肝星状细胞激活与ICAM1的表达
上海第二医科大学附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所 200001
陆伦根，男，1965-11-09生，江苏扬州市人，汉族. 1987年扬州大学医学院医学系本科毕业，1990年南京医科大学获硕士学位，讲师，在读消化内科博士，发表论文20篇.
*国家自然科学基金资助项目，No. 39670339.
项目负责人 陆伦根，200001，上海第二医科大学附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所，上海市山东中路145号.
*Project supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39670339.
, http://www.100md.com
Correspondence to Lun-Gen Lu, Shanghai Institute of Digestive Diseases, Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, 145 Shandong Zhongliu, Shanghai 200001, China
Tel. +86·21·63260930-2134
收稿日期 1997-03-08
Expression of intercellular adhesion molecule-1 by activated hepatic stellate cells*
Lun-Gen Lu, Min-De Zeng, Ji-Qiang Li, De-Kai Qiu, Jing Hua and Zhu-Ping Fan
, 百拇医药
Shanghai Institute of Digestive Diseases, Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001, China
Abstract
AIM To explore the relationship between activation of hepatic stellate cells (HSC) and expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1).
METHODS HSCs were isolated and cultured from liver of Wistar rats by in situ perfusion with pronase and collagenase and density gradient centrifugation with Nycodenz. Expression of ICAM-1 in a quiescent and an activated HSC was detected by immunohistochemistry assay.
, 百拇医药
RESULTS Expression of ICAM-1 was not observed in the quiescent HSC, but seen in the activated, and the amount of the expression was increasing with the time of culture.
CONCLUSION Expression of ICAM-1 is related to activation of HSC and liver fibrosis.
Subject headings liver/cytology; astrocytes; vascular cell adhesion; molec /analysis; liver cirrhosis/etiology
, 百拇医药
Lu LG, Zeng MD, Li JQ, Qiu DK, Hua J, Fan ZP. Expression of interc ellular adhesion molecule1 by activated hepatic stellate cells. Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(7):567-569
摘要
目的 探讨肝星状细胞(HSC)的活化与细胞间粘附分子1(ICAM-1)表达的关系.
方法 用链酶蛋白酶和胶原酶原位灌流，Nycodenz密度梯度离心分离大鼠HSC，并进行体外培养，应用免疫组织化学方法观察静息或活化状态下的HSC中ICAM-1表达.
, http://www.100md.com
结果 静息的HSC不表达ICAM-1，而活化的HSC表达ICAM-1，且随着培养时间的延长ICAM-1表达量逐渐增加. 结论 ICAM-1表达与HSC活化及肝纤维化的发生有关.
主题词 肝/细胞学；星形细胞；血管细胞粘附分子1/分析；肝硬化/病因学
陆伦根, 曾民德, 李继强, 邱德凯, 华静, 范竹萍.肝星状细胞激活与ICAM1的表达.华人消化杂志,1998;6(7):567-569
0 引言
大量证据显示，肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)与肝纤维化关系密切，而HSC的活化与增殖，除了形态及数量变化外，还有许多其他生物学特性及功能的改变. 细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)是目前研究较深入和较引人注目的一种细胞粘附分子，它为一种单链糖蛋白，其在细胞表面表达量的增加与多种疾病的发生有关[1]. 我们观察了大鼠HSC不同状态中ICAM-1的表达，以探讨HSC的活化与ICAM-1表达的关系.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 Wistar雄性大鼠，体重400g～450g，购自中国科学院上海实验动物中心. 普通饲料喂养，自由进食. Nycodenz为Sigma产品，pronase E为Merck产品，DMEM培养基为Gibco公司产品，胶原酶粗制品为上海医药工业研究院产品，鼠抗ICAM-1购自深圳晶美公司(为Pharmingen公司生产)，SP免疫组化试剂购自福州迈新公司.
1.2 方法
1.2.1 HSC的分离 按文献[2]并加以改进. 大鼠经15g/L戊巴比妥钠ip麻醉后，门静脉插管输入无Ca2+灌注液，同时剪断下腔静脉放血，灌注30min后，小心分离肝脏，待肝组织软化后，剪碎，酶消化振荡30min过200目网后，滤液离心450g 7min，弃上清，沉淀物以1∶2的体积与180g/L Nycodenz混匀，上覆少许DMEM培养液，行密度梯度离心，1450g，17min，离心后取界面处细胞，用DMEM清洗1次，450g 7min，取沉淀细胞悬浮于含200mL/L小牛血清的DMEM中. 台盼蓝染色判断存活率并计算产率.
, 百拇医药
1.2.2 HSC培养 细胞以1×105/cm2接种于培养皿(Coring)，置50mL/L CO2，950mL/L空气培养箱中37℃，24h细胞贴壁后换液，以后隔3d～4d更换1次培养液.
1.2.3 HSC鉴定 新分离的HSC悬液点涂片，置于荧光显微镜328nm波长紫外光照射下，细胞呈现蓝绿色自发荧光. 兔抗人desmin爬片作SP免疫组化染色示胞质阳染者为HSC.
1.2.4 ICAM-1免疫组化染色 新分离的HSC涂片，原代培养10d和传代培养7d的细胞爬片取出，PBS冲洗，中性福尔马林固定后，过氧化酶阻断液阻断内源性过氧化物酶，正常血清封闭，滴加1∶100鼠抗ICAM-1，4℃过夜，次日加生物素标记的第二抗体及链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，DAB显色，苏木素复染后封片观察. 每次实验均设阴性对照，以PBS代替一抗，结果显示阴性.
, 百拇医药
2 结果
2.1 HSC的得率和纯度 用本法分离的HSC，其得率为5×106～1×107/肝，以4g/L台盼蓝染色，细胞存活率在98%以上. SP免疫组化显示，原代培养的HSC的desmin阳性在90%以上，传代培养后HSC的desmin阳性在98%以上.
2.2 HSC的形态 初分离得到的HSC在相差显微镜下为折光很强的圆球，远小于肝细胞，约24h后，细胞贴壁呈扁圆形，胞浆内可见较多的脂滴，少量细胞已开始伸展，48h后大部分细胞伸展生长，一部分细胞已呈现多角伪足，星状外形的典型形态. 从接种细胞至生长单层约需10d～14d，传代后细胞胞质中脂滴减少，细胞生长加快，约7d后又可长成单层.
, 百拇医药
2.3 HSC中ICAM-1的表达 新分离的HSC涂片HSC未表达ICAM-1(图1)，而原代培养10d的HSC细胞爬片可见ICAM-1阳性表达，阳性表达产物可见于胞质或胞膜，传代培养7d的HSC细胞爬片ICAM-1表达强度明显增加，较原代培养细胞明显增多(图2，3).
图1 新分离的HSC涂片，HSC未表达ICAM-1 SP免疫组化×300
图2 原代培养10d的HSC细胞爬片可见ICAM-1阳性表达，阳性表达产物可见于胞质或胞膜 SP免疫组化×270
图3 传代培养7d的HSC细胞爬片，ICAM-1表达强度明显增加，阳性表达产物可见于胞质或胞膜 SP免疫组化×270
, 百拇医药
3 讨论
肝窦内HSC与肝纤维化的关系日益引起人们的关注. 现已证实，HSC是肝纤维化细胞外基质(ECM)产生的主要细胞，在肝脏中兼具肌细胞，成纤维细胞及脂肪细胞特性的间质细胞. 由于其在肝纤维化发生发展中的独特作用. HSC细胞已成为肝纤维化细胞学研究的热点，既往由于受细胞分离培养技术的限制，故常局限于肝脏原位组织化学和形态学的研究. 近来，随着HSC分离等技术的成熟和发展，HSC的功能和特性越来越多的被了解. ICAM-1为免疫球蛋白超家族的一种粘附分子，其配体是淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)(CD11A/C/5]D18)和巨噬细胞抗原复合体-1(MAC-1)(CD11B/CD18)[3]，属于整合素家族成员，能表达于淋巴细胞及中性粒细胞等表面，在炎症反应中，ICAM-1是细胞与细胞接触过程中起中心作用的一种细胞粘附分子，而炎症细胞表面的LFA-1，MAC-1与靶细胞膜上的ICAM-1结合是不可缺少的过程.
, 百拇医药
许多学者从组织学证实在酒精性肝病[4]，病毒性肝炎[5]，自身免疫性肝病及肝纤维化肝硬变等[6,7]病变时，不管其病因如何，肝细胞，窦周细胞及胆管上皮细胞ICAM-1表达均明显增加，炎症细胞通过ICAM-1/LFA-1或ICAM-1/MAC-1结合而介导肝细胞和窦周细胞损伤. 我们对分离的HSC培养观察到新分离的HSC(静息的HSC)不表达ICAM-1，而原代培养10d或传代的HSC(活化的HSC)表达ICAM-1，且随着培养时间增加ICAM-1表达也增加. Hellerbrand et al[8]研究也证实，静息的HSC不表达ICAM-1，而活化的HSC ICAM-1基因及其表达产物均增加，这些结果均表明活化的HSC表达ICAM-1是其固有的生物学特性之一，这不但有助于从生物学特性上与静息的HSC相区别，而且由此阐述了活化的HSC在参与肝纤维化发病机制中发挥其细胞与细胞，细胞与ECM相互作用的关系.
, 百拇医药
4 参考文献
1 陆伦根，曾民德. 免疫球蛋白超家族细胞粘附分子在慢性肝病中的作用. 中华肝脏病杂志，1998；6(2)：126-128
2 Knittel T, Fellmer P, Ramadori G.Gene expression and regulation of plasminogen activator inhibition type 1 in hepatic stellatte cells
of rat liver. Gastroenterology, 1996;111(3):745-754
3 Vainer B. Role of cell adhesion molecules in inflammatory bowel diseases. Scand J Gastroenterol,1997;32(5):401-410
, 百拇医药
4 Nanji AA, Griniuviene B, Yacoub LK, Fogt F, Tahan SR. Intercel lular adhesion molecule-1 expression in experimental alcoholic
liver diseases: relationship to endotoxemia and TNFα messenger RNA. Exp Mol Pathol,1995;62(1):42-51
5 Horiike N, Onji M, Kumon I, Kanaoka M, Michitaka K, Ohta Y. Intercellular adhesion molecule1 expression on the
hepatocyte membrance of patients with chronic hepatitis B and C. Liver,1993;13(1):10-14
, 百拇医药
6 陆伦根，曾民德，范建高，李继强，刘颐，任卫平. et al. 实验性肝纤维化组织中细胞间粘附分子1表达的研究.
胃肠病学，1997；2(4)：203-205
7 Nakanuma Y, Yasoshima M, Tsuneyama K, Harada K. Histopathology of primary biliary cirrhosis with emphasis on expression of
adhesion molecules. Semin Liver Dis,1997;17(1):35-37
8 Hellerbrand C, Wang SC, Tsukamoto H, Brenner DA, Rippe RA. Expression of intercellular adhesion molecule-1 by activated
hepatic stelleate cells. Hepatology, 1996;24(3)：670-676, 百拇医药(陆伦根 曾民德 李继强 邱德凯 华静 范竹萍)
陆伦根，男，1965-11-09生，江苏扬州市人，汉族. 1987年扬州大学医学院医学系本科毕业，1990年南京医科大学获硕士学位，讲师，在读消化内科博士，发表论文20篇.
*国家自然科学基金资助项目，No. 39670339.
项目负责人 陆伦根，200001，上海第二医科大学附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所，上海市山东中路145号.
*Project supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39670339.
, http://www.100md.com
Correspondence to Lun-Gen Lu, Shanghai Institute of Digestive Diseases, Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, 145 Shandong Zhongliu, Shanghai 200001, China
Tel. +86·21·63260930-2134
收稿日期 1997-03-08
Expression of intercellular adhesion molecule-1 by activated hepatic stellate cells*
Lun-Gen Lu, Min-De Zeng, Ji-Qiang Li, De-Kai Qiu, Jing Hua and Zhu-Ping Fan
, 百拇医药
Shanghai Institute of Digestive Diseases, Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001, China
Abstract
AIM To explore the relationship between activation of hepatic stellate cells (HSC) and expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1).
METHODS HSCs were isolated and cultured from liver of Wistar rats by in situ perfusion with pronase and collagenase and density gradient centrifugation with Nycodenz. Expression of ICAM-1 in a quiescent and an activated HSC was detected by immunohistochemistry assay.
, 百拇医药
RESULTS Expression of ICAM-1 was not observed in the quiescent HSC, but seen in the activated, and the amount of the expression was increasing with the time of culture.
CONCLUSION Expression of ICAM-1 is related to activation of HSC and liver fibrosis.
Subject headings liver/cytology; astrocytes; vascular cell adhesion; molec /analysis; liver cirrhosis/etiology
, 百拇医药
Lu LG, Zeng MD, Li JQ, Qiu DK, Hua J, Fan ZP. Expression of interc ellular adhesion molecule1 by activated hepatic stellate cells. Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(7):567-569
摘要
目的 探讨肝星状细胞(HSC)的活化与细胞间粘附分子1(ICAM-1)表达的关系.
方法 用链酶蛋白酶和胶原酶原位灌流，Nycodenz密度梯度离心分离大鼠HSC，并进行体外培养，应用免疫组织化学方法观察静息或活化状态下的HSC中ICAM-1表达.
, http://www.100md.com
结果 静息的HSC不表达ICAM-1，而活化的HSC表达ICAM-1，且随着培养时间的延长ICAM-1表达量逐渐增加. 结论 ICAM-1表达与HSC活化及肝纤维化的发生有关.
主题词 肝/细胞学；星形细胞；血管细胞粘附分子1/分析；肝硬化/病因学
陆伦根, 曾民德, 李继强, 邱德凯, 华静, 范竹萍.肝星状细胞激活与ICAM1的表达.华人消化杂志,1998;6(7):567-569
0 引言
大量证据显示，肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)与肝纤维化关系密切，而HSC的活化与增殖，除了形态及数量变化外，还有许多其他生物学特性及功能的改变. 细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)是目前研究较深入和较引人注目的一种细胞粘附分子，它为一种单链糖蛋白，其在细胞表面表达量的增加与多种疾病的发生有关[1]. 我们观察了大鼠HSC不同状态中ICAM-1的表达，以探讨HSC的活化与ICAM-1表达的关系.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 Wistar雄性大鼠，体重400g～450g，购自中国科学院上海实验动物中心. 普通饲料喂养，自由进食. Nycodenz为Sigma产品，pronase E为Merck产品，DMEM培养基为Gibco公司产品，胶原酶粗制品为上海医药工业研究院产品，鼠抗ICAM-1购自深圳晶美公司(为Pharmingen公司生产)，SP免疫组化试剂购自福州迈新公司.
1.2 方法
1.2.1 HSC的分离 按文献[2]并加以改进. 大鼠经15g/L戊巴比妥钠ip麻醉后，门静脉插管输入无Ca2+灌注液，同时剪断下腔静脉放血，灌注30min后，小心分离肝脏，待肝组织软化后，剪碎，酶消化振荡30min过200目网后，滤液离心450g 7min，弃上清，沉淀物以1∶2的体积与180g/L Nycodenz混匀，上覆少许DMEM培养液，行密度梯度离心，1450g，17min，离心后取界面处细胞，用DMEM清洗1次，450g 7min，取沉淀细胞悬浮于含200mL/L小牛血清的DMEM中. 台盼蓝染色判断存活率并计算产率.
, 百拇医药
1.2.2 HSC培养 细胞以1×105/cm2接种于培养皿(Coring)，置50mL/L CO2，950mL/L空气培养箱中37℃，24h细胞贴壁后换液，以后隔3d～4d更换1次培养液.
1.2.3 HSC鉴定 新分离的HSC悬液点涂片，置于荧光显微镜328nm波长紫外光照射下，细胞呈现蓝绿色自发荧光. 兔抗人desmin爬片作SP免疫组化染色示胞质阳染者为HSC.
1.2.4 ICAM-1免疫组化染色 新分离的HSC涂片，原代培养10d和传代培养7d的细胞爬片取出，PBS冲洗，中性福尔马林固定后，过氧化酶阻断液阻断内源性过氧化物酶，正常血清封闭，滴加1∶100鼠抗ICAM-1，4℃过夜，次日加生物素标记的第二抗体及链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，DAB显色，苏木素复染后封片观察. 每次实验均设阴性对照，以PBS代替一抗，结果显示阴性.
, 百拇医药
2 结果
2.1 HSC的得率和纯度 用本法分离的HSC，其得率为5×106～1×107/肝，以4g/L台盼蓝染色，细胞存活率在98%以上. SP免疫组化显示，原代培养的HSC的desmin阳性在90%以上，传代培养后HSC的desmin阳性在98%以上.
2.2 HSC的形态 初分离得到的HSC在相差显微镜下为折光很强的圆球，远小于肝细胞，约24h后，细胞贴壁呈扁圆形，胞浆内可见较多的脂滴，少量细胞已开始伸展，48h后大部分细胞伸展生长，一部分细胞已呈现多角伪足，星状外形的典型形态. 从接种细胞至生长单层约需10d～14d，传代后细胞胞质中脂滴减少，细胞生长加快，约7d后又可长成单层.
, 百拇医药
2.3 HSC中ICAM-1的表达 新分离的HSC涂片HSC未表达ICAM-1(图1)，而原代培养10d的HSC细胞爬片可见ICAM-1阳性表达，阳性表达产物可见于胞质或胞膜，传代培养7d的HSC细胞爬片ICAM-1表达强度明显增加，较原代培养细胞明显增多(图2，3).
图1 新分离的HSC涂片，HSC未表达ICAM-1 SP免疫组化×300
图2 原代培养10d的HSC细胞爬片可见ICAM-1阳性表达，阳性表达产物可见于胞质或胞膜 SP免疫组化×270
图3 传代培养7d的HSC细胞爬片，ICAM-1表达强度明显增加，阳性表达产物可见于胞质或胞膜 SP免疫组化×270
, 百拇医药
3 讨论
肝窦内HSC与肝纤维化的关系日益引起人们的关注. 现已证实，HSC是肝纤维化细胞外基质(ECM)产生的主要细胞，在肝脏中兼具肌细胞，成纤维细胞及脂肪细胞特性的间质细胞. 由于其在肝纤维化发生发展中的独特作用. HSC细胞已成为肝纤维化细胞学研究的热点，既往由于受细胞分离培养技术的限制，故常局限于肝脏原位组织化学和形态学的研究. 近来，随着HSC分离等技术的成熟和发展，HSC的功能和特性越来越多的被了解. ICAM-1为免疫球蛋白超家族的一种粘附分子，其配体是淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)(CD11A/C/5]D18)和巨噬细胞抗原复合体-1(MAC-1)(CD11B/CD18)[3]，属于整合素家族成员，能表达于淋巴细胞及中性粒细胞等表面，在炎症反应中，ICAM-1是细胞与细胞接触过程中起中心作用的一种细胞粘附分子，而炎症细胞表面的LFA-1，MAC-1与靶细胞膜上的ICAM-1结合是不可缺少的过程.
, 百拇医药
许多学者从组织学证实在酒精性肝病[4]，病毒性肝炎[5]，自身免疫性肝病及肝纤维化肝硬变等[6,7]病变时，不管其病因如何，肝细胞，窦周细胞及胆管上皮细胞ICAM-1表达均明显增加，炎症细胞通过ICAM-1/LFA-1或ICAM-1/MAC-1结合而介导肝细胞和窦周细胞损伤. 我们对分离的HSC培养观察到新分离的HSC(静息的HSC)不表达ICAM-1，而原代培养10d或传代的HSC(活化的HSC)表达ICAM-1，且随着培养时间增加ICAM-1表达也增加. Hellerbrand et al[8]研究也证实，静息的HSC不表达ICAM-1，而活化的HSC ICAM-1基因及其表达产物均增加，这些结果均表明活化的HSC表达ICAM-1是其固有的生物学特性之一，这不但有助于从生物学特性上与静息的HSC相区别，而且由此阐述了活化的HSC在参与肝纤维化发病机制中发挥其细胞与细胞，细胞与ECM相互作用的关系.
, 百拇医药
4 参考文献
1 陆伦根，曾民德. 免疫球蛋白超家族细胞粘附分子在慢性肝病中的作用. 中华肝脏病杂志，1998；6(2)：126-128
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, 百拇医药
4 Nanji AA, Griniuviene B, Yacoub LK, Fogt F, Tahan SR. Intercel lular adhesion molecule-1 expression in experimental alcoholic
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5 Horiike N, Onji M, Kumon I, Kanaoka M, Michitaka K, Ohta Y. Intercellular adhesion molecule1 expression on the
hepatocyte membrance of patients with chronic hepatitis B and C. Liver,1993;13(1):10-14
, 百拇医药
6 陆伦根，曾民德，范建高，李继强，刘颐，任卫平. et al. 实验性肝纤维化组织中细胞间粘附分子1表达的研究.
胃肠病学，1997；2(4)：203-205
7 Nakanuma Y, Yasoshima M, Tsuneyama K, Harada K. Histopathology of primary biliary cirrhosis with emphasis on expression of
adhesion molecules. Semin Liver Dis,1997;17(1):35-37
8 Hellerbrand C, Wang SC, Tsukamoto H, Brenner DA, Rippe RA. Expression of intercellular adhesion molecule-1 by activated
hepatic stelleate cells. Hepatology, 1996;24(3)：670-676, 百拇医药(陆伦根 曾民德 李继强 邱德凯 华静 范竹萍)