia virus vaccine with post vaccination CEA peptide challenge〔J〕 .Hum Ther,1996,7:1381.
5 胡欲文.发展作疫苗用重组痘苗病毒的指导原则〔J〕.病毒学报，1986，2(3)：291.
收稿日期：1998-03-04；修回日期：1999-02-11, 百拇医药