人胃癌细胞端粒酶的亲和纯化
中国人民解放军第三军医大学西南医院消化内科 重庆市 400038
本课题受中国博士后科学基金和中国人民解放军总后勤部博士后科学基金资助，中博基[1998]6号.
项目负责人 陈兵中国人民解放军第三军医大学西南医院消化内科 重庆市 400038
收稿日期 1999-07-14
Subject headings telomerase; ribonucleoprotein; affinity purification; gastric neoplasm
主题词 端粒酶；核糖核蛋白；亲和纯化；胃肿瘤
尽管已意识到端粒酶可能是目前已知特异性最好的肿瘤标志，但端粒酶的临床应用迄今未能得以普及推广，其原因之一是人端粒酶的蛋白组份仍不十分清楚. 为此，我们利用端粒酶核糖核蛋白的特性，尝试建立一种亲和纯化人端粒酶的手段，以期获得具有完整活性的亲和纯人胃癌端粒酶并推动端粒酶结构及应用性研究的深入.
1 材料和方法
酶切鉴定人端粒酶RNA(hTR)质粒(美国Villeponteau博士惠赠)，所切下的hTRcDNA片段用生物素标记后与链霉亲和素琼脂糖珠(Sigma)偶连，用高端粒酶活性的胃肿瘤细胞SGC7901提取液与之反应，利用端粒酶核糖核蛋白的特性，形成链霉亲和素琼脂糖珠-生物素标记hTRcDNA-hTR-端粒酶蛋白组份复合物，核酸解离液洗脱后获得亲和纯人端粒酶. 其活性用宝灵曼公司端粒酶试剂盒检测，定量利用Beckman DU-600检测仪进行.
2 结果
①酶切鉴定的结果与hTR质粒图谱吻合. ②将获得的32.23μg生物素hTRcDNA片段与1mL链霉亲和素琼脂糖珠偶连，收集液核酸量为0.52μg，偶连量为31.7μg，偶连率为98.4%. 说明端粒酶亲和琼脂糖珠上偶连的核酸片段正确且偶连方案可行. ③细胞提取液与端粒酶亲和琼脂糖珠孵育后流洗液的端粒酶活性显著低于细胞提取液和解离液(P<0.01)，而其蛋白含量与细胞提取液接近且与解离液差别悬殊，提示细胞提取液中的多数端粒酶已结合到端粒酶亲和琼脂糖珠上. 细胞提取液和解离液(含纯化的端粒酶)在蛋白浓度上同样差别悬殊，但端粒酶活性无显著差异(P>0.05)，据此计得相对纯化度为108.464. 说明端粒酶得到纯化且活性保持良好.
3 讨论
本研究中建立的方法是一种可行的端粒酶纯化手段，所获得的人胃癌细胞端粒酶可用于制备端粒酶单克隆抗体或端粒酶蛋白组份的结构性研究., 百拇医药(陈 兵 刘为纹 房殿春 徐采朴 杨仕明 杨金亮 鲁 容 罗元辉)
本课题受中国博士后科学基金和中国人民解放军总后勤部博士后科学基金资助，中博基[1998]6号.
项目负责人 陈兵中国人民解放军第三军医大学西南医院消化内科 重庆市 400038
收稿日期 1999-07-14
Subject headings telomerase; ribonucleoprotein; affinity purification; gastric neoplasm
主题词 端粒酶；核糖核蛋白；亲和纯化；胃肿瘤
尽管已意识到端粒酶可能是目前已知特异性最好的肿瘤标志，但端粒酶的临床应用迄今未能得以普及推广，其原因之一是人端粒酶的蛋白组份仍不十分清楚. 为此，我们利用端粒酶核糖核蛋白的特性，尝试建立一种亲和纯化人端粒酶的手段，以期获得具有完整活性的亲和纯人胃癌端粒酶并推动端粒酶结构及应用性研究的深入.
1 材料和方法
酶切鉴定人端粒酶RNA(hTR)质粒(美国Villeponteau博士惠赠)，所切下的hTRcDNA片段用生物素标记后与链霉亲和素琼脂糖珠(Sigma)偶连，用高端粒酶活性的胃肿瘤细胞SGC7901提取液与之反应，利用端粒酶核糖核蛋白的特性，形成链霉亲和素琼脂糖珠-生物素标记hTRcDNA-hTR-端粒酶蛋白组份复合物，核酸解离液洗脱后获得亲和纯人端粒酶. 其活性用宝灵曼公司端粒酶试剂盒检测，定量利用Beckman DU-600检测仪进行.
2 结果
①酶切鉴定的结果与hTR质粒图谱吻合. ②将获得的32.23μg生物素hTRcDNA片段与1mL链霉亲和素琼脂糖珠偶连，收集液核酸量为0.52μg，偶连量为31.7μg，偶连率为98.4%. 说明端粒酶亲和琼脂糖珠上偶连的核酸片段正确且偶连方案可行. ③细胞提取液与端粒酶亲和琼脂糖珠孵育后流洗液的端粒酶活性显著低于细胞提取液和解离液(P<0.01)，而其蛋白含量与细胞提取液接近且与解离液差别悬殊，提示细胞提取液中的多数端粒酶已结合到端粒酶亲和琼脂糖珠上. 细胞提取液和解离液(含纯化的端粒酶)在蛋白浓度上同样差别悬殊，但端粒酶活性无显著差异(P>0.05)，据此计得相对纯化度为108.464. 说明端粒酶得到纯化且活性保持良好.
3 讨论
本研究中建立的方法是一种可行的端粒酶纯化手段，所获得的人胃癌细胞端粒酶可用于制备端粒酶单克隆抗体或端粒酶蛋白组份的结构性研究., 百拇医药(陈 兵 刘为纹 房殿春 徐采朴 杨仕明 杨金亮 鲁 容 罗元辉)