丙型肝炎病毒HVR1抗血清体外阻断HCV的感染
中国人民解放军第三军医大学西南医院 1皮肤科
2全军传染病专科中心 重庆市 400038
宋志强，男，1972-02-19生，河南省上蔡县人，汉族. 1995年第三军医大学毕业，学士，1996年第三军医大学硕士，1999年第三军医大学博士，主要从事肝炎和自身免疫性疾病的发病机制和防治的研究，发表论著或综述12篇.
国家自然科学基金资助课题，No.39670672
项目负责人 宋志强，400038，重庆市，中国人民解放军第三军医大学西南医院皮肤科.
Supported by National Natural Scientific Foundation of China, No.39670672
Correspondence to Dr. Zhi-Qiang Song, Department of Dermatology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Tel. +86-23-68754217, Fax. +86-23-68754475
Email. Songzq@263.net, http://songzq.163.net
收稿日期 1999-09-28 接收日期 1999-11-25
Blocking effect of hyperimmune rabbit serum against MAP containing HVR1 sequences on HCV infection
Zhi-Qiang Song1, Fei Hao1, Yong-Gang Wang2, Feng Min2 and Yu-Ming Wang2
Department of Dermatology1, Center for Infectious Disease of Chinese PLA2, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Abstract
AIM To study whether hyperimmune rabbit serum against MAP containing HVR1 sequences could block in vitro infection of HCV.
METHODS The hyperimmune rabbit serum was mixed with the infectious serum of HCV according to a series of proportion and then the mixture was incubated for 2 hours at 37℃ or for 12 hours at 4℃. Then 7721 cells were incubated in the mixed sera. After incubation, the presence of HCV RNA and antigen in cells and/or supernatant was examined by RT-PCR, immunohistochemistry and in situ hybridization respectively.
RESULTS HCV RNA and NS3 antigen could be detected in 7721 cells and/or supernatant in all blocking groups after incubation.
CONCLUSION MAP and the hyperimmune serum against MAP can not block viral attachment or infection to cells.
Subject headings hepatitis C virus; cell model; multiple antigenic peptide; vaccine
Song ZQ,Hao F,Wang YG,Min F,Wang YM.Blocking effect of hyperimmune rabbit serum against MAP containing HVR1 sequences on HCV infection.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,2000;8(2):171-174
摘要
目的 体外观察含HCV高变区1多抗原肽(MAP)及其抗血清对HCV感染有无阻断作用.
方法 将前期合成的MAP及其抗血清和HCV感染血清按不同比例充分混合并在37℃下孵育2h或4℃下孵育12h,再将此混合血清接种7721细胞,分别以逆转录-聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞的感染情况.
结果 各比例混合的阻断血清组在孵育后细胞和培养上清中均可检出HCVRNA;免疫组化证实有表达HCV抗原的阳性细胞.
结论 前期合成的HCV包膜糖蛋白及其抗血清在体外不能明确阻断HCV感染/吸附肝细胞.
主题词 丙型肝炎病毒;细胞模型;多抗原肽;疫苗
宋志强,郝飞,王永刚,闵峰,王宇明.丙型肝炎病毒HVR1抗血清体外阻断HCV的感染.世界华人消化杂志,2000;8(2):171-174
0 引言
近年研究表明，HCV包膜糖蛋白高变区1(hypervariable region 1, HVR1)含有重要的中和抗原表位，编码的蛋白能诱导机体产生具有中和作用的中和抗体. 由于HVR1显著变异性，这种中和抗体可能是株特异性的(isolate-specific)[1-6]. 针对HCV包膜糖蛋白抗原表位构型和显著变异的特点，我们设计并合成含HCV包膜糖蛋白中和抗原表位的多抗原肽(multiple antigenic peptide, MAP)，并免疫家兔获得了高效价的抗血清，显示有良好的免疫原性和反应原性，值得进一步研究[7]. 另外，我们在前期的研究中用慢性丙型肝炎患者的血清体外感染人肝细胞建立了能稳定支持HCV体外复制的细胞模型[8]. 我们在此基础上，体外观察了MAP及其抗血清对HCV感染的阻断作用，现报告如下.
1 材料和方法
1.1 材料 以已测出的HCV-BJ株(Ⅰb型)E2/NS1区HVR1氨基酸序列为基础，参照国外报道的HVR1高频序列，利用Goldkey软件(军事医学科学院三所)，根据蛋白质结构和抗原性预测原理对其进行局部亲水性和主链柔韧性预测，并结合国外学者已报道的HCV HVR1序列上的B细胞抗原表位区段，选择HVR1氨基酸第390～411位，合成含22个氨基酸的线性单体多肽(LP). MAP选用对称八分枝多抗原肽树脂合成. LP及MAP均由美国Cybersyn生物工程公司合成，并经高效液色谱分析证实纯度>95%[7]. 实验所用的感染血清均来自重庆地区慢性丙型肝炎患者，经抗HCV ELISA检测证实抗HCV阳性，并经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测证实HCV RNA为阳性. 血清无菌采集后分装并冻存于-20℃. 正常血清来自我院输血科健康献血员. 兔抗MAP血清由本室制备，用MAP免疫家兔后收集抗血清，经测定抗体效价为1∶40960[7]. 细胞培养所用的小牛血清由本校试剂中心提供. 血清无菌采集后分装并冻存于-20℃，用前经56℃ 30min灭活补体. PRMI1640培养基购自美国Gibco公司. 链霉菌抗亲生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)免疫组化试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司；HCV NS3单克隆抗体由北京医科大学肝病研究所提供. RT-PCR检测HCV正、负链RNA试剂盒由北京医科大学肝病研究所提供(产品批号：981102). Dig标记的HCV正链寡核苷酸探针位于HCV 5＇非编码区，即(-95nt～-56nt)5＇-CTGCTAGCCGACTAGTGTTGGGTCCGCGAAACCG CTTGTGG-3＇，由军事医学科学院二所制备和纯化. 碱性磷酸酶标记的地高辛(Dig)抗体(工作浓度1∶500)、封闭试剂和NBT/BCIP溶液为德国宝灵曼公司产品. 7721细胞株为本科自存. 细胞复苏后，制成浓度为5×105的细胞悬液并接种培养瓶/板，置入37℃含50mL/LCO2培养箱培养. 每3d～5d部分更换培养基，待细胞接近融合时，按1∶2进行传代培养或冻存于液氮中. 取已灭活的HCV感染血清，用1640液稀释2倍. MAP液：称取MAP 50μg，溶解于1mL的1640液中，过滤除菌，制备成无菌的MAP液. 将兔抗MAP血清与HCV感染血清分别按10∶1，1∶1，1∶10，1∶100不同体积比充分混合后，在37℃下孵育2h或4℃下孵育12h，以使中和吸附得到充分反应. 经MAP吸附的兔抗MAP血清：取抗MAP血清0.5mL与50μg的MAP充分混合后过滤除菌，如前孵育以使MAP与兔抗MAP血清中的MAP抗体充分吸附；再将此经吸附后的抗MAP与感染血清按1∶1的体积比混合. 对照血清：取1mL生理盐水(空白对照)或正常人血清(正常对照)与1mL HCV感染血清充分混合后如前孵育.
1.2 方法
1.2.1 实验方法及阻断分组 同时设立感染组、封闭组、阻断组、MAP吸附组及两对照组，用7721细胞株在12孔培养板上进行. ①感染组：为阻断实验的阳性对照. 取细胞生长良好的培养板，每孔加入感染血清100μL. 8h后洗去混合血清继续培养，标本收集同细胞模型
[9，10]. ②封闭组：用于研究MAP是否有封闭细胞膜上HCV病毒受体的作用. 取细胞生长良好的培养板，每孔加入前述MAP液100μL，12h后彻底洗去MAP液，加入感染血清100μL，8h后彻底洗去感染血清继续培养，标本收集同前. ③阻断组：用于研究兔抗MAP血清在体外是否具有中和HCV或阻止HCV吸附靶细胞的作用. 如前在每孔分别加入不同比例的混合血清100μL，然后加入完全培养基至终体积为0.5mL. 8h后彻底洗去混合血清继续培养，标本收集同前. ④MAP吸附组：用以确证兔抗MAP血清中是否是抗MAP具有中和HCV的活性. 每孔先加入经MAP吸附的血清与感染血清的混合血清100μL. 8h后彻底洗去混合血清继续培养，标本收集同前. ⑤空白对照组：每孔分别加入生理盐水与HCV感染血清的混合液100μL，余同前. ⑥正常对照组：每孔分别加入正常人血清与HCV感染血清的混合血清100μL，余同前.
1.2.2 检测指标及方法 按我室已建立的方法进行. ①细胞及培养上清中HCV正、负链RNA的检测：采用RT-PCR方法，按试剂盒操作说明书进行. 简要步骤：提取HCV RNA，加入逆转录试验反应体系(检测正链RNA时选择负链引物，检测负链RNA时选择正链引物)，37℃ 60min，95℃ 5min；在逆转录产物中加入PCR反应缓冲液(含聚合酶及HCV正链或负链外引物)94℃ 1min，55℃ 1.5min，72℃ 2min，60个循环后，72℃继续反应10min，取扩增产物10μL与1μL载样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭的20g/L琼脂糖，于1×TAE缓冲液中，在5V/cm的电压下电泳30min. 在紫外灯下观察145bp处有荧光带者即为阳性. ②免疫组化检测细胞内抗原表达：操作步骤按照试剂盒说明书进行，并作部分改动. 分别用10mL/L小牛血清清蛋白(第一抗体稀释液)、PBS替代第一抗体做第一抗体替代对照；用PBS分别替代生物素标记的第二抗体和SP液作试剂替代对照. ③原位杂交：操作步骤同前[8]；分别用不加探针的杂交液和不加抗Dig抗体的1号Dig缓冲液做对照.
2 结果
2.1 7721细胞内及培养上清中HCV RNA的检测 在细胞接种混合血清后，用RT-PCR检测细胞内HCV RNA，结果发现，感染组、阻断组、封闭组、MAP吸附组的细胞内可检出HCV正、负链RNA(表1及图1～3). 空白对照组未检出HCV RNA.
2.2 免疫组化结果 感染组、阻断组、封闭组、MAP吸附组可见表达HCV NS3抗原的阳性细胞：棕黄色着色的阳性细胞多呈点状和散在分布，弥漫性分布少见，HCV抗原在细胞内的分布多呈胞质型(图4，5). 正常对照和空白对照、免疫组化对照实验均未表达HCV NS3抗原的阳性细胞(图6).
2.3 原位杂交 在细胞接种MAP及混合血清后d4收集细胞爬片，用原位杂交检测到细胞内HCV负链RNA，可见蓝色着色的杂交阳性细胞，阳性细胞呈散在分布/点状分布，阳性物质呈蓝紫色细小颗粒，其表现形式以胞质型为多见(图7). 空白对照组、正常对照组未见杂交信号.
表1 阻断组细胞内及培养上清中HCV RNA的检测
图1 RT-PCR检测细胞内HCV正链RNA.1. 10∶1阻断组； 2. 1∶1阻断组； 3. 1∶10阻断组； 4. MAP封闭组； 5. MAP吸附组； 6. 感染组
图2 RT-PCR检测细胞内HCV负链RNA.1. 10∶1阻断组； 2. 1∶1阻断组； 3. 1∶10阻断组； 4. MAP封闭组； 5. MAP吸附组； 6. 感染组
图3 RT-PCR检测培养上清中HCV正链RNA.1. 10∶1阻断组； 2. 1∶1阻断组； 3. 1∶10阻断组； 4. MAP封闭组； 5. MAP吸附组； 6. 感染组
图4 免疫组化检测表达HCV NS3抗原的7721细胞. (1∶1阻断组，200×)
图5 免疫组化检测7721细胞内的HCV-NS3抗原. (MAP封闭组，×100)
图6 免疫组化阴性对照. (×200)
图7 原位杂交法检测7721细胞内的HCV RNA. (1∶1阻断组，200×)
3 讨论
HCV是输血后肝炎发生的主要病因，一旦感染后易呈慢性化，且与肝硬变及原发性肝癌的发生关系密切，对人类健康危害很大[1]. 由于本病传播途径多样化以及缺乏有效的治疗手段，发展有效的预防性疫苗以控制HCV感染有着重大的社会意义和学术价值. 研究表明，HCV包膜糖蛋白含重要的中和性抗原表位，编码的蛋白能够诱导产生具有保护性的中和抗体，提示中和抗体的攻击靶位是E2/NS1的HVR1，以HCV包膜糖蛋白HVR1为基础研究制备预防性疫苗是可行的[1-6]. 但HCV具有高度变异性，新的病毒变异株可以逃避原来已产生的中和抗体的识别和中和作用，而且由于研究方法学上存在的差异，有关该区段免疫反应性表位的分布各家报道亦有所不同，且一般是线形表位分析，对构型表位缺乏深入了解，这些因素限制了疫苗的研制.
MAP[9]是以核心基质为交联体或树状臂，将若干条抗原表位相同或不相同的单体肽偶联在一起，形成树枝状结构，这样可以较好地模拟天然抗原表位构象，较单体肽具有明显的优越性，已用于人免疫缺陷病毒(HIV)、口蹄疫病毒(FMDV)、乙型肝炎病毒(HBV)和疟原虫等多种病原体中和抗原表位的分析和分子疫苗的设计. 我们设计并合成含HCV包膜糖蛋白中和抗原表位的MAP在前期的研究中显示有良好的免疫原性和反应原性，若能细胞水平上观察MAP及其抗血清对HCV感染有明确阻断作用，可为深入研究HCV感染后保护性免疫和探讨HCV包膜糖蛋白分子疫苗打下一定基础.
国外有学者曾用丙型肝炎患者恢复期血清或兔抗HVR1血清在体外部分成功地阻断HCV的感染[1，4-6]，我们研究显示前期所合成的MAP及其抗血清在体外未显示有明确阻断HCV感染/吸附肝细胞的作用. 分析其原因，可能所用感染血清来自慢性丙型肝炎患者，其中含有多种HCV准种(quasispecies)，MAP及抗MAP血清可能未完全阻断所有HCV准种的感染. 另一方面，所合成的MAP中可能未包含主要的中和性抗原表位，因而不具有中和活性或只具备部分中和活性[10].
尽管我们前期合成的MAP及其抗血清体外不能阻断HCV感染，但不能否认MAP较单体肽在构建抗原表位上的优势. MAP在HIV，FMDV，HBV等保护性抗原分析和分子疫苗中的成功应用，对设计和制备HCV疫苗是一个有益的启示. 由辅助性T表位、中和性表位或(和)CTL表位组成的并且有一定构象的大分子嵌合肽可能最终成为有效的疫苗.
4 参考文献
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Characterization of human monoclonal antibodies specific to the hepatitis C virus glycoprotein E2 with in vitro binding
neutralization properties.Virology,1998;249:32-41, http://www.100md.com(宋志强1 郝飞1 王永刚2 闵峰2 王宇明2)
2全军传染病专科中心 重庆市 400038
宋志强，男，1972-02-19生，河南省上蔡县人，汉族. 1995年第三军医大学毕业，学士，1996年第三军医大学硕士，1999年第三军医大学博士，主要从事肝炎和自身免疫性疾病的发病机制和防治的研究，发表论著或综述12篇.
国家自然科学基金资助课题，No.39670672
项目负责人 宋志强，400038，重庆市，中国人民解放军第三军医大学西南医院皮肤科.
Supported by National Natural Scientific Foundation of China, No.39670672
Correspondence to Dr. Zhi-Qiang Song, Department of Dermatology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Tel. +86-23-68754217, Fax. +86-23-68754475
Email. Songzq@263.net, http://songzq.163.net
收稿日期 1999-09-28 接收日期 1999-11-25
Blocking effect of hyperimmune rabbit serum against MAP containing HVR1 sequences on HCV infection
Zhi-Qiang Song1, Fei Hao1, Yong-Gang Wang2, Feng Min2 and Yu-Ming Wang2
Department of Dermatology1, Center for Infectious Disease of Chinese PLA2, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Abstract
AIM To study whether hyperimmune rabbit serum against MAP containing HVR1 sequences could block in vitro infection of HCV.
METHODS The hyperimmune rabbit serum was mixed with the infectious serum of HCV according to a series of proportion and then the mixture was incubated for 2 hours at 37℃ or for 12 hours at 4℃. Then 7721 cells were incubated in the mixed sera. After incubation, the presence of HCV RNA and antigen in cells and/or supernatant was examined by RT-PCR, immunohistochemistry and in situ hybridization respectively.
RESULTS HCV RNA and NS3 antigen could be detected in 7721 cells and/or supernatant in all blocking groups after incubation.
CONCLUSION MAP and the hyperimmune serum against MAP can not block viral attachment or infection to cells.
Subject headings hepatitis C virus; cell model; multiple antigenic peptide; vaccine
Song ZQ,Hao F,Wang YG,Min F,Wang YM.Blocking effect of hyperimmune rabbit serum against MAP containing HVR1 sequences on HCV infection.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,2000;8(2):171-174
摘要
目的 体外观察含HCV高变区1多抗原肽(MAP)及其抗血清对HCV感染有无阻断作用.
方法 将前期合成的MAP及其抗血清和HCV感染血清按不同比例充分混合并在37℃下孵育2h或4℃下孵育12h,再将此混合血清接种7721细胞,分别以逆转录-聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞的感染情况.
结果 各比例混合的阻断血清组在孵育后细胞和培养上清中均可检出HCVRNA;免疫组化证实有表达HCV抗原的阳性细胞.
结论 前期合成的HCV包膜糖蛋白及其抗血清在体外不能明确阻断HCV感染/吸附肝细胞.
主题词 丙型肝炎病毒;细胞模型;多抗原肽;疫苗
宋志强,郝飞,王永刚,闵峰,王宇明.丙型肝炎病毒HVR1抗血清体外阻断HCV的感染.世界华人消化杂志,2000;8(2):171-174
0 引言
近年研究表明，HCV包膜糖蛋白高变区1(hypervariable region 1, HVR1)含有重要的中和抗原表位，编码的蛋白能诱导机体产生具有中和作用的中和抗体. 由于HVR1显著变异性，这种中和抗体可能是株特异性的(isolate-specific)[1-6]. 针对HCV包膜糖蛋白抗原表位构型和显著变异的特点，我们设计并合成含HCV包膜糖蛋白中和抗原表位的多抗原肽(multiple antigenic peptide, MAP)，并免疫家兔获得了高效价的抗血清，显示有良好的免疫原性和反应原性，值得进一步研究[7]. 另外，我们在前期的研究中用慢性丙型肝炎患者的血清体外感染人肝细胞建立了能稳定支持HCV体外复制的细胞模型[8]. 我们在此基础上，体外观察了MAP及其抗血清对HCV感染的阻断作用，现报告如下.
1 材料和方法
1.1 材料 以已测出的HCV-BJ株(Ⅰb型)E2/NS1区HVR1氨基酸序列为基础，参照国外报道的HVR1高频序列，利用Goldkey软件(军事医学科学院三所)，根据蛋白质结构和抗原性预测原理对其进行局部亲水性和主链柔韧性预测，并结合国外学者已报道的HCV HVR1序列上的B细胞抗原表位区段，选择HVR1氨基酸第390～411位，合成含22个氨基酸的线性单体多肽(LP). MAP选用对称八分枝多抗原肽树脂合成. LP及MAP均由美国Cybersyn生物工程公司合成，并经高效液色谱分析证实纯度>95%[7]. 实验所用的感染血清均来自重庆地区慢性丙型肝炎患者，经抗HCV ELISA检测证实抗HCV阳性，并经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测证实HCV RNA为阳性. 血清无菌采集后分装并冻存于-20℃. 正常血清来自我院输血科健康献血员. 兔抗MAP血清由本室制备，用MAP免疫家兔后收集抗血清，经测定抗体效价为1∶40960[7]. 细胞培养所用的小牛血清由本校试剂中心提供. 血清无菌采集后分装并冻存于-20℃，用前经56℃ 30min灭活补体. PRMI1640培养基购自美国Gibco公司. 链霉菌抗亲生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)免疫组化试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司；HCV NS3单克隆抗体由北京医科大学肝病研究所提供. RT-PCR检测HCV正、负链RNA试剂盒由北京医科大学肝病研究所提供(产品批号：981102). Dig标记的HCV正链寡核苷酸探针位于HCV 5＇非编码区，即(-95nt～-56nt)5＇-CTGCTAGCCGACTAGTGTTGGGTCCGCGAAACCG CTTGTGG-3＇，由军事医学科学院二所制备和纯化. 碱性磷酸酶标记的地高辛(Dig)抗体(工作浓度1∶500)、封闭试剂和NBT/BCIP溶液为德国宝灵曼公司产品. 7721细胞株为本科自存. 细胞复苏后，制成浓度为5×105的细胞悬液并接种培养瓶/板，置入37℃含50mL/LCO2培养箱培养. 每3d～5d部分更换培养基，待细胞接近融合时，按1∶2进行传代培养或冻存于液氮中. 取已灭活的HCV感染血清，用1640液稀释2倍. MAP液：称取MAP 50μg，溶解于1mL的1640液中，过滤除菌，制备成无菌的MAP液. 将兔抗MAP血清与HCV感染血清分别按10∶1，1∶1，1∶10，1∶100不同体积比充分混合后，在37℃下孵育2h或4℃下孵育12h，以使中和吸附得到充分反应. 经MAP吸附的兔抗MAP血清：取抗MAP血清0.5mL与50μg的MAP充分混合后过滤除菌，如前孵育以使MAP与兔抗MAP血清中的MAP抗体充分吸附；再将此经吸附后的抗MAP与感染血清按1∶1的体积比混合. 对照血清：取1mL生理盐水(空白对照)或正常人血清(正常对照)与1mL HCV感染血清充分混合后如前孵育.
1.2 方法
1.2.1 实验方法及阻断分组 同时设立感染组、封闭组、阻断组、MAP吸附组及两对照组，用7721细胞株在12孔培养板上进行. ①感染组：为阻断实验的阳性对照. 取细胞生长良好的培养板，每孔加入感染血清100μL. 8h后洗去混合血清继续培养，标本收集同细胞模型
[9，10]. ②封闭组：用于研究MAP是否有封闭细胞膜上HCV病毒受体的作用. 取细胞生长良好的培养板，每孔加入前述MAP液100μL，12h后彻底洗去MAP液，加入感染血清100μL，8h后彻底洗去感染血清继续培养，标本收集同前. ③阻断组：用于研究兔抗MAP血清在体外是否具有中和HCV或阻止HCV吸附靶细胞的作用. 如前在每孔分别加入不同比例的混合血清100μL，然后加入完全培养基至终体积为0.5mL. 8h后彻底洗去混合血清继续培养，标本收集同前. ④MAP吸附组：用以确证兔抗MAP血清中是否是抗MAP具有中和HCV的活性. 每孔先加入经MAP吸附的血清与感染血清的混合血清100μL. 8h后彻底洗去混合血清继续培养，标本收集同前. ⑤空白对照组：每孔分别加入生理盐水与HCV感染血清的混合液100μL，余同前. ⑥正常对照组：每孔分别加入正常人血清与HCV感染血清的混合血清100μL，余同前.
1.2.2 检测指标及方法 按我室已建立的方法进行. ①细胞及培养上清中HCV正、负链RNA的检测：采用RT-PCR方法，按试剂盒操作说明书进行. 简要步骤：提取HCV RNA，加入逆转录试验反应体系(检测正链RNA时选择负链引物，检测负链RNA时选择正链引物)，37℃ 60min，95℃ 5min；在逆转录产物中加入PCR反应缓冲液(含聚合酶及HCV正链或负链外引物)94℃ 1min，55℃ 1.5min，72℃ 2min，60个循环后，72℃继续反应10min，取扩增产物10μL与1μL载样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭的20g/L琼脂糖，于1×TAE缓冲液中，在5V/cm的电压下电泳30min. 在紫外灯下观察145bp处有荧光带者即为阳性. ②免疫组化检测细胞内抗原表达：操作步骤按照试剂盒说明书进行，并作部分改动. 分别用10mL/L小牛血清清蛋白(第一抗体稀释液)、PBS替代第一抗体做第一抗体替代对照；用PBS分别替代生物素标记的第二抗体和SP液作试剂替代对照. ③原位杂交：操作步骤同前[8]；分别用不加探针的杂交液和不加抗Dig抗体的1号Dig缓冲液做对照.
2 结果
2.1 7721细胞内及培养上清中HCV RNA的检测 在细胞接种混合血清后，用RT-PCR检测细胞内HCV RNA，结果发现，感染组、阻断组、封闭组、MAP吸附组的细胞内可检出HCV正、负链RNA(表1及图1～3). 空白对照组未检出HCV RNA.
2.2 免疫组化结果 感染组、阻断组、封闭组、MAP吸附组可见表达HCV NS3抗原的阳性细胞：棕黄色着色的阳性细胞多呈点状和散在分布，弥漫性分布少见，HCV抗原在细胞内的分布多呈胞质型(图4，5). 正常对照和空白对照、免疫组化对照实验均未表达HCV NS3抗原的阳性细胞(图6).
2.3 原位杂交 在细胞接种MAP及混合血清后d4收集细胞爬片，用原位杂交检测到细胞内HCV负链RNA，可见蓝色着色的杂交阳性细胞，阳性细胞呈散在分布/点状分布，阳性物质呈蓝紫色细小颗粒，其表现形式以胞质型为多见(图7). 空白对照组、正常对照组未见杂交信号.
表1 阻断组细胞内及培养上清中HCV RNA的检测
| 阻断组别 | 正链RNA(P) | 负链RNA(M) | 上清中正链RNA(P) |
| 10∶1 | ++ | + | + |
| 1∶1 | + | + | + |
| 1∶10 | ++ | ++ | ++ |
| 1∶100 | ND | ND | ND |
| MAP封闭组 | — | + | ++ |
| MAP吸附组 | + | ++ | + |
| 感染组 | ++ | ++ | ++ |
图1 RT-PCR检测细胞内HCV正链RNA.1. 10∶1阻断组； 2. 1∶1阻断组； 3. 1∶10阻断组； 4. MAP封闭组； 5. MAP吸附组； 6. 感染组
图2 RT-PCR检测细胞内HCV负链RNA.1. 10∶1阻断组； 2. 1∶1阻断组； 3. 1∶10阻断组； 4. MAP封闭组； 5. MAP吸附组； 6. 感染组
图3 RT-PCR检测培养上清中HCV正链RNA.1. 10∶1阻断组； 2. 1∶1阻断组； 3. 1∶10阻断组； 4. MAP封闭组； 5. MAP吸附组； 6. 感染组
图4 免疫组化检测表达HCV NS3抗原的7721细胞. (1∶1阻断组，200×)
图5 免疫组化检测7721细胞内的HCV-NS3抗原. (MAP封闭组，×100)
图6 免疫组化阴性对照. (×200)
图7 原位杂交法检测7721细胞内的HCV RNA. (1∶1阻断组，200×)
3 讨论
HCV是输血后肝炎发生的主要病因，一旦感染后易呈慢性化，且与肝硬变及原发性肝癌的发生关系密切，对人类健康危害很大[1]. 由于本病传播途径多样化以及缺乏有效的治疗手段，发展有效的预防性疫苗以控制HCV感染有着重大的社会意义和学术价值. 研究表明，HCV包膜糖蛋白含重要的中和性抗原表位，编码的蛋白能够诱导产生具有保护性的中和抗体，提示中和抗体的攻击靶位是E2/NS1的HVR1，以HCV包膜糖蛋白HVR1为基础研究制备预防性疫苗是可行的[1-6]. 但HCV具有高度变异性，新的病毒变异株可以逃避原来已产生的中和抗体的识别和中和作用，而且由于研究方法学上存在的差异，有关该区段免疫反应性表位的分布各家报道亦有所不同，且一般是线形表位分析，对构型表位缺乏深入了解，这些因素限制了疫苗的研制.
MAP[9]是以核心基质为交联体或树状臂，将若干条抗原表位相同或不相同的单体肽偶联在一起，形成树枝状结构，这样可以较好地模拟天然抗原表位构象，较单体肽具有明显的优越性，已用于人免疫缺陷病毒(HIV)、口蹄疫病毒(FMDV)、乙型肝炎病毒(HBV)和疟原虫等多种病原体中和抗原表位的分析和分子疫苗的设计. 我们设计并合成含HCV包膜糖蛋白中和抗原表位的MAP在前期的研究中显示有良好的免疫原性和反应原性，若能细胞水平上观察MAP及其抗血清对HCV感染有明确阻断作用，可为深入研究HCV感染后保护性免疫和探讨HCV包膜糖蛋白分子疫苗打下一定基础.
国外有学者曾用丙型肝炎患者恢复期血清或兔抗HVR1血清在体外部分成功地阻断HCV的感染[1，4-6]，我们研究显示前期所合成的MAP及其抗血清在体外未显示有明确阻断HCV感染/吸附肝细胞的作用. 分析其原因，可能所用感染血清来自慢性丙型肝炎患者，其中含有多种HCV准种(quasispecies)，MAP及抗MAP血清可能未完全阻断所有HCV准种的感染. 另一方面，所合成的MAP中可能未包含主要的中和性抗原表位，因而不具有中和活性或只具备部分中和活性[10].
尽管我们前期合成的MAP及其抗血清体外不能阻断HCV感染，但不能否认MAP较单体肽在构建抗原表位上的优势. MAP在HIV，FMDV，HBV等保护性抗原分析和分子疫苗中的成功应用，对设计和制备HCV疫苗是一个有益的启示. 由辅助性T表位、中和性表位或(和)CTL表位组成的并且有一定构象的大分子嵌合肽可能最终成为有效的疫苗.
4 参考文献
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