大鼠胃壁细胞的分离方法
广州中医药大学脾胃研究所 广东省广州市 510405
广东省自然科学基金资助，No.980640
项目负责人 聂克广州中医药大学脾胃研究所 广东省广州市 510405
Tel. +86·20·86591233 Ext. 2453
Email. pwdq@ihw.com.cn
收稿日期 1999-07-23
Subject headings Pronase; gastric parietal cells; rat, cell isolation
, 百拇医药
主题词 链霉蛋白酶；胃壁细胞；大鼠；细胞分离
胃粘膜的壁细胞属于高度特异的终末分化细胞[1]，主要功能是分泌胃酸，以便为壁细胞研究提供理想的实验工具，为临床治疗胃肠道疾病提供新的途径和方法[2-5]. 大鼠比兔、狗等动物价廉易得，而且用整体大鼠做胃溃疡模型、进行泌酸实验与其他动物相比也是最多的. 直到目前大鼠胃壁细胞的分离方法国内尚未见报道. 不同种属动物胃壁细胞分离的总的原则虽然一致，但是具体操作方法可因动物种属不同而不同. 比如所用消化酶的种类、消化方式、消化时间等可有较大差异. 对此我们进行了实践，现报道如下.
1 材料和方法
1.1 材料 HZS水浴振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发发展有限公司；JB-3型磁力搅拌器，上海雷磁仪器厂新泾分厂；LDZ5-2离心机，北京医用离心机厂；XDS-1倒置生物学显微镜，重庆光学仪器厂；Pronase(链霉蛋白酶)，Boehringer Mannheim；BSA,Amresco，华美生物工程公司分装；EDTA(乙二胺四乙酸)，批号890903，汕头市约脸В籋EPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N＇-2-ethanesulfonic acid，羟乙基哌嗪乙磺酸),Amresco，上海生工生物工程公司分装；DTT(Dithiothreitol,二硫苏糖醇)，Amresco,华美生物工程公司分装；Percoll,Pharmacia;
, 百拇医药
Medium A(MA):NaH2PO4,0.5mmol/L，Na2HPO4，1mmol/L，NaHCO3，20mmol/L，NaCl，80mmol/L，KCl，5mmol/L，HEPES，50mmol/L，glucose, 11mmol/L，BSA，20g/L，EDTA，2mmol/L，pH 7.4；Medium B(MB):
NaH2PO4，0.5mmol/L，Na2HPO4，1mmol/L，NaHCO3，20mmol/L，NaCl，80mmol/L，KCl，5mmol/L，HEPES，50mmol/L，glucose,11mmol/L，BSA，10g/L，CaCl2，1mmol/L，MgCl2，1.5mmol/L，pH 7.4；Medium C(MC):
, 百拇医药
NaH2PO4，0.5mmol/L，Na2HPO4，1mmol/L，NaHCO3，20mmol/L，NaCl，80mmol/L，KCl，5mmol/L，HEPES，50mmol/L，glucose，11mmol/L，BSA,1g/L，CaCl2，1mmol/L，MgCl2，1.5mmol/L，DTT，1mmol/L， pH 7.4；MAP消化酶：Pronase溶于MA，1g/L，临用前配制.
1.2 方法 根据Lewin[6]的方法略加修改. 非禁食SD ♂大鼠，210g～250g，脱颈椎处死，剖腹，在贲门和胃体部、胃体和胃窦部分别结扎，将胃取出，弃去胃窦，在胃底做一小切口，用一玻璃棒将胃翻转，在胃底和胃体之间结扎，弃去胃底. 用生理盐水清洗掉食物碎屑和血迹，用纸巾将胃粘液擦干. 用注射器将消化酶注入胃袋，每胃2.5mL. 将胃袋放入MA 50mL～150mL(根据胃袋多少)，37℃水浴消化90min，水浴振荡速度150次/min. 在30min和60min换一次新鲜的MA. 整个过程MA皆充以950mL/L O2+ 50mL/L CO2. 消化结束后，将胃袋放入MB，在室温下用磁力搅拌器轻轻搅拌60min，打下的细胞每10min收集1次，过200目筛，1000r/min离心5min，沉淀用MC洗2次，每次900r/min离心5min. 最后沉淀用MC悬浮，此为混合细胞悬液. 综合Agnihotri[7]和Mardh的方法，用Percoll作梯度递质富集壁细胞. 在试管中将400g/L～600g/L percoll用密度梯度混合器成线性密度梯度，将混合细胞悬液铺在Percoll上面，1500r/min离心15min. 离心后可见细胞分层形成较明显的条带，最上面淡淡的一层为胀破和破损的死细胞，其中夹杂着少量个头较大的壁细胞；最下面一层主要为主细胞，并夹杂着少量小的壁细胞；中间一层则以壁细胞为主. 用吸管小心地将中间一层吸出，用MC洗两次以洗去Percoll(900r/min离心5min)，沉淀用MC悬浮，此为纯化后的壁细胞悬液.
, 百拇医药
壁细胞鉴定 ①形态：壁细胞形态较大，核多居中央，线粒体丰富. HE染色，光镜下可见核染成蓝色，胞质粉红色. ②活率：1g/L Trypan blue染色，死细胞染成蓝色，活细胞不着色. ③细胞计数：将细胞悬液小心地滴入血细胞计数盘内，按白细胞计数方法，数四大方格内细胞数之和为N，则每升细胞数为：cells/L=N×2.5×106
2 结果
壁细胞纯度：在Percoll分离前的胃粘膜细胞中，壁细胞约占30%左右. Percoll分离后，壁细胞纯度可达65%～75%. 壁细胞浓度可达到1×1010/L. 台盼蓝排除法测得细胞活率为92%～95%.
3 讨论
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由于壁细胞功能的调节是神经调节和体液调节综合作用的结果，在器官和组织水平很难研究单一因素对壁细胞功能的影响，因而建立离体壁细胞研究模型十分必要. 用酶消化法游离细胞常用胶原酶(collagenase)、链霉蛋白酶(Pronase)、胰蛋白酶(trypsin)等. 开始我们曾参照Scott et al[8]方法将鼠胃剖开后直接暴露于trypsin消化液进行消化，然后将胃粘膜刮下，再用DNase(脱氧核糖核酸酶)分散细胞，但是所得的细胞很不理想，细胞碎片很多. 这可能是由于trypsin不易洗脱，可以牢牢地附着在细胞表面，至少在24h内不失去活性，从而继续消化蛋白，造成细胞的严重损伤. 虽然后来我们加入了蛋白酶抑制剂牛血清，但效果仍不理想. 后来我们参照Lewin et al[6]的方法，选用pronase作为消化酶，取得了较满意的效果. Lewin方法的特点是制备翻转的胃袋，使浆膜层朝里，粘膜层向外，pronase注入胃袋后被局限于浆膜层，这样，不但可以允许使用较高浓度的酶，使细胞快速从胃粘膜游离出来；而且由于胃粘膜不与酶直接接触，可以减轻粘膜细胞的损伤；胃袋处于孵育液中，还可以保证胃粘膜细胞有充足的供氧. 此外,Agnihetri et al[7]报道将pronase和collagenase联合应用，成功地分离了猪和大鼠的胃壁细胞.
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为了提高细胞分离效果，螯合剂EDTA，EGTA常与酶消化法联合使用. 需要注意的是，联合使用时应考虑到酶的离子需要. 例如，胶原酶需要Ca2+，可被Ca2+活化，被螯合剂抑制，所以胶原酶与EDTA联用时应分步进行. 而EDTA对pronase影响不大，二者可加在一起同步进行，这样，既加强了消化细胞的力量又缩短了消化时间，所以我们在胃袋内的消化液MAP和胃袋外的孵育液MA中均含有EDTA，分离效果也较为理想. 总之，游离细胞的具体方法应视具体分离对象而定，不能机械照搬，更何况还要考虑到自己实验室的条件.消化酶和EDTA对细胞均有损害作用，长时间高浓度必然会影响细胞的结构和活力，因此， 在保证较完全游离细胞的情况下，尽可能使用最低浓度的酶，将消化时间缩至最短. 我们根据自己实验室的条件，利用线性密度梯度离心法得到了较高纯度的壁细胞. 该方法简单易行，不需要特殊设备，所得壁细胞可以满足对壁细胞一般实验的要求.
4 参考文献
, 百拇医药
1 Chew CS. Parietal cell culture: new models and directions. Annu Rev Physiol, 1994;56:445-461
2 Kajita H, Kotera T, Shirakata Y. A maxi Cl-channel coupled to endothelin B receptors in the basolateral membrane of guinea-pig
parietal cells. J Physiol, 1995;488:65-75
3 Ding M, Kinoshita Y, Kishi K. Distribution of prostaglandin E receptors in the rat gastrointestinal tract. Prostaglandins,
, 百拇医药
1997;53:199-216
4 Schepp W, Dehne K, Herrmuth H. Identification and functional importance of IL-1 receptors on rat parietal cells.
Am J Physiol, 1998;275:G1094-G1105
5 李晓波，钱家鸣，陈元方. 壁细胞的淘洗分离与应用. 胃肠病学和肝病学杂志，1996；5：254-256
6 Lewin MJM, Cheret AM, Sachs G. Separation of Individual cells from the fundic gastric mucosa. In: Pretlowll TG, Pretloq TP. Eds.
, http://www.100md.com
Cell separation METHODS and selected applications. Vol.1. New York: Academic Press, 1982:223-226
7 Agnihotri N, Kaur U, Dhawan V, Dilawari JB. Extrahepatic portal hypertensive gastropathy in Wistar rats: modulation of acid secretion
in isolated parietal cells. Dig Dis Sci, 1998;43:56-66
8 Black EW, Strada SJ, Thompson WJ. Relationships of secretagogue-induced cAMP accumulation and acid secretion in elutriated
rat gastric parietal cell. J Pharma Method, 1988;20:57-78, 百拇医药(聂 克 王汝俊 王建华)
广东省自然科学基金资助，No.980640
项目负责人 聂克广州中医药大学脾胃研究所 广东省广州市 510405
Tel. +86·20·86591233 Ext. 2453
Email. pwdq@ihw.com.cn
收稿日期 1999-07-23
Subject headings Pronase; gastric parietal cells; rat, cell isolation
, 百拇医药
主题词 链霉蛋白酶；胃壁细胞；大鼠；细胞分离
胃粘膜的壁细胞属于高度特异的终末分化细胞[1]，主要功能是分泌胃酸，以便为壁细胞研究提供理想的实验工具，为临床治疗胃肠道疾病提供新的途径和方法[2-5]. 大鼠比兔、狗等动物价廉易得，而且用整体大鼠做胃溃疡模型、进行泌酸实验与其他动物相比也是最多的. 直到目前大鼠胃壁细胞的分离方法国内尚未见报道. 不同种属动物胃壁细胞分离的总的原则虽然一致，但是具体操作方法可因动物种属不同而不同. 比如所用消化酶的种类、消化方式、消化时间等可有较大差异. 对此我们进行了实践，现报道如下.
1 材料和方法
1.1 材料 HZS水浴振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发发展有限公司；JB-3型磁力搅拌器，上海雷磁仪器厂新泾分厂；LDZ5-2离心机，北京医用离心机厂；XDS-1倒置生物学显微镜，重庆光学仪器厂；Pronase(链霉蛋白酶)，Boehringer Mannheim；BSA,Amresco，华美生物工程公司分装；EDTA(乙二胺四乙酸)，批号890903，汕头市约脸В籋EPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N＇-2-ethanesulfonic acid，羟乙基哌嗪乙磺酸),Amresco，上海生工生物工程公司分装；DTT(Dithiothreitol,二硫苏糖醇)，Amresco,华美生物工程公司分装；Percoll,Pharmacia;
, 百拇医药
Medium A(MA):NaH2PO4,0.5mmol/L，Na2HPO4，1mmol/L，NaHCO3，20mmol/L，NaCl，80mmol/L，KCl，5mmol/L，HEPES，50mmol/L，glucose, 11mmol/L，BSA，20g/L，EDTA，2mmol/L，pH 7.4；Medium B(MB):
NaH2PO4，0.5mmol/L，Na2HPO4，1mmol/L，NaHCO3，20mmol/L，NaCl，80mmol/L，KCl，5mmol/L，HEPES，50mmol/L，glucose,11mmol/L，BSA，10g/L，CaCl2，1mmol/L，MgCl2，1.5mmol/L，pH 7.4；Medium C(MC):
, 百拇医药
NaH2PO4，0.5mmol/L，Na2HPO4，1mmol/L，NaHCO3，20mmol/L，NaCl，80mmol/L，KCl，5mmol/L，HEPES，50mmol/L，glucose，11mmol/L，BSA,1g/L，CaCl2，1mmol/L，MgCl2，1.5mmol/L，DTT，1mmol/L， pH 7.4；MAP消化酶：Pronase溶于MA，1g/L，临用前配制.
1.2 方法 根据Lewin[6]的方法略加修改. 非禁食SD ♂大鼠，210g～250g，脱颈椎处死，剖腹，在贲门和胃体部、胃体和胃窦部分别结扎，将胃取出，弃去胃窦，在胃底做一小切口，用一玻璃棒将胃翻转，在胃底和胃体之间结扎，弃去胃底. 用生理盐水清洗掉食物碎屑和血迹，用纸巾将胃粘液擦干. 用注射器将消化酶注入胃袋，每胃2.5mL. 将胃袋放入MA 50mL～150mL(根据胃袋多少)，37℃水浴消化90min，水浴振荡速度150次/min. 在30min和60min换一次新鲜的MA. 整个过程MA皆充以950mL/L O2+ 50mL/L CO2. 消化结束后，将胃袋放入MB，在室温下用磁力搅拌器轻轻搅拌60min，打下的细胞每10min收集1次，过200目筛，1000r/min离心5min，沉淀用MC洗2次，每次900r/min离心5min. 最后沉淀用MC悬浮，此为混合细胞悬液. 综合Agnihotri[7]和Mardh的方法，用Percoll作梯度递质富集壁细胞. 在试管中将400g/L～600g/L percoll用密度梯度混合器成线性密度梯度，将混合细胞悬液铺在Percoll上面，1500r/min离心15min. 离心后可见细胞分层形成较明显的条带，最上面淡淡的一层为胀破和破损的死细胞，其中夹杂着少量个头较大的壁细胞；最下面一层主要为主细胞，并夹杂着少量小的壁细胞；中间一层则以壁细胞为主. 用吸管小心地将中间一层吸出，用MC洗两次以洗去Percoll(900r/min离心5min)，沉淀用MC悬浮，此为纯化后的壁细胞悬液.
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壁细胞鉴定 ①形态：壁细胞形态较大，核多居中央，线粒体丰富. HE染色，光镜下可见核染成蓝色，胞质粉红色. ②活率：1g/L Trypan blue染色，死细胞染成蓝色，活细胞不着色. ③细胞计数：将细胞悬液小心地滴入血细胞计数盘内，按白细胞计数方法，数四大方格内细胞数之和为N，则每升细胞数为：cells/L=N×2.5×106
2 结果
壁细胞纯度：在Percoll分离前的胃粘膜细胞中，壁细胞约占30%左右. Percoll分离后，壁细胞纯度可达65%～75%. 壁细胞浓度可达到1×1010/L. 台盼蓝排除法测得细胞活率为92%～95%.
3 讨论
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由于壁细胞功能的调节是神经调节和体液调节综合作用的结果，在器官和组织水平很难研究单一因素对壁细胞功能的影响，因而建立离体壁细胞研究模型十分必要. 用酶消化法游离细胞常用胶原酶(collagenase)、链霉蛋白酶(Pronase)、胰蛋白酶(trypsin)等. 开始我们曾参照Scott et al[8]方法将鼠胃剖开后直接暴露于trypsin消化液进行消化，然后将胃粘膜刮下，再用DNase(脱氧核糖核酸酶)分散细胞，但是所得的细胞很不理想，细胞碎片很多. 这可能是由于trypsin不易洗脱，可以牢牢地附着在细胞表面，至少在24h内不失去活性，从而继续消化蛋白，造成细胞的严重损伤. 虽然后来我们加入了蛋白酶抑制剂牛血清，但效果仍不理想. 后来我们参照Lewin et al[6]的方法，选用pronase作为消化酶，取得了较满意的效果. Lewin方法的特点是制备翻转的胃袋，使浆膜层朝里，粘膜层向外，pronase注入胃袋后被局限于浆膜层，这样，不但可以允许使用较高浓度的酶，使细胞快速从胃粘膜游离出来；而且由于胃粘膜不与酶直接接触，可以减轻粘膜细胞的损伤；胃袋处于孵育液中，还可以保证胃粘膜细胞有充足的供氧. 此外,Agnihetri et al[7]报道将pronase和collagenase联合应用，成功地分离了猪和大鼠的胃壁细胞.
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为了提高细胞分离效果，螯合剂EDTA，EGTA常与酶消化法联合使用. 需要注意的是，联合使用时应考虑到酶的离子需要. 例如，胶原酶需要Ca2+，可被Ca2+活化，被螯合剂抑制，所以胶原酶与EDTA联用时应分步进行. 而EDTA对pronase影响不大，二者可加在一起同步进行，这样，既加强了消化细胞的力量又缩短了消化时间，所以我们在胃袋内的消化液MAP和胃袋外的孵育液MA中均含有EDTA，分离效果也较为理想. 总之，游离细胞的具体方法应视具体分离对象而定，不能机械照搬，更何况还要考虑到自己实验室的条件.消化酶和EDTA对细胞均有损害作用，长时间高浓度必然会影响细胞的结构和活力，因此， 在保证较完全游离细胞的情况下，尽可能使用最低浓度的酶，将消化时间缩至最短. 我们根据自己实验室的条件，利用线性密度梯度离心法得到了较高纯度的壁细胞. 该方法简单易行，不需要特殊设备，所得壁细胞可以满足对壁细胞一般实验的要求.
4 参考文献
, 百拇医药
1 Chew CS. Parietal cell culture: new models and directions. Annu Rev Physiol, 1994;56:445-461
2 Kajita H, Kotera T, Shirakata Y. A maxi Cl-channel coupled to endothelin B receptors in the basolateral membrane of guinea-pig
parietal cells. J Physiol, 1995;488:65-75
3 Ding M, Kinoshita Y, Kishi K. Distribution of prostaglandin E receptors in the rat gastrointestinal tract. Prostaglandins,
, 百拇医药
1997;53:199-216
4 Schepp W, Dehne K, Herrmuth H. Identification and functional importance of IL-1 receptors on rat parietal cells.
Am J Physiol, 1998;275:G1094-G1105
5 李晓波，钱家鸣，陈元方. 壁细胞的淘洗分离与应用. 胃肠病学和肝病学杂志，1996；5：254-256
6 Lewin MJM, Cheret AM, Sachs G. Separation of Individual cells from the fundic gastric mucosa. In: Pretlowll TG, Pretloq TP. Eds.
, http://www.100md.com
Cell separation METHODS and selected applications. Vol.1. New York: Academic Press, 1982:223-226
7 Agnihotri N, Kaur U, Dhawan V, Dilawari JB. Extrahepatic portal hypertensive gastropathy in Wistar rats: modulation of acid secretion
in isolated parietal cells. Dig Dis Sci, 1998;43:56-66
8 Black EW, Strada SJ, Thompson WJ. Relationships of secretagogue-induced cAMP accumulation and acid secretion in elutriated
rat gastric parietal cell. J Pharma Method, 1988;20:57-78, 百拇医药(聂 克 王汝俊 王建华)