胃粘膜石蜡切片PCR法检测幽门螺杆菌
北京医科大学第一医院胃肠科 北京市 100034
项目负责人:王蔚虹
收稿日期:1996-04-04 接受日期:1996-07-21
PCR detection of Helicobacter pylori in paraffin embedded gastr ic mucosa
Wei-Hong Wang, Fu-Lian Hu and Bo-Qi Jia
Department of Gastroenterology, First Teaching Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034, China
, http://www.100md.com
Abstract
AIM To establish the PCR method to amplify H.pylori chromosomal DNA from paraffin embedded gastric mucosa.
METHODS A specific oligonucleotide primer pair was used to amplify the 16S rRNA gene of H.pylori by double PCR. The results were compared with that of routine methods in 20 gastric mucosal specimens.
RESULTS Double PCR amplification can detect a minimun of 0.01pg H.pylori DNA. By comparing double PCR in paraffin embedded specimens of 20 duodenal ulcer patients with urease test, culture, Warthin_Starry stain and PCR in fresh specimens, we demonstrated that 18 patients had the same results by these five tests. Only 2 patients infected with H.pylori were positive by urease test, Warthin_Starry stain and PCR with fresh specimens, but negative by double PCR with paraffin embedded specimens. Significant association was found between the results detected by PCR with paraffin embedded specimens and that with fresh specimens.
, 百拇医药
CONCLUSION Double PCR provides a useful method for retrospe ctive research of H.pylori infection on the molecular level.
Subject headings Gastric mucosa/microbiology;Helicobacter pylori/genetics;DNA, bacterial/analysis;Polymerase chain reaction
Wang WH, Hu FL, Jia BQ.PCR detection of Helicobacter pylori in paraffin embedded gastric mucosa.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 1997；5(1)：13-14
, http://www.100md.com
主题词 胃粘膜/微生物学;螺杆菌，幽门/遗传学;DNA，细菌/分析;聚合酶链反应
摘要
目的 建立从石蜡包埋的胃粘膜标本中扩增Hp DNA的聚合酶链反应(PCR).
方法 以一对Hp特异的寡核苷酸为引物，采用双扩增PCR扩增Hp 16S rRNA基因，并与常规检测方法进行了比较.
结果 双扩增PCR检出的最小Hp DNA量为0.01pg.用该方法检测十二指 肠溃疡患者20例石蜡包埋的胃粘膜标本，并与尿素酶试验、细菌培养、Warthin_Starry银染色及PCR对新鲜胃粘膜标本的检测作比较，结果18例患者上述五项检测结果一致，2例尿毒酶试验、银染色及PCR对新鲜胃粘膜标本的检测呈阳性的患者，采用双扩增PCR对石蜡包埋标本的检测未发现Hp DNA.PCR对石蜡包埋标本及新鲜胃粘膜标本的检测有显著相关性.
, 百拇医药
结论 双扩增PCR为分子水平上Hp感染的回顾性研究提供一有利工具.
王蔚虹,胡伏莲,贾博琦.胃粘膜石蜡切片PCR法检测幽门螺杆菌.新消化病学杂志,1997；5(1)：13-14
分子生物学技术的应用推进了有关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染的研究，近年用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测Hp国内外均有报道[1，2]，而PCR从石蜡包埋的胃粘膜标本中检测Hp有一定困难.作者建立了用双扩增PCR从石蜡包埋的胃粘膜标本中检出Hp的方法，为Hp感染的研究提供一有利工具.
1 材料和方法
1.1 PCR方法的建立 新鲜胃粘膜标本1块，置500μl，TE(10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA pH 8.0) 缓冲液研碎，加10% SDS 30μl，蛋白酶K(20m/ml)3μl，55消化1h，以等体积苯酶-氯仿抽提1次.标本处理中设缓冲液阴性对照.石蜡包埋的胃粘膜标本在组织切片机上切成4μm的薄片10片，加800μl二甲苯脱蜡两次，95%乙醇洗2次，空气置干.加400μl TE，加SDS至终浓度1%，蛋白酶K终浓度100μg/ml，55水浴持续消化5d[3]，等体积苯酚一氯仿抽取2次，取5μl用于双扩增PCR.切片过程中每更换蜡块标本，用二甲苯或1mol/L HCl清洁切片，以空白蜡块作对照.CP1/CP2引物来自Hp 16S rRNA基因[1]，由中国科学院遗传所合成并纯化.CP1：5′-GCGCAATCAGCGTCAGG TAATG-3′，CP2：5′-GCTAAGAGATCAGCCTATGTCC-3′，扩增片段长度500bp，其特异性已被证实[4]. PCR扩增Hp 16S rRNA6片段用50μl扩 增体系.扩增反应在Perkin-Elmer公司DNA Thermal Cycler 480上进行：96 5min，1个循环；94 1min变性，55 1min 退火，72 1.5min 延伸，35个循环；最后于72继续延伸10min.双扩增PCR是将4μl经过25个循环的反应液加入46μl新更换的反应液，继续25个循环.反应中以Hp NCTC 11637 做阳性对照，以去离子水代替 模板DNA做阴性对照.扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定.
, http://www.100md.com
1.2 病例的选择及Hp检测 十二指肠溃疡患者20例在内镜直视下距幽门口3-5cm范围内取胃窦粘膜4块，分别做尿素酶试验(兰州军区医高专药盒)、细菌培养、Warthin_Starry银染色、新鲜胃粘膜组织的PCR检测及石蜡包埋胃粘膜组织的双扩增PCR检测.用于银染色及双扩增PCR的石蜡包埋胃粘膜为同一活检组织按常规方法固定包埋的标本.
2 结果
采用10倍系列稀释的Hp NCTC 11637 DNA检测双扩增PCR的敏感性.检出的最小Hp DNA的量 为0.01pg，相当于100个细菌细胞.双扩增PCR检测了20例十二指肠溃疡患者胃窦石蜡包 埋标本，结果16例Hp阳性，4例Hp阴性.5种方法检测胃粘膜标本的比较表1.PCR对新鲜胃粘膜(18/20, 90.0%)及石蜡包埋胃粘膜组织(16/20，80.0%)的检测结果有显著相关性(P< 0.05).
, http://www.100md.com 表1 5种方法检测活检胃粘膜Hp感染结果
3 讨论
用PCR技术从石蜡包埋的胃粘膜中扩增Hp DNA具有重要意义，它使得有关Hp感染的回顾性研究成为可能.由于活检的胃粘膜组织量很小，特别是在常规固定包埋过程中有DNA的降解， 以及DNA提取时难免有固定包埋过程中的某些PCR抑制物的存在和DNA的损失，因此，从石蜡 包埋的组织标本中扩增目的DNA较从新鲜组织标本中的扩增困难许多. 从石蜡包埋的组织标本中提取用于PCR扩增的模板DNA方法较多，有二甲苯脱蜡或水浴脱蜡后以蛋白酶K、SDS消化提取DNA[5]；也有将组织切片直接煮沸后用于PCR扩增[1].本研究中采用的蛋白酶K，SDS 5d消化法提取模板DNA的双扩增PCR可获得较满意的结果，对20例石蜡包埋胃粘膜标本中Hp的检测，发现其中18例的检测结果与PCR对新鲜胃粘膜标本的检测结果一致.采用两对引物的巢式PCR技术可能获得更满意的结果.但从石蜡包埋的胃粘膜组织标本中成功地扩增了Hp DNA，使得对PCR产物的进一步分析成为可能，这就为从分子水平对Hp感染的回顾性研究提供了一个有利的工具.
, 百拇医药
4 参考文献1 Clayton CL, Kleanthous H, Coates PJ, et al. Sensitive detection of Helicobacter pylori by using
polymerase chain reaction. J Clin Microgiol,1992;30(1):192-200
2 宋敏.用巢式聚合酶链反应在唾液中检测出幽门螺杆菌.中华流行病杂志，1993；14(4)：237-240
3 Jackson DP, Lewis FA, Taylor CR, et al. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis
by the polymerase chain reaction. J Clin Pathol,1990;43(3):499-504
4 王蔚虹，胡伏莲，贾博琦.用聚合酶链反应检测胃粘膜标本中的幽门螺杆菌.中华内科杂志，199；34(7)：480
5 Ho SA, Hoyle JA, Lewis FA, et al. Direct polymerase chain reaction test for detection of
Helicobacter pylori in humans and animals. J Clin Microbiol, 1991;29(11):2543-2549, 百拇医药
项目负责人:王蔚虹
收稿日期:1996-04-04 接受日期:1996-07-21
PCR detection of Helicobacter pylori in paraffin embedded gastr ic mucosa
Wei-Hong Wang, Fu-Lian Hu and Bo-Qi Jia
Department of Gastroenterology, First Teaching Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034, China
, http://www.100md.com
Abstract
AIM To establish the PCR method to amplify H.pylori chromosomal DNA from paraffin embedded gastric mucosa.
METHODS A specific oligonucleotide primer pair was used to amplify the 16S rRNA gene of H.pylori by double PCR. The results were compared with that of routine methods in 20 gastric mucosal specimens.
RESULTS Double PCR amplification can detect a minimun of 0.01pg H.pylori DNA. By comparing double PCR in paraffin embedded specimens of 20 duodenal ulcer patients with urease test, culture, Warthin_Starry stain and PCR in fresh specimens, we demonstrated that 18 patients had the same results by these five tests. Only 2 patients infected with H.pylori were positive by urease test, Warthin_Starry stain and PCR with fresh specimens, but negative by double PCR with paraffin embedded specimens. Significant association was found between the results detected by PCR with paraffin embedded specimens and that with fresh specimens.
, 百拇医药
CONCLUSION Double PCR provides a useful method for retrospe ctive research of H.pylori infection on the molecular level.
Subject headings Gastric mucosa/microbiology;Helicobacter pylori/genetics;DNA, bacterial/analysis;Polymerase chain reaction
Wang WH, Hu FL, Jia BQ.PCR detection of Helicobacter pylori in paraffin embedded gastric mucosa.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 1997；5(1)：13-14
, http://www.100md.com
主题词 胃粘膜/微生物学;螺杆菌，幽门/遗传学;DNA，细菌/分析;聚合酶链反应
摘要
目的 建立从石蜡包埋的胃粘膜标本中扩增Hp DNA的聚合酶链反应(PCR).
方法 以一对Hp特异的寡核苷酸为引物，采用双扩增PCR扩增Hp 16S rRNA基因，并与常规检测方法进行了比较.
结果 双扩增PCR检出的最小Hp DNA量为0.01pg.用该方法检测十二指 肠溃疡患者20例石蜡包埋的胃粘膜标本，并与尿素酶试验、细菌培养、Warthin_Starry银染色及PCR对新鲜胃粘膜标本的检测作比较，结果18例患者上述五项检测结果一致，2例尿毒酶试验、银染色及PCR对新鲜胃粘膜标本的检测呈阳性的患者，采用双扩增PCR对石蜡包埋标本的检测未发现Hp DNA.PCR对石蜡包埋标本及新鲜胃粘膜标本的检测有显著相关性.
, 百拇医药
结论 双扩增PCR为分子水平上Hp感染的回顾性研究提供一有利工具.
王蔚虹,胡伏莲,贾博琦.胃粘膜石蜡切片PCR法检测幽门螺杆菌.新消化病学杂志,1997；5(1)：13-14
分子生物学技术的应用推进了有关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染的研究，近年用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测Hp国内外均有报道[1，2]，而PCR从石蜡包埋的胃粘膜标本中检测Hp有一定困难.作者建立了用双扩增PCR从石蜡包埋的胃粘膜标本中检出Hp的方法，为Hp感染的研究提供一有利工具.
1 材料和方法
1.1 PCR方法的建立 新鲜胃粘膜标本1块，置500μl，TE(10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA pH 8.0) 缓冲液研碎，加10% SDS 30μl，蛋白酶K(20m/ml)3μl，55消化1h，以等体积苯酶-氯仿抽提1次.标本处理中设缓冲液阴性对照.石蜡包埋的胃粘膜标本在组织切片机上切成4μm的薄片10片，加800μl二甲苯脱蜡两次，95%乙醇洗2次，空气置干.加400μl TE，加SDS至终浓度1%，蛋白酶K终浓度100μg/ml，55水浴持续消化5d[3]，等体积苯酚一氯仿抽取2次，取5μl用于双扩增PCR.切片过程中每更换蜡块标本，用二甲苯或1mol/L HCl清洁切片，以空白蜡块作对照.CP1/CP2引物来自Hp 16S rRNA基因[1]，由中国科学院遗传所合成并纯化.CP1：5′-GCGCAATCAGCGTCAGG TAATG-3′，CP2：5′-GCTAAGAGATCAGCCTATGTCC-3′，扩增片段长度500bp，其特异性已被证实[4]. PCR扩增Hp 16S rRNA6片段用50μl扩 增体系.扩增反应在Perkin-Elmer公司DNA Thermal Cycler 480上进行：96 5min，1个循环；94 1min变性，55 1min 退火，72 1.5min 延伸，35个循环；最后于72继续延伸10min.双扩增PCR是将4μl经过25个循环的反应液加入46μl新更换的反应液，继续25个循环.反应中以Hp NCTC 11637 做阳性对照，以去离子水代替 模板DNA做阴性对照.扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定.
, http://www.100md.com
1.2 病例的选择及Hp检测 十二指肠溃疡患者20例在内镜直视下距幽门口3-5cm范围内取胃窦粘膜4块，分别做尿素酶试验(兰州军区医高专药盒)、细菌培养、Warthin_Starry银染色、新鲜胃粘膜组织的PCR检测及石蜡包埋胃粘膜组织的双扩增PCR检测.用于银染色及双扩增PCR的石蜡包埋胃粘膜为同一活检组织按常规方法固定包埋的标本.
2 结果
采用10倍系列稀释的Hp NCTC 11637 DNA检测双扩增PCR的敏感性.检出的最小Hp DNA的量 为0.01pg，相当于100个细菌细胞.双扩增PCR检测了20例十二指肠溃疡患者胃窦石蜡包 埋标本，结果16例Hp阳性，4例Hp阴性.5种方法检测胃粘膜标本的比较表1.PCR对新鲜胃粘膜(18/20, 90.0%)及石蜡包埋胃粘膜组织(16/20，80.0%)的检测结果有显著相关性(P< 0.05).
, http://www.100md.com 表1 5种方法检测活检胃粘膜Hp感染结果
| n | 尿素酶试验 | 细菌培养 | 银染色 | PCR(新鲜) | PCR(石蜡) |
| 16 | + | + | + | + | + |
| 2 | + | - | + | + | - |
| 2 | - | - | - | - | - |
3 讨论
用PCR技术从石蜡包埋的胃粘膜中扩增Hp DNA具有重要意义，它使得有关Hp感染的回顾性研究成为可能.由于活检的胃粘膜组织量很小，特别是在常规固定包埋过程中有DNA的降解， 以及DNA提取时难免有固定包埋过程中的某些PCR抑制物的存在和DNA的损失，因此，从石蜡 包埋的组织标本中扩增目的DNA较从新鲜组织标本中的扩增困难许多. 从石蜡包埋的组织标本中提取用于PCR扩增的模板DNA方法较多，有二甲苯脱蜡或水浴脱蜡后以蛋白酶K、SDS消化提取DNA[5]；也有将组织切片直接煮沸后用于PCR扩增[1].本研究中采用的蛋白酶K，SDS 5d消化法提取模板DNA的双扩增PCR可获得较满意的结果，对20例石蜡包埋胃粘膜标本中Hp的检测，发现其中18例的检测结果与PCR对新鲜胃粘膜标本的检测结果一致.采用两对引物的巢式PCR技术可能获得更满意的结果.但从石蜡包埋的胃粘膜组织标本中成功地扩增了Hp DNA，使得对PCR产物的进一步分析成为可能，这就为从分子水平对Hp感染的回顾性研究提供了一个有利的工具.
, 百拇医药
4 参考文献1 Clayton CL, Kleanthous H, Coates PJ, et al. Sensitive detection of Helicobacter pylori by using
polymerase chain reaction. J Clin Microgiol,1992;30(1):192-200
2 宋敏.用巢式聚合酶链反应在唾液中检测出幽门螺杆菌.中华流行病杂志，1993；14(4)：237-240
3 Jackson DP, Lewis FA, Taylor CR, et al. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis
by the polymerase chain reaction. J Clin Pathol,1990;43(3):499-504
4 王蔚虹，胡伏莲，贾博琦.用聚合酶链反应检测胃粘膜标本中的幽门螺杆菌.中华内科杂志，199；34(7)：480
5 Ho SA, Hoyle JA, Lewis FA, et al. Direct polymerase chain reaction test for detection of
Helicobacter pylori in humans and animals. J Clin Microbiol, 1991;29(11):2543-2549, 百拇医药