移植培养人肝细胞对急性肝衰竭小鼠的保护作用
第三军医大学西南医院传染科 重庆市 400038
王英杰，男，1960-10-03生，陕西省延安市人，汉族. 1985年延安大学医学系本科毕业，1997年第三军医大学博士研究生毕业，主要从事重型肝炎发病机制与防治研究，现为国家九五攻关项目负责人，发表论文60篇.
*国家“九五”攻关项目，No.96-920-12-02.
项目负责人 王英杰，400038，第三军医大学西南医院传染科，重庆市沙坪坝区高滩岩正街30号.
*Supported by “95” National Key Task Project, No.96-920-12-02.
Correspondence to Dr. Ying-Jie Wang, Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University,30 Gaotanyan Zhengjie, Shapingba District, Chongqing 400038, China
, http://www.100md.com
Tel. +86·23·68754217(O)
收稿日期 1998-02-08 接收日期 1998-03-06
Effect of cultured human hepatocytes on D-Gal induced acute hepatic failure in mice
Ying-Jie Wang, Xiao-Hong Wang, Meng-Dong Li and Yu-Ming Wang
Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To evaluate the effect of intraperitoneal transplantation of microcarrier-attached human hepatocytes on acute hepatic failure in mice induced by D-galactosamine (D-Gal).
METHODS Human hepatocytes were isolated by collagenase perfusion and cultured on collagen-coated microcarriers. The microcarrier-attached human hepatocytes (2×106 cells) were intraperitoneally transplanted into mice with 2.5g/kg D-Gal-induced (4 hours) acute liver failure (n=32). Survival rate, liver function, and liver pathologic changes of experimental mice were determined 72 hours after treatment to evaluate the results.
, http://www.100md.com
RESULTS As compared with control mice which received injections of microcarriers alone, a marked improvement in survival rate was observed in mice transplanted with the microcarrier-attached hepatocytes (65% vs 0%). Mean serum alanine aminotransferase (ALT, IU/L, 217.44±26.30 vs 426.31±49.28, P<0.05), serum total bilirubin (TB, mmol/L, 26.91±3.76 vs 41.68±3.83,P<0.05), and liver pathologic changes were low and mild in the transplanted mice.
, 百拇医药
CONCLUSION Intraperitoneal transplantation of microcarrier-attached human hepatocytes will provide metabolic support to restore D-Gal-damaged liver function .
Subject headings liver failure, acute/therapy; liver transplantation; galactose; liver/pathology
Wang YJ, Wang XH, Li MD, Wang YM. Effect of cultured human hepatocytes on D-Gal induced acute hepatic failure in mice.
, http://www.100md.com
Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(5):383-385
摘要
目的 探讨腹腔移植微载体粘附培养人肝细胞对D氨基半乳糖(D-Gal)诱导的急性肝衰竭小鼠的保护作用.
方法 采用胶原酶灌流法分离人肝细胞，胶原被覆的微载体Cytodex 3加以培养，经腹腔⑸×10.6个肝细胞及载体，观察急性肝衰竭小鼠
(n=32，2.5g/kg D-Gal诱导4h) 72h存活率、血清ALT、总胆红素以及肝脏病理变化.
结果 与只接受微载体而无粘附肝细胞的对照组比较，腹腔移植培养肝细胞对肝衰竭小鼠的存活率有明显改善(65% vs 0%)，其血清ALT(IU/L，217.44±26.30 vs 426.31±49.28，P<0.05)及总胆红素(mmol/L，26.91±3.76 vs 41.68±3.83，P<0.05)较低. 肝组织病理改变较轻.
, http://www.100md.com
结论 腹腔移植微载体粘附培养肝细胞可提供代谢支持，使D-Gal损伤的小鼠肝功能恢复.
主题词 肝功能衰竭，急性/治疗；肝移植；半乳糖；肝/病理学
王英杰, 王小红, 李梦东, 王宇明.移植培养人肝细胞对急性肝衰竭小鼠的保护作用.华人消化杂志,1998;6(5):383-385
0 引言
近年来，随着肝细胞分离和培养技术的提高与发展，应用培养肝细胞移植治疗急性肝衰竭的研究不断增多，并日益受到学者们的重视与关注[1]. 我们在成功进行人肝细胞的体外简易两步灌流法分离和高密度微载体粘附培养的基础上[2]，初步观察了腹腔移植微载体培养人肝细胞对急性肝衰竭小鼠的保护作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 肝组织来自正常人供体. 按我们以往使用的无Ca2+，Mg2+的Hanks液和含Ca2+的0.5g/L胶原酶液进行体外两步灌流分离细胞. 待灌注肝组织出现龟背状裂隙后，钝性撕碎，于37℃水浴中振荡消化15min，采用差速离心法分离出肝细胞. 经台盼兰染色、计数后，按4×108/L制备肝细胞悬液，置37℃水浴轻轻振荡旋转20min. 将肝细胞悬液移入被覆贴壁抑制剂聚羟乙基异丁烯酸的玻璃培养瓶内，同时加入微载体Cytodex 3(Sigma产品)，剂量为5g/L. 将培养瓶置于37℃水浴面上轻轻振荡旋转20min，然后放入37℃、50ml/L CO2和湿度100%的培养箱内培养，并定时轻轻振荡培养瓶，每30min 1次，每次3min～5min，4h后更换激素限定条件培养液，并加100ml/L的小牛血清. 此后每4h～6h再振荡1次. 培养液每24h更换1次. 8wk～12wk的昆明鼠32只，雌雄兼用(由本校实验动物中心提供)，在本实验室饲养1wk，实验前禁食12h，不禁水. 用D-氨基半乳糖(D-Gal，重庆医科大学化学教研室提供)2.5g/kg(最适致死量)腹腔注射制备急性肝衰竭模型. 注射D-Gal 4h后分组进行实验.
, 百拇医药
1.2 方法 随机将实验肝衰竭小鼠分为移植组和对照组，移植组每只腹腔注射微载体培养(4d～5d)的肝细胞约2×106个，对照组注射无肝细胞的微载体，数量大致与移植组培养肝细胞的微载体相等. 各组分别取10只观察72h的存活率，另6只于实验24h活杀取血检测ALT和总胆红素(TB)，并取肝脏常规切片染色，观察肝组织病理变化.
2 结果
2.1 肝细胞的分离与微载体培养 实验分离所得肝细胞的存活率在94%以上，将其与微载体混合并振荡20min后，大多已呈片状、簇状或团块状多细胞粘连体，漂浮于培养液中. 加入微载体并继续振荡20min后，大多数细胞粘连体附着于载体表面，出现以载体为中心的葡萄样粘连现象. 肝细胞与微载体的粘附率达86.4%. 经间歇振荡培养24h后，细胞粘连体将载体部分或整个包裹，约48h形成典型的多细胞紧密粘附聚集的球形体特征. 由于细胞间的互相粘附特性，使微载体及肝细胞以片状相连方式悬浮生长，直至培养终止，培养至移植时培养肝细胞上清中已有较多的清蛋白、总蛋白及AFP分泌.
, 百拇医药
2.2 肝细胞移植小鼠的存活率 腹腔移植微载体培养肝细胞组(图1)小鼠72h的存活率明显高于对照组.
图1 肝细胞移植小鼠的存活率
2.3 两组急性肝衰竭小鼠的肝功能 于移植24h，两组急性肝衰竭小鼠ALT和TB的测定结果显示，肝细胞移植组小鼠的ALT和TB均低于对照组，两组均值比较具有显著性差异(P<0.05，图2).
图2 两组急性肝衰竭小鼠的肝功能比较
2.4 两组实验小鼠的肝组织病理改变 镜检对照组24h肝组织标本，发现有明显的肝细胞坏死，以片状融合性坏死为主，混合灶性坏死，肝窦充血，肝细胞排列紊乱，小叶结构破坏以及炎细胞浸润等. 而肝细胞移植小鼠肝组织病理变化较对照组轻，其主要病理特征为肝细胞浊肿变性和散在性点状坏死及嗜酸性变，偶见小片状坏死融合灶及炎细胞浸润.
, 百拇医药
3 讨论
众所周知，临床上各种原因所致的急性肝衰竭十分常见，由于此类患者的大部分肝细胞在短期内发生变性，坏死和功能衰竭，依靠现有病因治疗和一般对症治疗多不能代偿肝细胞功能，故病情凶险，病死率极高. 目前，急性肝衰竭的最有效疗法是肝移植[4]，经改进手术方法及使用免疫抑制剂对抗排斥反应，已使肝移植患者的总存活率达75%. 但肝移植存在很多局限性，如供体来源有限，难以满足治疗急性肝衰竭的紧急肝移植需要；手术创伤大、操作复杂，围手术期处理要求高，手术失败后再移植成功率低；须终生接受免疫抑制疗法；费用十分昂贵，每例平均约14万美元，非一般患者所能接受. 故大多数急性肝衰患者无法通过肝移植而获得救治.
鉴于肝组织本身具有极强的潜在的再生能力，故一般认为，倘若能给急性肝衰竭患者有效的人工肝支持，其坏死的肝组织就有可能通过残存肝细胞的再生而修复，并使衰竭的肝功能得以恢复，基于此，国内外学者长期致力于人工肝支持研究，肝细胞移植是其主要内容之一. 迄今为止，有关研究已积累了不少实验依据，移植肝细胞对实验性急性肝衰竭动物的保护作用已被众多的实验研究所证实[5]，但采用高活性和高密度培养肝细胞进行移植治疗急性肝衰竭的研究报道尚少. 我们首先通过可靠的体外两步灌流法分离到活力大于90%的人肝细胞，采用综合限制贴壁、促进聚集的微载体培养技术进行高密度、高活性培养，在肝细胞功能活跃时移植于急性肝衰竭小鼠腹腔，初步研究结果显示，移植小鼠存活率明显提高，肝功能较对照组好转，病理改变较轻，提示移植的微载体肝细胞具有代谢支持作用. 由于酶消化分离和微载体培养的人肝细胞活力远高于以往机械分离的胎肝细胞，并可较长时间培养，使用方便，可望部分代替原位肝移植，对病因单一，损害可逆的急性肝衰竭起到较好的支持与治疗作用.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Wang XD. Hepatocyte transplantation: a potential treatment for acute liver failure. Scand J Gastroenterol, 1995;30(2):193-200
2 王英杰，李梦东，王宇明，王小红，聂青和. 人肝细胞的微载体培养及其意义. 中华消化杂志，1997；17(4)：191-194
3 Pappas SC. Fulminant hepatic failure and need forartificial liver support. Mayo Clin Proc, 1988;63(2):198-205
4 Stieber AC, Iwatsuki S, Starzl TE, Orthotopic liver transplantation for fulminant and subacute hepatic failure.
ASAIO Transplant, 1988;34(6):959-964
5 Dixit V. Transplantation of isolated hepatocytes and their role in extrahepatic life support systems.
Scand J Gastroenterol,1995;30(Suppl 208):101-110, 百拇医药(王英杰 王小红 李梦东 王宇明)
王英杰，男，1960-10-03生，陕西省延安市人，汉族. 1985年延安大学医学系本科毕业，1997年第三军医大学博士研究生毕业，主要从事重型肝炎发病机制与防治研究，现为国家九五攻关项目负责人，发表论文60篇.
*国家“九五”攻关项目，No.96-920-12-02.
项目负责人 王英杰，400038，第三军医大学西南医院传染科，重庆市沙坪坝区高滩岩正街30号.
*Supported by “95” National Key Task Project, No.96-920-12-02.
Correspondence to Dr. Ying-Jie Wang, Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University,30 Gaotanyan Zhengjie, Shapingba District, Chongqing 400038, China
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Tel. +86·23·68754217(O)
收稿日期 1998-02-08 接收日期 1998-03-06
Effect of cultured human hepatocytes on D-Gal induced acute hepatic failure in mice
Ying-Jie Wang, Xiao-Hong Wang, Meng-Dong Li and Yu-Ming Wang
Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To evaluate the effect of intraperitoneal transplantation of microcarrier-attached human hepatocytes on acute hepatic failure in mice induced by D-galactosamine (D-Gal).
METHODS Human hepatocytes were isolated by collagenase perfusion and cultured on collagen-coated microcarriers. The microcarrier-attached human hepatocytes (2×106 cells) were intraperitoneally transplanted into mice with 2.5g/kg D-Gal-induced (4 hours) acute liver failure (n=32). Survival rate, liver function, and liver pathologic changes of experimental mice were determined 72 hours after treatment to evaluate the results.
, http://www.100md.com
RESULTS As compared with control mice which received injections of microcarriers alone, a marked improvement in survival rate was observed in mice transplanted with the microcarrier-attached hepatocytes (65% vs 0%). Mean serum alanine aminotransferase (ALT, IU/L, 217.44±26.30 vs 426.31±49.28, P<0.05), serum total bilirubin (TB, mmol/L, 26.91±3.76 vs 41.68±3.83,P<0.05), and liver pathologic changes were low and mild in the transplanted mice.
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CONCLUSION Intraperitoneal transplantation of microcarrier-attached human hepatocytes will provide metabolic support to restore D-Gal-damaged liver function .
Subject headings liver failure, acute/therapy; liver transplantation; galactose; liver/pathology
Wang YJ, Wang XH, Li MD, Wang YM. Effect of cultured human hepatocytes on D-Gal induced acute hepatic failure in mice.
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Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(5):383-385
摘要
目的 探讨腹腔移植微载体粘附培养人肝细胞对D氨基半乳糖(D-Gal)诱导的急性肝衰竭小鼠的保护作用.
方法 采用胶原酶灌流法分离人肝细胞，胶原被覆的微载体Cytodex 3加以培养，经腹腔⑸×10.6个肝细胞及载体，观察急性肝衰竭小鼠
(n=32，2.5g/kg D-Gal诱导4h) 72h存活率、血清ALT、总胆红素以及肝脏病理变化.
结果 与只接受微载体而无粘附肝细胞的对照组比较，腹腔移植培养肝细胞对肝衰竭小鼠的存活率有明显改善(65% vs 0%)，其血清ALT(IU/L，217.44±26.30 vs 426.31±49.28，P<0.05)及总胆红素(mmol/L，26.91±3.76 vs 41.68±3.83，P<0.05)较低. 肝组织病理改变较轻.
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结论 腹腔移植微载体粘附培养肝细胞可提供代谢支持，使D-Gal损伤的小鼠肝功能恢复.
主题词 肝功能衰竭，急性/治疗；肝移植；半乳糖；肝/病理学
王英杰, 王小红, 李梦东, 王宇明.移植培养人肝细胞对急性肝衰竭小鼠的保护作用.华人消化杂志,1998;6(5):383-385
0 引言
近年来，随着肝细胞分离和培养技术的提高与发展，应用培养肝细胞移植治疗急性肝衰竭的研究不断增多，并日益受到学者们的重视与关注[1]. 我们在成功进行人肝细胞的体外简易两步灌流法分离和高密度微载体粘附培养的基础上[2]，初步观察了腹腔移植微载体培养人肝细胞对急性肝衰竭小鼠的保护作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 肝组织来自正常人供体. 按我们以往使用的无Ca2+，Mg2+的Hanks液和含Ca2+的0.5g/L胶原酶液进行体外两步灌流分离细胞. 待灌注肝组织出现龟背状裂隙后，钝性撕碎，于37℃水浴中振荡消化15min，采用差速离心法分离出肝细胞. 经台盼兰染色、计数后，按4×108/L制备肝细胞悬液，置37℃水浴轻轻振荡旋转20min. 将肝细胞悬液移入被覆贴壁抑制剂聚羟乙基异丁烯酸的玻璃培养瓶内，同时加入微载体Cytodex 3(Sigma产品)，剂量为5g/L. 将培养瓶置于37℃水浴面上轻轻振荡旋转20min，然后放入37℃、50ml/L CO2和湿度100%的培养箱内培养，并定时轻轻振荡培养瓶，每30min 1次，每次3min～5min，4h后更换激素限定条件培养液，并加100ml/L的小牛血清. 此后每4h～6h再振荡1次. 培养液每24h更换1次. 8wk～12wk的昆明鼠32只，雌雄兼用(由本校实验动物中心提供)，在本实验室饲养1wk，实验前禁食12h，不禁水. 用D-氨基半乳糖(D-Gal，重庆医科大学化学教研室提供)2.5g/kg(最适致死量)腹腔注射制备急性肝衰竭模型. 注射D-Gal 4h后分组进行实验.
, 百拇医药
1.2 方法 随机将实验肝衰竭小鼠分为移植组和对照组，移植组每只腹腔注射微载体培养(4d～5d)的肝细胞约2×106个，对照组注射无肝细胞的微载体，数量大致与移植组培养肝细胞的微载体相等. 各组分别取10只观察72h的存活率，另6只于实验24h活杀取血检测ALT和总胆红素(TB)，并取肝脏常规切片染色，观察肝组织病理变化.
2 结果
2.1 肝细胞的分离与微载体培养 实验分离所得肝细胞的存活率在94%以上，将其与微载体混合并振荡20min后，大多已呈片状、簇状或团块状多细胞粘连体，漂浮于培养液中. 加入微载体并继续振荡20min后，大多数细胞粘连体附着于载体表面，出现以载体为中心的葡萄样粘连现象. 肝细胞与微载体的粘附率达86.4%. 经间歇振荡培养24h后，细胞粘连体将载体部分或整个包裹，约48h形成典型的多细胞紧密粘附聚集的球形体特征. 由于细胞间的互相粘附特性，使微载体及肝细胞以片状相连方式悬浮生长，直至培养终止，培养至移植时培养肝细胞上清中已有较多的清蛋白、总蛋白及AFP分泌.
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2.2 肝细胞移植小鼠的存活率 腹腔移植微载体培养肝细胞组(图1)小鼠72h的存活率明显高于对照组.
图1 肝细胞移植小鼠的存活率
2.3 两组急性肝衰竭小鼠的肝功能 于移植24h，两组急性肝衰竭小鼠ALT和TB的测定结果显示，肝细胞移植组小鼠的ALT和TB均低于对照组，两组均值比较具有显著性差异(P<0.05，图2).
图2 两组急性肝衰竭小鼠的肝功能比较
2.4 两组实验小鼠的肝组织病理改变 镜检对照组24h肝组织标本，发现有明显的肝细胞坏死，以片状融合性坏死为主，混合灶性坏死，肝窦充血，肝细胞排列紊乱，小叶结构破坏以及炎细胞浸润等. 而肝细胞移植小鼠肝组织病理变化较对照组轻，其主要病理特征为肝细胞浊肿变性和散在性点状坏死及嗜酸性变，偶见小片状坏死融合灶及炎细胞浸润.
, 百拇医药
3 讨论
众所周知，临床上各种原因所致的急性肝衰竭十分常见，由于此类患者的大部分肝细胞在短期内发生变性，坏死和功能衰竭，依靠现有病因治疗和一般对症治疗多不能代偿肝细胞功能，故病情凶险，病死率极高. 目前，急性肝衰竭的最有效疗法是肝移植[4]，经改进手术方法及使用免疫抑制剂对抗排斥反应，已使肝移植患者的总存活率达75%. 但肝移植存在很多局限性，如供体来源有限，难以满足治疗急性肝衰竭的紧急肝移植需要；手术创伤大、操作复杂，围手术期处理要求高，手术失败后再移植成功率低；须终生接受免疫抑制疗法；费用十分昂贵，每例平均约14万美元，非一般患者所能接受. 故大多数急性肝衰患者无法通过肝移植而获得救治.
鉴于肝组织本身具有极强的潜在的再生能力，故一般认为，倘若能给急性肝衰竭患者有效的人工肝支持，其坏死的肝组织就有可能通过残存肝细胞的再生而修复，并使衰竭的肝功能得以恢复，基于此，国内外学者长期致力于人工肝支持研究，肝细胞移植是其主要内容之一. 迄今为止，有关研究已积累了不少实验依据，移植肝细胞对实验性急性肝衰竭动物的保护作用已被众多的实验研究所证实[5]，但采用高活性和高密度培养肝细胞进行移植治疗急性肝衰竭的研究报道尚少. 我们首先通过可靠的体外两步灌流法分离到活力大于90%的人肝细胞，采用综合限制贴壁、促进聚集的微载体培养技术进行高密度、高活性培养，在肝细胞功能活跃时移植于急性肝衰竭小鼠腹腔，初步研究结果显示，移植小鼠存活率明显提高，肝功能较对照组好转，病理改变较轻，提示移植的微载体肝细胞具有代谢支持作用. 由于酶消化分离和微载体培养的人肝细胞活力远高于以往机械分离的胎肝细胞，并可较长时间培养，使用方便，可望部分代替原位肝移植，对病因单一，损害可逆的急性肝衰竭起到较好的支持与治疗作用.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Wang XD. Hepatocyte transplantation: a potential treatment for acute liver failure. Scand J Gastroenterol, 1995;30(2):193-200
2 王英杰，李梦东，王宇明，王小红，聂青和. 人肝细胞的微载体培养及其意义. 中华消化杂志，1997；17(4)：191-194
3 Pappas SC. Fulminant hepatic failure and need forartificial liver support. Mayo Clin Proc, 1988;63(2):198-205
4 Stieber AC, Iwatsuki S, Starzl TE, Orthotopic liver transplantation for fulminant and subacute hepatic failure.
ASAIO Transplant, 1988;34(6):959-964
5 Dixit V. Transplantation of isolated hepatocytes and their role in extrahepatic life support systems.
Scand J Gastroenterol,1995;30(Suppl 208):101-110, 百拇医药(王英杰 王小红 李梦东 王宇明)