浅表性胃炎胃粘膜生长抑素2型受体
1中国人民解放军北京军区总医院肿瘤科 北京市 100700
2中国人民解放军总医院消化科 北京市 100853
项目负责人 迟志宏中国人民解放军北京军区总医院肿瘤科 北京市 100700
收稿日期 1999-09-23 接收日期 1999-11-15
Subject headings gastric mucosa; gastritis; receptor, somatostatin 2/analysis
, 百拇医药 主题词 胃粘膜；胃炎；受体，生长抑素2型/分析
生长抑素及其类似物对正常细胞和肿瘤的生长增殖具有抑制作用[1-3]. 生长抑素的作用是通过与其受体结合而发挥的，其受体有5个亚型，其中2型受体与抑制细胞增殖的关系较为密切[4]，由于生长抑素作用的大小往往取决于组织所表达的受体数目[5]，因此测定胃组织中生长抑素2型受体(SSR2)的表达可以反映出生长抑素的作用情况. 我们的目的是建立测定胃粘膜组织SSR2的方法. 由于内镜活检组织较小，测定受体蛋白比较困难，所以，我们采用测定SSR2mRNA的方法，间接反映SSR2的水平.
1 材料和方法
1.1 材料 接受内镜检查的患者14例，男10例，女4例，年龄18岁～60岁，平均35岁±14岁. 内镜检查除外消化性溃疡，息肉，新生物及胃手术后改变病理检查均为浅表性胃炎. 均取内镜活检的新鲜胃窦粘膜组织标本. TRIZOL， M-MLV反转录酶，溴化乙锭等均为Gibco公司产品，OligodT, Taq酶为Promega公司产品，DEPC，RNAsin，dNTP购于华美公司. 引物：SSR2 sense: 5＇-CAT GGA CAT GGC GGA TGA G-3＇ antisense: 5＇-CTC AGATAC TGG TTT GGAG-3＇；beta-actin sense: 5＇-TCT CCT TAA TGT CAC GCA CGA-3＇ antisense: 5＇-ACA ATG AGC TGC GTG TGG CT-3＇. SSR2引物序列由陈原稼提供，赛百盛公司合成，扩增片段1107个碱基；beta-actin引物序列查自文献Biochem Biophys Res Commun 1994，201(2)：575，中国科学院微生物所合成，扩增片段368个碱基.
, 百拇医药
1.2 方法 所获组织标本迅速放入液氮中保存，然后放入1mL Trizol试剂中匀浆，按照TRIzol试剂说明书中的步骤提取组织总RNA，并用750mL/L乙醇冲洗. 所提的RNA用1g/L DEPC水溶解，测A(OD值)，计算RNA浓度. 取5μg的总RNA，加oligodT 10pmol，M-MLT反转录酶70U，以及dNTP，RNAsin，5×Buffer, DTT后，于37℃温浴1h，总反应体系25μL，之后煮沸5min终止反应. 取逆转录产物5μL，进行PCR扩增，所加试剂依次为30μmol/L SSR2引物2μL，12.5μmol/L beta-actin引物1μL，Mg2+2.5μL，10×Buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP，2μL，Taq酶 2.5U，石蜡油1滴，总反应体系50μL. 扩增参数：94℃预变性4min，94℃ 50s，55℃ 50s，72℃ 90s，35个循环，后延伸72℃ 4min. 取PCR产物15μL，于10g/L琼脂糖胶中电泳30min，利用计算机图象分析系统测定胶中SSR2及beta-actin的值，二者进行比较，换算出SSR2的值.
, http://www.100md.com
统计学处理 用SAS软件行F检验或t检验.
2 结果
14例SSR2的平均值为76±19. 女性SSR2的表达略高于男性，但由于例数少，无统计学差异(P>0.05). 18岁～30岁组SSR2的表达最低，31岁～50岁组最高，51岁～60岁组又略有下降 ，差异显著(表1).
表1 浅表性胃炎患者不同年龄SSR2的表达(X±s)
, 百拇医药
aP<0.05，vs 18岁～30岁， F=4.3335.
3 讨论
beta-actin是所有活细胞均含有的基因，在所有的活细胞中其含量大体相同，以此作为内参照，将其表达与SSR2的相比较，可去除操作过程中的人为误差，较准确地反应SSR2mRNA的水平. 因此，以beta-actin为内参照，采用RT-PCR技术建立检测SSR2的方法，不仅标本用量少，患者的痛苦小，而且操作比较简便，可以为进一步的研究提供方便.采用本方法操作时应迅速，避免污染，及时灭活反转录酶，根据扩增片段的长短相应增减退火和延伸时间由于beta-actin的表达非常丰富，应适当调整引物的浓度和剂量.
由于生长抑素对细胞和肿瘤的生长具有抑制作用，而这种作用主要是由SSR2介导的，因此SSR2的表达可作为防止组织癌变的一种保护因子. 已有实验发现，在人神经母细胞株转染SSR2后，其增生速度降低了3倍[6]. 本结果显示，用本方法测定的人胃粘膜SSR2的表达，女性略高于男性，虽然由于例数少，统计学比较差异不显著，但在某种意义上也可以部分地解释为何女性人群中胃癌的发生率低于男性. 在不同的年龄组段，SSR2表达的变化较大，在18岁～30岁组中SSR2的表达较少，31岁～50岁组中其表达最高，51岁～60岁组又略有下降，这就解释了为何胃癌患者发病年龄越小，其胃癌的恶性程度越高，而年龄越大，其病情进展越缓慢.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Bajetta E, Carnaghi C, Ferrari L. The role of somatostatin analogues in the treatment of gastroenteropancreatic endocrine
tumors. Digestion, 1996;57(Suppl 1):72-76
2 Radulovic S, Schally AV, Reile H. Inhibitory effects of antagonists of bombes in/gastrin releasing peptide (GRP) and
somatostatin analog (RC-160) on growth of HT-29 human colon cancers in nude mice. Acta Oncol, 1994;33:693-701
, http://www.100md.com
3 Cascinu S, Del-Ferro E, Catalano G. A randomised trial of octreotide vs best supportive care only in advanced
gastrointestinal cancer patients refractory to chemotherapy. Br J Cancer, 1995;71:97-101
4 Buscail L, Delesque N, Esteve JP. Stimulation of tyrosinephosphatase and inhibition of cell proliferation by somatostatin
analogues: mediation by human somatostatin receptor subtypes SSR1 and SSR2. Proc Natl Acad Sci USA,1994;91:2315-2319
5 Reubi JC, Heitz PU, Landolt AM. Hormone producing gastrointestinal tumors contain a high density of somatostatin receptors.
J Clin Endocrinol Metal, 1987;65:65-73
6 陈元方. 第10届国际胃肠激素会议简介. 中华消化杂志，1995；15：46-47, http://www.100md.com(迟志宏1 郑文尧2 梁 浩2 孙晓华2)
2中国人民解放军总医院消化科 北京市 100853
项目负责人 迟志宏中国人民解放军北京军区总医院肿瘤科 北京市 100700
收稿日期 1999-09-23 接收日期 1999-11-15
Subject headings gastric mucosa; gastritis; receptor, somatostatin 2/analysis
, 百拇医药 主题词 胃粘膜；胃炎；受体，生长抑素2型/分析
生长抑素及其类似物对正常细胞和肿瘤的生长增殖具有抑制作用[1-3]. 生长抑素的作用是通过与其受体结合而发挥的，其受体有5个亚型，其中2型受体与抑制细胞增殖的关系较为密切[4]，由于生长抑素作用的大小往往取决于组织所表达的受体数目[5]，因此测定胃组织中生长抑素2型受体(SSR2)的表达可以反映出生长抑素的作用情况. 我们的目的是建立测定胃粘膜组织SSR2的方法. 由于内镜活检组织较小，测定受体蛋白比较困难，所以，我们采用测定SSR2mRNA的方法，间接反映SSR2的水平.
1 材料和方法
1.1 材料 接受内镜检查的患者14例，男10例，女4例，年龄18岁～60岁，平均35岁±14岁. 内镜检查除外消化性溃疡，息肉，新生物及胃手术后改变病理检查均为浅表性胃炎. 均取内镜活检的新鲜胃窦粘膜组织标本. TRIZOL， M-MLV反转录酶，溴化乙锭等均为Gibco公司产品，OligodT, Taq酶为Promega公司产品，DEPC，RNAsin，dNTP购于华美公司. 引物：SSR2 sense: 5＇-CAT GGA CAT GGC GGA TGA G-3＇ antisense: 5＇-CTC AGATAC TGG TTT GGAG-3＇；beta-actin sense: 5＇-TCT CCT TAA TGT CAC GCA CGA-3＇ antisense: 5＇-ACA ATG AGC TGC GTG TGG CT-3＇. SSR2引物序列由陈原稼提供，赛百盛公司合成，扩增片段1107个碱基；beta-actin引物序列查自文献Biochem Biophys Res Commun 1994，201(2)：575，中国科学院微生物所合成，扩增片段368个碱基.
, 百拇医药
1.2 方法 所获组织标本迅速放入液氮中保存，然后放入1mL Trizol试剂中匀浆，按照TRIzol试剂说明书中的步骤提取组织总RNA，并用750mL/L乙醇冲洗. 所提的RNA用1g/L DEPC水溶解，测A(OD值)，计算RNA浓度. 取5μg的总RNA，加oligodT 10pmol，M-MLT反转录酶70U，以及dNTP，RNAsin，5×Buffer, DTT后，于37℃温浴1h，总反应体系25μL，之后煮沸5min终止反应. 取逆转录产物5μL，进行PCR扩增，所加试剂依次为30μmol/L SSR2引物2μL，12.5μmol/L beta-actin引物1μL，Mg2+2.5μL，10×Buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP，2μL，Taq酶 2.5U，石蜡油1滴，总反应体系50μL. 扩增参数：94℃预变性4min，94℃ 50s，55℃ 50s，72℃ 90s，35个循环，后延伸72℃ 4min. 取PCR产物15μL，于10g/L琼脂糖胶中电泳30min，利用计算机图象分析系统测定胶中SSR2及beta-actin的值，二者进行比较，换算出SSR2的值.
, http://www.100md.com
统计学处理 用SAS软件行F检验或t检验.
2 结果
14例SSR2的平均值为76±19. 女性SSR2的表达略高于男性，但由于例数少，无统计学差异(P>0.05). 18岁～30岁组SSR2的表达最低，31岁～50岁组最高，51岁～60岁组又略有下降 ，差异显著(表1).
表1 浅表性胃炎患者不同年龄SSR2的表达(X±s)
| 年龄/岁 | n | SSR2 |
| 18～30 | 7 | 64±10 |
| 31～50 | 4 | 91±25a |
| 51～60 | 3 | 83±9 |
, 百拇医药
aP<0.05，vs 18岁～30岁， F=4.3335.
3 讨论
beta-actin是所有活细胞均含有的基因，在所有的活细胞中其含量大体相同，以此作为内参照，将其表达与SSR2的相比较，可去除操作过程中的人为误差，较准确地反应SSR2mRNA的水平. 因此，以beta-actin为内参照，采用RT-PCR技术建立检测SSR2的方法，不仅标本用量少，患者的痛苦小，而且操作比较简便，可以为进一步的研究提供方便.采用本方法操作时应迅速，避免污染，及时灭活反转录酶，根据扩增片段的长短相应增减退火和延伸时间由于beta-actin的表达非常丰富，应适当调整引物的浓度和剂量.
由于生长抑素对细胞和肿瘤的生长具有抑制作用，而这种作用主要是由SSR2介导的，因此SSR2的表达可作为防止组织癌变的一种保护因子. 已有实验发现，在人神经母细胞株转染SSR2后，其增生速度降低了3倍[6]. 本结果显示，用本方法测定的人胃粘膜SSR2的表达，女性略高于男性，虽然由于例数少，统计学比较差异不显著，但在某种意义上也可以部分地解释为何女性人群中胃癌的发生率低于男性. 在不同的年龄组段，SSR2表达的变化较大，在18岁～30岁组中SSR2的表达较少，31岁～50岁组中其表达最高，51岁～60岁组又略有下降，这就解释了为何胃癌患者发病年龄越小，其胃癌的恶性程度越高，而年龄越大，其病情进展越缓慢.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Bajetta E, Carnaghi C, Ferrari L. The role of somatostatin analogues in the treatment of gastroenteropancreatic endocrine
tumors. Digestion, 1996;57(Suppl 1):72-76
2 Radulovic S, Schally AV, Reile H. Inhibitory effects of antagonists of bombes in/gastrin releasing peptide (GRP) and
somatostatin analog (RC-160) on growth of HT-29 human colon cancers in nude mice. Acta Oncol, 1994;33:693-701
, http://www.100md.com
3 Cascinu S, Del-Ferro E, Catalano G. A randomised trial of octreotide vs best supportive care only in advanced
gastrointestinal cancer patients refractory to chemotherapy. Br J Cancer, 1995;71:97-101
4 Buscail L, Delesque N, Esteve JP. Stimulation of tyrosinephosphatase and inhibition of cell proliferation by somatostatin
analogues: mediation by human somatostatin receptor subtypes SSR1 and SSR2. Proc Natl Acad Sci USA,1994;91:2315-2319
5 Reubi JC, Heitz PU, Landolt AM. Hormone producing gastrointestinal tumors contain a high density of somatostatin receptors.
J Clin Endocrinol Metal, 1987;65:65-73
6 陈元方. 第10届国际胃肠激素会议简介. 中华消化杂志，1995；15：46-47, http://www.100md.com(迟志宏1 郑文尧2 梁 浩2 孙晓华2)