胃粘膜组织中Hp的感染与癌基因ras及抑癌基因p53、p16的关系
1陕西省西安市中心医院 710006
2第四军医大学全军基因诊断技术应用研究所
项目负责人 张沥,陕西省西安市中心医院 710006收稿日期 1997-06-15 接收日期 1997-09-20
Subject headings gastric mucosa/microbiology; helicobacter infections/ediology; genes, RAS; genes, p53; genes, suppressor, tumor
主题词 胃粘膜/微生物学；螺杆菌感染/病因学；基因，RAS，基因，p53；基因，抑制，肿瘤
, 百拇医药
张沥, 阎小君, 白西平, 韩锋产, 张玲霞, 苏成芝. 胃粘膜组织中Hp的感染与癌基因ras及抑癌基因p53、p16的关系.
华人消化杂志,1998;6(2):177-178
大量的研究表明幽门螺杆菌(Hp)与胃癌的发生有密切关系[1-3]，但Hp是如何引起胃粘膜组织细胞发生癌变的分 子机制尚不完全清楚[4-6]. 藉此，本研究主要从Hp与胃粘膜组织中癌基因及抑癌基因结构的关系上，探讨Hp可能导致胃粘膜组织癌变的分子机制.
1 材料和方法
1.1 材料 经病理确诊的胃癌组织18份，胃粘膜肠上皮化生标本11份，不典型增生标本17份和慢性胃炎标本18份，均为石蜡包埋切片，共5张素片，随机抽取其中3张进行实验. ①PCR引物序列表1，主要结合文献[7]和计算机基因库设计，本所合成. ②PCR反应及SSCP，RFLP所用的试剂主要由美国Joss Biolab公司提供. ③实验所用设备主要为美国Bio-Rad mini-protein Ⅱ电泳系统，美国Thermolyne扩增仪等.
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1.2 方法 按文献[7]进行. ①RFLP：将PCR扩增产物用限制性内切酶消化处理，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，溴化乙淀染色，紫外灯下观察并拍照. ②SSCP：取PCR产物5μl，加入20μl变性剂(95%甲酰胺、10mmol/L EDTA、0.02%溴酚蓝，0.05%二甲苯青)及30μl石蜡油，煮沸5min，取出，立即冰浴2min以上. 将水相全部上样，在冰箱中4℃下进行SSCP电泳，开始在300V电压下电 泳5min，然后在120V下电泳8h～10h，取下凝胶，将其浸在0.5μg/ml溴化乙锭的1×TBE缓冲液中染色20min～30min，在紫外灯下观察结果并拍照，以质粒及正常组织为对照，若有单链DNA条带迁移率差异>3mm或存在有数量及形态上的改变，则被认为有突变. ③癌基因及抑癌基因-PCR法：DNA的抽提按文献[4]进行，取一定量的纯化DNA分别加入p53第5、6、7、8外显子的引物和p16,ras基因引物进行PCR扩增. 扩增条件同Hp，用琼脂糖凝胶电泳首先鉴定扩增的结果，然后用RFLP及SSCP法鉴定其结构.
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表1 本文所应用引物的序列
2 结果
采用PCR结合SSCP及RFLP技术，对各组织中Hp的感染及癌基因(ras)与抑癌基因(p53,p16)的突变进行检测，检测结果列于表2，表3中. 其中RFLP及SSCP有一项异常者均记为阳性，即基因发生了突变；Hp阳性表示PCR法检测到了Hp DNA.
表2 胃癌组织中Hp感染与p53,p16和ras基因结构的关系
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aP<0.05，bP<0.01，(Hp阳性与阴性标本比较).
表3 胃粘膜癌前病变组织中Hp感染与p53,p16和ras基因结构关系的研究
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aP<0.05，bP<0.01，(Hp阳性与阴性标本比较).
从表2和表3可见，经χ2检验，Hp感染的组织中癌基因及抑癌基因突变的比例均显著高于Hp未感染的组织，这说明癌基因或抑癌基因的突变与Hp的感染有关.
3 讨论
以往，大量的流行病学资料表明Hp的感染与胃癌的发生有较为密切的关系[1-6]，这里有以下证据：①胃癌患者胃内有Hp；②Hp的感染先于胃癌的诊断；③Hp感染者胃癌发生的危险性至少提高了7倍，从而推测，Hp有助于下列过程的演变： Hp相关性胃炎→萎缩性胃炎→肠化生及不典型增生→癌变. 最近，西方一些国家的学者发现Hp感染与一种罕见的胃癌-胃粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤(MALToma)有关系[5,6]，Hp能促使低恶性度胃MALToma的增殖；抗Hp治疗清除Hp后能使经活检证实的低恶性度MALToma消退，停止治疗而Hp重新感染后，部分MALToma复发. 还发现在MALToma中伴随有抑癌基因(DCC，APC)等位基因的失衡[6]. 国内张锦坤 et al[8]的研究也提示，Hp感染后，ras癌基因的突变率明显升高,rasP21蛋白表达增强. 本研究的结果证实Hp的感染能使组织细胞中 抑癌基因(p53,p16)和癌基因(ras)的突变率增高，癌基因或抑癌基因的突变可引起胃粘膜上皮细胞癌变，这为阐明Hp与胃癌发生有关的分子机制提供了实验依据.
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4 参考文献
1 周殿元，杨海涛，张万岱. 幽门螺杆菌与胃十二指肠疾病. 第1版. 上海：上海科技文献出版社，1992：11-16
2 Wang JD, Xie GJ,Zhou DY. Retrospetive study on the relationship between Hp infection and gastric cancer of pre cancerous
diseases. J Gastroenterol Hepatol, 1996;11(Suppl 1):A18
3 Chen Q, Ren G, Chen JX. A study of the expression of p21 in Hp infection and gastric cancer.J Gastroenterol Hepatol,1996;11(Suppl 1):A19
, http://www.100md.com
4 Yan XJ, Zhang L, Su CZ. The relation of oncogene to Hp infection of the gastric epithelium. J Gastroenterol Hepatol,1996; (Suppl):A18
5 Parsonnet S, Hansen S, Rodriguez I. Helicobacter pylori and gastric lymphoma. Gastroenterology,1995;118(2):610-612
6 Calvert R, Randerson J, Evans P, Cawkwell L, Lewis F,Dixon FM,et al.Genetic abnormalities during transition from Helicobacter
pylori associated gastritis to low grade MALToma. Lancet,1995;345(7):26-27
7 Tadashi H, Buzard GS, Palli D,Christopher MW, Andrea AM, Monica G et al. Mutations of Kras and p53 genes in
gastric adenocarcinomas from a high incidence region around Florance, Italy. Cancer Research,1995;55(15):2665-2672
8 张锦坤，于君. 胃癌变过程中ras基因活化和DNA量的综合研究. 中华内科杂志，1995；34(1)：739-741, 百拇医药(张沥1 阎小君2 白西平1 韩锋产2 张玲霞1 苏成芝2)
2第四军医大学全军基因诊断技术应用研究所
项目负责人 张沥,陕西省西安市中心医院 710006收稿日期 1997-06-15 接收日期 1997-09-20
Subject headings gastric mucosa/microbiology; helicobacter infections/ediology; genes, RAS; genes, p53; genes, suppressor, tumor
主题词 胃粘膜/微生物学；螺杆菌感染/病因学；基因，RAS，基因，p53；基因，抑制，肿瘤
, 百拇医药
张沥, 阎小君, 白西平, 韩锋产, 张玲霞, 苏成芝. 胃粘膜组织中Hp的感染与癌基因ras及抑癌基因p53、p16的关系.
华人消化杂志,1998;6(2):177-178
大量的研究表明幽门螺杆菌(Hp)与胃癌的发生有密切关系[1-3]，但Hp是如何引起胃粘膜组织细胞发生癌变的分 子机制尚不完全清楚[4-6]. 藉此，本研究主要从Hp与胃粘膜组织中癌基因及抑癌基因结构的关系上，探讨Hp可能导致胃粘膜组织癌变的分子机制.
1 材料和方法
1.1 材料 经病理确诊的胃癌组织18份，胃粘膜肠上皮化生标本11份，不典型增生标本17份和慢性胃炎标本18份，均为石蜡包埋切片，共5张素片，随机抽取其中3张进行实验. ①PCR引物序列表1，主要结合文献[7]和计算机基因库设计，本所合成. ②PCR反应及SSCP，RFLP所用的试剂主要由美国Joss Biolab公司提供. ③实验所用设备主要为美国Bio-Rad mini-protein Ⅱ电泳系统，美国Thermolyne扩增仪等.
, 百拇医药
1.2 方法 按文献[7]进行. ①RFLP：将PCR扩增产物用限制性内切酶消化处理，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，溴化乙淀染色，紫外灯下观察并拍照. ②SSCP：取PCR产物5μl，加入20μl变性剂(95%甲酰胺、10mmol/L EDTA、0.02%溴酚蓝，0.05%二甲苯青)及30μl石蜡油，煮沸5min，取出，立即冰浴2min以上. 将水相全部上样，在冰箱中4℃下进行SSCP电泳，开始在300V电压下电 泳5min，然后在120V下电泳8h～10h，取下凝胶，将其浸在0.5μg/ml溴化乙锭的1×TBE缓冲液中染色20min～30min，在紫外灯下观察结果并拍照，以质粒及正常组织为对照，若有单链DNA条带迁移率差异>3mm或存在有数量及形态上的改变，则被认为有突变. ③癌基因及抑癌基因-PCR法：DNA的抽提按文献[4]进行，取一定量的纯化DNA分别加入p53第5、6、7、8外显子的引物和p16,ras基因引物进行PCR扩增. 扩增条件同Hp，用琼脂糖凝胶电泳首先鉴定扩增的结果，然后用RFLP及SSCP法鉴定其结构.
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表1 本文所应用引物的序列
名称 扩增片段长度 序列(5′-3′) p53(5) 183 CTTTCAACTCTGTCTCCTTC TGGGCAACCAGCCCTGTCGT p53(6) 114 CCCCAGGCCTCTAGTTCCTC , 百拇医药 CTCACCCGGAGGGCCACTGA p53(7) 111 TGCCACAGGTCTCCCCAAG GGGACAAGCAGGCCAGTGTG p53(8) 135 GGACAGGTAGGACCTGATTTC AATCTGAGGCATAACTGCAC p16 450 AGCAGCATGGAGCCTTCGGCT TTTGAATTCAATCGGGGATGTCTG ras 91 GACGGAATGTAAGCTGGTGG , 百拇医药 TTCGTCCACAAAATGGTTGT Hp 411 GCCAATGGTAAATTAGTT CTCCTTAATTGTTTTTAC |
2 结果
采用PCR结合SSCP及RFLP技术，对各组织中Hp的感染及癌基因(ras)与抑癌基因(p53,p16)的突变进行检测，检测结果列于表2，表3中. 其中RFLP及SSCP有一项异常者均记为阳性，即基因发生了突变；Hp阳性表示PCR法检测到了Hp DNA.
表2 胃癌组织中Hp感染与p53,p16和ras基因结构的关系
| 抑癌基因或癌基因 | 突变率 | |
| Hp阳性标本 | Hp阴性标本 | |
| p53 | 8/12a | 1/6 |
| p16 | 6/12a | 0/6 |
| ras | 8/12b | 0/6 |
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aP<0.05，bP<0.01，(Hp阳性与阴性标本比较).
表3 胃粘膜癌前病变组织中Hp感染与p53,p16和ras基因结构关系的研究
| 抑癌基因或癌基因 | 突变率 | |
| Hp阳性标本 | Hp阴性标本 | |
| p53 | 18/39b | 1/7 |
| p16 | 15/39a | 0/7 |
| ras | 17/39b | 1/7 |
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aP<0.05，bP<0.01，(Hp阳性与阴性标本比较).
从表2和表3可见，经χ2检验，Hp感染的组织中癌基因及抑癌基因突变的比例均显著高于Hp未感染的组织，这说明癌基因或抑癌基因的突变与Hp的感染有关.
3 讨论
以往，大量的流行病学资料表明Hp的感染与胃癌的发生有较为密切的关系[1-6]，这里有以下证据：①胃癌患者胃内有Hp；②Hp的感染先于胃癌的诊断；③Hp感染者胃癌发生的危险性至少提高了7倍，从而推测，Hp有助于下列过程的演变： Hp相关性胃炎→萎缩性胃炎→肠化生及不典型增生→癌变. 最近，西方一些国家的学者发现Hp感染与一种罕见的胃癌-胃粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤(MALToma)有关系[5,6]，Hp能促使低恶性度胃MALToma的增殖；抗Hp治疗清除Hp后能使经活检证实的低恶性度MALToma消退，停止治疗而Hp重新感染后，部分MALToma复发. 还发现在MALToma中伴随有抑癌基因(DCC，APC)等位基因的失衡[6]. 国内张锦坤 et al[8]的研究也提示，Hp感染后，ras癌基因的突变率明显升高,rasP21蛋白表达增强. 本研究的结果证实Hp的感染能使组织细胞中 抑癌基因(p53,p16)和癌基因(ras)的突变率增高，癌基因或抑癌基因的突变可引起胃粘膜上皮细胞癌变，这为阐明Hp与胃癌发生有关的分子机制提供了实验依据.
, 百拇医药
4 参考文献
1 周殿元，杨海涛，张万岱. 幽门螺杆菌与胃十二指肠疾病. 第1版. 上海：上海科技文献出版社，1992：11-16
2 Wang JD, Xie GJ,Zhou DY. Retrospetive study on the relationship between Hp infection and gastric cancer of pre cancerous
diseases. J Gastroenterol Hepatol, 1996;11(Suppl 1):A18
3 Chen Q, Ren G, Chen JX. A study of the expression of p21 in Hp infection and gastric cancer.J Gastroenterol Hepatol,1996;11(Suppl 1):A19
, http://www.100md.com
4 Yan XJ, Zhang L, Su CZ. The relation of oncogene to Hp infection of the gastric epithelium. J Gastroenterol Hepatol,1996; (Suppl):A18
5 Parsonnet S, Hansen S, Rodriguez I. Helicobacter pylori and gastric lymphoma. Gastroenterology,1995;118(2):610-612
6 Calvert R, Randerson J, Evans P, Cawkwell L, Lewis F,Dixon FM,et al.Genetic abnormalities during transition from Helicobacter
pylori associated gastritis to low grade MALToma. Lancet,1995;345(7):26-27
7 Tadashi H, Buzard GS, Palli D,Christopher MW, Andrea AM, Monica G et al. Mutations of Kras and p53 genes in
gastric adenocarcinomas from a high incidence region around Florance, Italy. Cancer Research,1995;55(15):2665-2672
8 张锦坤，于君. 胃癌变过程中ras基因活化和DNA量的综合研究. 中华内科杂志，1995；34(1)：739-741, 百拇医药(张沥1 阎小君2 白西平1 韩锋产2 张玲霞1 苏成芝2)