急性肝损伤大鼠血清有机膦酸酯酶活性变化
1济南军区军事医学研究所 山东省济南市 250014
2山东省千佛山医院 3济南军区总医院
韩刚毅，男，1955-08-26生，河南省开封市人，汉族.1983年第三军医大学生物化学研究生毕业，研究员，主要从事酶学研究，发表论文50篇，获专利3项，军队科技进步二、三等奖7项
项目负责人 韩刚毅,250014 山东省济南市文化东路36号,山东省济南市,济南军区军事医学研究所
Tel: 0531- 8951221收搞日期 1995-05-02 接收日期 1995-05-19
Alteratioms of Serum phosphonate esterase in experimental cholestasis in rats
, http://www.100md.com
Gang-Yi Han, Xiao-Hong Jin, Xin-Min Jang and Xi-Hong Fan
Jinan Institute of Military Medicine, Jinan 250014 Shandong Province, China
Abstract
AIMS To study the effect of experimental cholestasis on serum phosphonate esterase activity in rats.
METHODS Intrahepatic choloestasis was induced in rats by 10% D-galactosamine (ip), 0.5g/kg body weight. The same volume of vehicle was administered to control animals. Experimental biliary obstruction in SD rats was formed with bile duct ligation while the animals were pentothal under anaesthesia. Seriel blood samples (0.4-0.6ml) were obtained from the tail vein in above experimental animals at 8, 24, 48, 96 hours after galactosamine administration or bile duct ligation. The serum phosphonate esterase(PE), phosphodiesterase Ⅰ(PDE Ⅰ), ALT and alkaline phosphatase (ALP) were detected.
, 百拇医药
RESULTS The serum PDE Ⅰ, ALT and ALP activities were remarkable increased after administration of galactosamine or bile duct ligation, but serum PE activity had not any change.
CONCLUSIONS Serum PE has no relation with cholestasis in rats.
Subject headings liver/pathology necrosis/enzymology phosphoric monoester hydrolases/blood phosphoric diester
, http://www.100md.com
hydrolases/blood choleslasis/blood
Han GY, Jin XH, Jang XM,Fan XH.Alteratioms of Serum phosphonate esterase in experimental cholestasis in rats.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1996；4(7)：366-368
摘要
目的 观察实验性急性肝损伤对血清有机膦酸酯酶的影响.
方法 用10% D-氨基半乳糖盐酸盐1次腹腔注射，诱发Wistar大鼠急性肝坏死；另施手术结扎胆道诱发SD大鼠胆汁淤积. 采尾血测定血清有机膦酸酯酶(PE)、磷酸二酯酶I(PDEI)等.
, 百拇医药
结果 大鼠急性肝坏死或胆道结扎早期均可见血清ALT、碱性磷酸酶(ALP)和PDEI活性增高. 血清PE活性无变化.
结论 血清PE活性不受急性肝损伤的影响.
主题词 肝/病理学;坏死/酶学;膦酸单酯水解酶类/血液;膦酸二酯水解酶类/血液;胆汁郁积/血液
韩刚毅,靳晓红,姜新民,范西红.急性肝损伤大鼠血清有机膦酸酯酶活性变化.新消化病学杂志，1996；4(7)：366-368
肝硬变患者血清中有机膦酸酯酶(phosphonate esterase, PE)活性增高，大鼠化学性肝纤维化过程中血清PE活性与肝组织纤维化程度密切相关[1，2].由于在个别临床急性肝病患者血清中PE活性也呈现略高于正常值的改变，为了探讨血清中PE变化与肝组织急性损伤的关系，本文采用D-半乳糖胺盐酸盐腹腔给药或手术结扎胆道的方式分别造成大鼠急性肝炎或急性胆道阻塞模型.测定血清中PE活性变化，结合肝细胞病理及其它几种血清酶活性改变分析PE的临床应用价值,报道如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 急性肝炎动物模型 选体重160-230g健康Wistar大鼠33只，随机分为2组，其中对照组12只，给药组21只，每组内雌雄各半.在喂饲普通食料，随意饮水1周后，按0.5g/kg体重剂量，给药组动物1次腹腔注射10% D-氨基半乳糖胺盐酸盐(用无菌生理盐水配制后，以1mol NaOH调pH至7.0)，对照组注射用同体积的生理盐水.分别于注射前48h和注射后8，24，48，96h及2周时从2组大鼠的尾部采血0.5ml.在注射后48h及2周时将各组动物处死1/3(对照组4只，给药组7只)，取肝组织用10%甲醛溶液固定后，经HE常规染色观察肝组织病理改变.
1.2 胆道结扎动物模型 将22只SD大鼠(体重200-280g)分成3组，用硫酚妥钠麻醉，A组(共9只，雌2只，雄7只)进行胆道结扎手术；B组(共9只，雌3只，雄6只)作为实验对照组与A组相同进行开腹手术，但未结扎胆道；C组(4只，雌雄各2只)麻醉后不施任何手术.各组动物分别在手术前2d和手术后8，24，48h自尾部采集0.5ml血液，在手术后96h断头处死全部大鼠，分离血清后测定各种生化指标.
, http://www.100md.com
1.3 试剂 D-半乳糖胺盐酸盐由北京科技协作中心精细化学分部供应.苯基膦酸(对硝苯)苯酚酯铵盐(PNPpPh)由Fluca公司提供，对硝基苯-5-胸腺嘧啶核苷酸铵盐(PNPp)购自Sigma化学试剂公司.ALT和ALP检测试剂盒购自北京中生生物工程高技术公司.
1.4 测定方法 PE和PDEⅠ(磷酸二酯酶Ⅰ) 活性测定参照本实验室以前曾报道的人血清PE检测方法进行[3].ALT，ALP分别参照试剂盒使用说明书进行.所有测定过程均采用美国雅培生物制药公司生产的VP-super system全自动生化分析仪实施实验操作.
2 结果
, 百拇医药
2.1 临床表现 ①急性肝炎模型组：给药后8h，给药组全部动物出现活动减少，饮水下降，基本不进食；给药后24h动物普遍拒食，精神不振，嗜睡，饮水进一步下降.给药72h后，动物进食逐渐增加，饮水正常并逐渐恢复活动.给药2周时，所有动物活动都已恢复正常.对照组动物在实验期间无上述改变.②胆道结扎组：术后12h内大鼠进食、饮水减少，活动减少.术后12-48h，结扎胆道的大鼠开始出现黄疸，除少量饮水外，基本不进食.术后90h，两只结扎胆道大鼠死亡，经解剖证实是腹腔感染所致，其它大鼠术后96h处死时未见感染.
2.2 病理变化 给药组动物在给药48h，可见肝细胞明显混浊肿胀及轻度脂肪变性，并有肝细胞点状坏死，汇管区胆管增生，中央静脉及肝窦扩张伴有淋巴细胞浸润.在给药后96h，动物肝细胞肿胀，淋巴细胞浸润及肝细胞变性增多，同时可见较多的肝细胞增生，细胞核大小不等，并有较多的双核细胞.在给药2周后肝小叶已部分再生，上述所见组织损伤已消失，仅可见个别再生的双核肝细胞.对照组动物无上述病理变化.
, 百拇医药
2.3 血清酶活性变化 ①肝炎动物血清酶： ALT：测定各组动物给药前后血清中ALT活性变化(表1)，当大鼠注射0.5g/kg体重D-氨基半乳糖胺盐酸盐后8h，即可见血清ALT活性升高6-7倍.注射后24h，血清ALT活性达到高峰，随后逐渐下降，给药2周后已恢复到对照组水平.对照组动物无上述改变.ALT的这种变化与肝组织的病理学变化是相一致的，此结果再次证明血清ALT是反映急性肝细胞损伤的良好指标. PE与ALP：在整个实验过程中，对照组与给药组动物血清有机膦酸酯酶活性无差异(表1).血清中碱性磷酸酶(ALP)活性在2组中都呈现出无规则波动，对分析实验结果无意义.②胆道结扎动物血清酶：在胆道结扎后8h，血清中ALP活性升高，在术后24h，ALP活性达到高峰，随后逐渐下降，96h仍高于术前水平(图1).对照实验组(B组)与对照组(C组)血清ALP变化完全相同.血清PDEⅠ活性在结扎后8h达高峰，随后渐下降，术后96h已与对照组无显著差异(图2).胆道结扎对大鼠血清PE无影响，至术后96h 3组动物血清PE无显著差异(图3).
, http://www.100md.com
A组和B组动物血清ALT活性在手术后8h都显著高于对照组，术后24h A组动物血清中ALT活性均值已超过对照组(C组)50余倍，并保持到手术后96h，B组动物手术后血清ALT略有升高，随后很快恢复到C组水平.
图1 胆道结扎实验大鼠血清ALP活性变化·--· A组， ▲……▲ B组，×……×C组
图2 胆道结扎实验大鼠血清PDEⅠ活性变化·--· A组， ▲……▲ B组，×……×C组
图3 胆道结扎实验大鼠血清PE活性变化·--· A组， ▲……▲ B组，×……×C组
表1 急性实验性肝炎大鼠血清ALT，PE活性变化( (IU/L)
, http://www.100md.com
bP<0.01
3 讨论
四氯化碳致肝硬变模型是研究肝纤维化机制和诊治方法的常用动物模型.然而，由于采用四氯化碳制作的大鼠肝硬变模型需长期地保持四氯化碳的摄入，这使得在肝脏发生进行性肝纤维化的同时，还伴有肝组织的脂肪变性和肝细胞坏死等急性期的病理改变及持续的肝功能障碍.当肝纤维化发展到一定程度时，由于假小叶的形成，也会导致胆汁排出不畅而回流入血.此时一些在正常情况下通过胆汁分泌排泄的酶类也会随胆汁入血，导致血清中酶活性升高.因此，在采用四氯化碳致肝硬变模型进行诊断或治疗方法研究时，至少应排除持续注射四氯化碳的急性效应和假小叶形成后继发的肝内胆汁淤积因素对实验结果的影响[4].
作者采用半乳糖胺盐酸盐造成大鼠急性肝细胞损伤后，观察到血清中ALT活性随肝细胞损伤升高，在给药后24h达高峰，随后逐渐下降，2周后恢复到对照水平，变化趋势与肝细胞损伤的病理改变基本一致.而在整个实验过程血清PE未发生改变.提示，急性肝组织损伤不会引起血清PE活性升高.
, 百拇医药
在胆道结扎实验中，大鼠血清ALT、ALP活性都明显升高，结扎后24h达高峰，并持续到96h.而结扎后各时相点血清PE与对照组相比均无显著差异.这说明血清不是胆汁分泌性酶，在肝硬变时血清PE升高与假小叶形成所造成的胆汁回流变化无关.
综合上述，本文实验结果排除了血清PE与肝细胞急性损伤及慢性胆汁淤积的关系.提示肝硬变时血清PE活性变化可能是肝纤维化造成的直接结果，为深入了解PE与肝组织纤维化的关系及其变化机制提供了有用的资料.并且预示，血清PE用于临床早期诊断肝硬变也许较其它指标更具特异性.
4 参考文献
1 韩刚毅，王慧芬，靳晓红，等.肝脏疾病时人血清PE和PDEⅠ的活性变化.中国临床病理学理论与实践，1991；1(4)：357-360
2 韩刚毅，靳晓红，王慧芬，等.肝纤维化大鼠有机膦酸酯酶等指标的变化.新消化病学杂志，1996；4(7)369-370
3 Han GY, Fan XH, Jin XB, et al. Specific detection and properties of enzyme hydrolyzing phosphonate ester in serum.
Clin Chem, 1992;38(3):377-380
4 任引津.化学性肝损害.第1版.北京：人民卫生出版社，1989：18-28, http://www.100md.com(韩刚毅1 靳晓红1 姜新民 2 范西红3)
2山东省千佛山医院 3济南军区总医院
韩刚毅，男，1955-08-26生，河南省开封市人，汉族.1983年第三军医大学生物化学研究生毕业，研究员，主要从事酶学研究，发表论文50篇，获专利3项，军队科技进步二、三等奖7项
项目负责人 韩刚毅,250014 山东省济南市文化东路36号,山东省济南市,济南军区军事医学研究所
Tel: 0531- 8951221收搞日期 1995-05-02 接收日期 1995-05-19
Alteratioms of Serum phosphonate esterase in experimental cholestasis in rats
, http://www.100md.com
Gang-Yi Han, Xiao-Hong Jin, Xin-Min Jang and Xi-Hong Fan
Jinan Institute of Military Medicine, Jinan 250014 Shandong Province, China
Abstract
AIMS To study the effect of experimental cholestasis on serum phosphonate esterase activity in rats.
METHODS Intrahepatic choloestasis was induced in rats by 10% D-galactosamine (ip), 0.5g/kg body weight. The same volume of vehicle was administered to control animals. Experimental biliary obstruction in SD rats was formed with bile duct ligation while the animals were pentothal under anaesthesia. Seriel blood samples (0.4-0.6ml) were obtained from the tail vein in above experimental animals at 8, 24, 48, 96 hours after galactosamine administration or bile duct ligation. The serum phosphonate esterase(PE), phosphodiesterase Ⅰ(PDE Ⅰ), ALT and alkaline phosphatase (ALP) were detected.
, 百拇医药
RESULTS The serum PDE Ⅰ, ALT and ALP activities were remarkable increased after administration of galactosamine or bile duct ligation, but serum PE activity had not any change.
CONCLUSIONS Serum PE has no relation with cholestasis in rats.
Subject headings liver/pathology necrosis/enzymology phosphoric monoester hydrolases/blood phosphoric diester
, http://www.100md.com
hydrolases/blood choleslasis/blood
Han GY, Jin XH, Jang XM,Fan XH.Alteratioms of Serum phosphonate esterase in experimental cholestasis in rats.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1996；4(7)：366-368
摘要
目的 观察实验性急性肝损伤对血清有机膦酸酯酶的影响.
方法 用10% D-氨基半乳糖盐酸盐1次腹腔注射，诱发Wistar大鼠急性肝坏死；另施手术结扎胆道诱发SD大鼠胆汁淤积. 采尾血测定血清有机膦酸酯酶(PE)、磷酸二酯酶I(PDEI)等.
, 百拇医药
结果 大鼠急性肝坏死或胆道结扎早期均可见血清ALT、碱性磷酸酶(ALP)和PDEI活性增高. 血清PE活性无变化.
结论 血清PE活性不受急性肝损伤的影响.
主题词 肝/病理学;坏死/酶学;膦酸单酯水解酶类/血液;膦酸二酯水解酶类/血液;胆汁郁积/血液
韩刚毅,靳晓红,姜新民,范西红.急性肝损伤大鼠血清有机膦酸酯酶活性变化.新消化病学杂志，1996；4(7)：366-368
肝硬变患者血清中有机膦酸酯酶(phosphonate esterase, PE)活性增高，大鼠化学性肝纤维化过程中血清PE活性与肝组织纤维化程度密切相关[1，2].由于在个别临床急性肝病患者血清中PE活性也呈现略高于正常值的改变，为了探讨血清中PE变化与肝组织急性损伤的关系，本文采用D-半乳糖胺盐酸盐腹腔给药或手术结扎胆道的方式分别造成大鼠急性肝炎或急性胆道阻塞模型.测定血清中PE活性变化，结合肝细胞病理及其它几种血清酶活性改变分析PE的临床应用价值,报道如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 急性肝炎动物模型 选体重160-230g健康Wistar大鼠33只，随机分为2组，其中对照组12只，给药组21只，每组内雌雄各半.在喂饲普通食料，随意饮水1周后，按0.5g/kg体重剂量，给药组动物1次腹腔注射10% D-氨基半乳糖胺盐酸盐(用无菌生理盐水配制后，以1mol NaOH调pH至7.0)，对照组注射用同体积的生理盐水.分别于注射前48h和注射后8，24，48，96h及2周时从2组大鼠的尾部采血0.5ml.在注射后48h及2周时将各组动物处死1/3(对照组4只，给药组7只)，取肝组织用10%甲醛溶液固定后，经HE常规染色观察肝组织病理改变.
1.2 胆道结扎动物模型 将22只SD大鼠(体重200-280g)分成3组，用硫酚妥钠麻醉，A组(共9只，雌2只，雄7只)进行胆道结扎手术；B组(共9只，雌3只，雄6只)作为实验对照组与A组相同进行开腹手术，但未结扎胆道；C组(4只，雌雄各2只)麻醉后不施任何手术.各组动物分别在手术前2d和手术后8，24，48h自尾部采集0.5ml血液，在手术后96h断头处死全部大鼠，分离血清后测定各种生化指标.
, http://www.100md.com
1.3 试剂 D-半乳糖胺盐酸盐由北京科技协作中心精细化学分部供应.苯基膦酸(对硝苯)苯酚酯铵盐(PNPpPh)由Fluca公司提供，对硝基苯-5-胸腺嘧啶核苷酸铵盐(PNPp)购自Sigma化学试剂公司.ALT和ALP检测试剂盒购自北京中生生物工程高技术公司.
1.4 测定方法 PE和PDEⅠ(磷酸二酯酶Ⅰ) 活性测定参照本实验室以前曾报道的人血清PE检测方法进行[3].ALT，ALP分别参照试剂盒使用说明书进行.所有测定过程均采用美国雅培生物制药公司生产的VP-super system全自动生化分析仪实施实验操作.
2 结果
, 百拇医药
2.1 临床表现 ①急性肝炎模型组：给药后8h，给药组全部动物出现活动减少，饮水下降，基本不进食；给药后24h动物普遍拒食，精神不振，嗜睡，饮水进一步下降.给药72h后，动物进食逐渐增加，饮水正常并逐渐恢复活动.给药2周时，所有动物活动都已恢复正常.对照组动物在实验期间无上述改变.②胆道结扎组：术后12h内大鼠进食、饮水减少，活动减少.术后12-48h，结扎胆道的大鼠开始出现黄疸，除少量饮水外，基本不进食.术后90h，两只结扎胆道大鼠死亡，经解剖证实是腹腔感染所致，其它大鼠术后96h处死时未见感染.
2.2 病理变化 给药组动物在给药48h，可见肝细胞明显混浊肿胀及轻度脂肪变性，并有肝细胞点状坏死，汇管区胆管增生，中央静脉及肝窦扩张伴有淋巴细胞浸润.在给药后96h，动物肝细胞肿胀，淋巴细胞浸润及肝细胞变性增多，同时可见较多的肝细胞增生，细胞核大小不等，并有较多的双核细胞.在给药2周后肝小叶已部分再生，上述所见组织损伤已消失，仅可见个别再生的双核肝细胞.对照组动物无上述病理变化.
, 百拇医药
2.3 血清酶活性变化 ①肝炎动物血清酶： ALT：测定各组动物给药前后血清中ALT活性变化(表1)，当大鼠注射0.5g/kg体重D-氨基半乳糖胺盐酸盐后8h，即可见血清ALT活性升高6-7倍.注射后24h，血清ALT活性达到高峰，随后逐渐下降，给药2周后已恢复到对照组水平.对照组动物无上述改变.ALT的这种变化与肝组织的病理学变化是相一致的，此结果再次证明血清ALT是反映急性肝细胞损伤的良好指标. PE与ALP：在整个实验过程中，对照组与给药组动物血清有机膦酸酯酶活性无差异(表1).血清中碱性磷酸酶(ALP)活性在2组中都呈现出无规则波动，对分析实验结果无意义.②胆道结扎动物血清酶：在胆道结扎后8h，血清中ALP活性升高，在术后24h，ALP活性达到高峰，随后逐渐下降，96h仍高于术前水平(图1).对照实验组(B组)与对照组(C组)血清ALP变化完全相同.血清PDEⅠ活性在结扎后8h达高峰，随后渐下降，术后96h已与对照组无显著差异(图2).胆道结扎对大鼠血清PE无影响，至术后96h 3组动物血清PE无显著差异(图3).
, http://www.100md.com
A组和B组动物血清ALT活性在手术后8h都显著高于对照组，术后24h A组动物血清中ALT活性均值已超过对照组(C组)50余倍，并保持到手术后96h，B组动物手术后血清ALT略有升高，随后很快恢复到C组水平.
图1 胆道结扎实验大鼠血清ALP活性变化·--· A组， ▲……▲ B组，×……×C组
图2 胆道结扎实验大鼠血清PDEⅠ活性变化·--· A组， ▲……▲ B组，×……×C组
图3 胆道结扎实验大鼠血清PE活性变化·--· A组， ▲……▲ B组，×……×C组
表1 急性实验性肝炎大鼠血清ALT，PE活性变化( (IU/L)
| 时间(h) | 血清ALT 血清PE | |||
| 对照组 | 给药组 | 对照组 | 给药组 | |
| -48 | 71.9±13.4 | 74.5±10.6 | 193.2±31.9 | 198.8±44.7 |
| 8 | 100.1±18.0 | 471.8±257.8b | 205.8±68.2 | 174.9±38.3 |
| 24 | 91.2±12.1 | 534.7±77.1b | 202.1±42.8 | 195.6±44.0 |
| 48 | 104.1±30.5 | 316.5±141.4b | 209.8±34.4 | 209.1±39.4 |
| 96 | 96.4±6.8 | 105.4±20.8 | 212.2±37.7 | 211.3±51.0 |
| 2周 | 96.6±7.8 | 96.3±12.3 | 241.5±24.3 | 236.6±31.5 |
, http://www.100md.com
bP<0.01
3 讨论
四氯化碳致肝硬变模型是研究肝纤维化机制和诊治方法的常用动物模型.然而，由于采用四氯化碳制作的大鼠肝硬变模型需长期地保持四氯化碳的摄入，这使得在肝脏发生进行性肝纤维化的同时，还伴有肝组织的脂肪变性和肝细胞坏死等急性期的病理改变及持续的肝功能障碍.当肝纤维化发展到一定程度时，由于假小叶的形成，也会导致胆汁排出不畅而回流入血.此时一些在正常情况下通过胆汁分泌排泄的酶类也会随胆汁入血，导致血清中酶活性升高.因此，在采用四氯化碳致肝硬变模型进行诊断或治疗方法研究时，至少应排除持续注射四氯化碳的急性效应和假小叶形成后继发的肝内胆汁淤积因素对实验结果的影响[4].
作者采用半乳糖胺盐酸盐造成大鼠急性肝细胞损伤后，观察到血清中ALT活性随肝细胞损伤升高，在给药后24h达高峰，随后逐渐下降，2周后恢复到对照水平，变化趋势与肝细胞损伤的病理改变基本一致.而在整个实验过程血清PE未发生改变.提示，急性肝组织损伤不会引起血清PE活性升高.
, 百拇医药
在胆道结扎实验中，大鼠血清ALT、ALP活性都明显升高，结扎后24h达高峰，并持续到96h.而结扎后各时相点血清PE与对照组相比均无显著差异.这说明血清不是胆汁分泌性酶，在肝硬变时血清PE升高与假小叶形成所造成的胆汁回流变化无关.
综合上述，本文实验结果排除了血清PE与肝细胞急性损伤及慢性胆汁淤积的关系.提示肝硬变时血清PE活性变化可能是肝纤维化造成的直接结果，为深入了解PE与肝组织纤维化的关系及其变化机制提供了有用的资料.并且预示，血清PE用于临床早期诊断肝硬变也许较其它指标更具特异性.
4 参考文献
1 韩刚毅，王慧芬，靳晓红，等.肝脏疾病时人血清PE和PDEⅠ的活性变化.中国临床病理学理论与实践，1991；1(4)：357-360
2 韩刚毅，靳晓红，王慧芬，等.肝纤维化大鼠有机膦酸酯酶等指标的变化.新消化病学杂志，1996；4(7)369-370
3 Han GY, Fan XH, Jin XB, et al. Specific detection and properties of enzyme hydrolyzing phosphonate ester in serum.
Clin Chem, 1992;38(3):377-380
4 任引津.化学性肝损害.第1版.北京：人民卫生出版社，1989：18-28, http://www.100md.com(韩刚毅1 靳晓红1 姜新民 2 范西红3)