大黄素、汉防己甲素对成纤维细胞增殖的影响
1上海第二医科大学附属新华医院 上海市 2000922闵行区中心医院
项目负责人 卫新革，200237，上海市凌云路梅陇四村93号1207室.
收稿日期 1999-10-25 接收日期 1999-11-26
Subject headings emodin; tetradrine; fibroblast; liver cirrhosis
主题词 大黄素；汉防己甲素；成纤维细胞；肝硬化
, 百拇医药 为了寻找有效的抗肝纤维化药物，我们研究了中草药的有效成分-大黄素(emodin, Emd)和汉防己甲素(tetradrine, Tet)对成纤维细胞增殖的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 ①人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast, HLF)：中国科学院上海细胞生物研究所提供；②主要试剂：RPMI-1640培养基：Gibco公司产品. Emd：上海医科大学药学院天然药物化学教研室提供. Tet：浙江金华第三制药厂产品. 四甲基偶氮唑盐(MTT)：Fluka公司产品. HEPES：E.M.K进口分装. 514MC-酶联免疫测定仪：上海第三分析仪厂产品.
1.2 方法 选用对数生长期HLF细胞，经2.5g/L胰蛋白酶消化后，用RPMI-1640培养液(含100mL/L小牛血清，青霉素105U/L，链霉素0.1g/L，HEPES 15mmol/L)调整细胞浓度为1×108/L，接种于96孔细胞培养板中，每孔200μL细胞悬液，置于37℃、含50mL/L CO2和950mL/L空气的细胞培养箱中孵育24h后，换用无血清RPMI-1640培养液，并分别加入不同浓度的药物，正常对照组加入等量的药物溶剂，每孔总体积仍为200μL. 每一种处理均设5个复孔. 继续培养24h后，每孔加入5g/L MTT溶液20μL，再培养7h后，弃培养液. 每孔加入二甲基亚砜200μL，震荡使形成的甲月赞 充分溶解，30min后在514MC-酶联免疫测定仪上测540nm处OD值.
, 百拇医药
统计学处理 各组数据以平均数±标准差(x±s)表示. 两组均数间的差异采用t检验.
2 结果
Emd和Tet各剂量组均明显抑制HLF增殖(P<0.01)，且剂量呈依赖性. Emd 5mg/L+Tet 2.5mg/L和Emd 10mg/L+Tet 5mg/L联合用药与同浓度单一用药比较其抑制HLF增殖的作用增强，但无统计学差异(P>0.05，表1).
表1 Emd,Tet对HLF增殖作用的影响
, http://www.100md.com
bP<0.01，vs 正常对照组.
3 讨论
MTT法测定细胞存活、增殖具有简便、灵敏、稳定可靠等优点[1]，故我们采用本法测定了Emd，Tet对HLF增殖的作用.
Emd是从中草药大黄中分离提纯的蒽醌衍生物，化学结构为1，6，8-三羟基-3甲基蒽醌. 研究发现[2，3]，Emd有抗肿瘤作用，能明显抑制小鼠黑素瘤、艾氏腹水瘤及人肺癌A-549细胞的分裂、增殖. 最近有学者报道[4，5]，Emd对纤维增生性细胞如肾系膜细胞、血管平滑肌细胞的增殖亦有明显的抑制作用，提示Emd可能有抗脏器纤维化作用. 然而对肝脏纤维化的影响，目前尚未见报道. 为此，本实验观察了Emd对HLF增殖的影响，结果发现Emd在浓度为5mg/L，10mg/L和20mg/L时均能明显抑制HLF的增殖，提示Emd可能有抗脏器纤维化作用.
, 百拇医药
Emd抑制成纤维细胞增殖的作用机制仍不清楚. 据研究[2，3]，Emd抗肿瘤作用与其抑制癌细胞的氧化和脱氧、干扰DNA模板的功能及减少G2+M期细胞有关. 在细胞周期的调控中，c-myc原癌基因能促使细胞从G1期向S期转化，从而实现其对细胞增殖、分化的调控作用. Emd能明显抑制系膜细胞c-myc原癌基因的表达，提示Emd可能通过阻滞系膜细胞由G1期进入S期，从而抑制系膜细胞增殖[6]. 此外，Emd还能诱导单核细胞分泌γ-干扰素(interferon gamma, IFN-γ)[7]，而IFN-γ具有抑制成纤维细胞增殖和抗病毒、抗肝纤维化作用[8]. 但是，Emd究竟通过何种机制抑制成纤维细胞的增殖，有待进一步研究.
, 百拇医药
Tet是从防己科植物的根中提取的一种生物碱，具有钙通道阻滞作用. 本实验结果显示，Tet在浓度为5mg/L，10mg/L和20mg/L时均能明显抑制HLF的增殖. 细胞外和细胞内适宜的Ca2+浓度对细胞增殖是必需的，胞质中Ca2+浓度在G1/S期突发性增加被认为是细胞复制增殖原始信号[9]. Tet是钙通道阻滞剂，能抑制细胞内Ca2+浓度的升高，导致细胞增殖信号不能有效传递，使细胞受阻于G1期，从而阻止细胞从G1期进入S期，进而抑制细胞的增殖.
在本实验中还观察到，Emd和Tet合用时对HLF增殖的抑制作用与同浓度单独用药时有所增强，但无统计学上的差异. 总之，本研究结果表明，Emd和Tet均能明显抑制成纤维细胞的增殖，提示它们可能有良好的抗肝纤维化作用.
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4 参考文献
1 郑永唐，贲昆龙. 测定细胞存活和增殖的MTT方法的建立. 免疫学杂志，1992；8：266-269
2 周远鹏，江京莉. 大黄的药理研究概述. 中药药理与临床，1991；7：41-48
3 陈家，吴中亮，杨晖，高宏光，冯健威，李乃明，丁宙. 大黄素对人肺癌，A-549细胞杀伤作用的研究. 中草药，1991；22：543-546
4 黎磊石，刘志红，张景红，姚建，杨俊伟，郑丰. 大黄延缓慢性肾衰的临床及实验研究. 中西医结合杂志，1991；11：392-396
5 郭丹杰，徐成斌，陈源源. 大黄素对血管平滑肌细胞增殖影响的实验研究. 中华内科杂志，1996；35：157-159
, http://www.100md.com
6 Liu ZH, Li LS, Hu WX, Zhou H. Effect of Emodin on c-myc proto-oncongen expression in cultured rat mesangial cells.
Acta Pharmacologica Sinica, 1996;17:61-63
7 王文俊，吴咸中，姚智，李会强，卢奕. 中药有效成分对IL-2及IFN-γ分泌的影响. 天津中医，1995；12：23-24
8 Clemens MT, Mcnurlan MA. Regulation of cell proliferation and differentiation by interferons. Biochem J, 1985;226:345-360
9 Hickie RA, Wei JW, Blyth LM, Wong DY, Klaassen DJ. Cations and calmodulin in normal and neoplastic cell growth regulation.
Can J Biochem Cell Biol, 1983;61:934-941, http://www.100md.com(卫新革1,2 陈颖伟1 展玉涛1 沈礼勇1 李定国1 陆汉明1)
项目负责人 卫新革，200237，上海市凌云路梅陇四村93号1207室.
收稿日期 1999-10-25 接收日期 1999-11-26
Subject headings emodin; tetradrine; fibroblast; liver cirrhosis
主题词 大黄素；汉防己甲素；成纤维细胞；肝硬化
, 百拇医药 为了寻找有效的抗肝纤维化药物，我们研究了中草药的有效成分-大黄素(emodin, Emd)和汉防己甲素(tetradrine, Tet)对成纤维细胞增殖的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 ①人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast, HLF)：中国科学院上海细胞生物研究所提供；②主要试剂：RPMI-1640培养基：Gibco公司产品. Emd：上海医科大学药学院天然药物化学教研室提供. Tet：浙江金华第三制药厂产品. 四甲基偶氮唑盐(MTT)：Fluka公司产品. HEPES：E.M.K进口分装. 514MC-酶联免疫测定仪：上海第三分析仪厂产品.
1.2 方法 选用对数生长期HLF细胞，经2.5g/L胰蛋白酶消化后，用RPMI-1640培养液(含100mL/L小牛血清，青霉素105U/L，链霉素0.1g/L，HEPES 15mmol/L)调整细胞浓度为1×108/L，接种于96孔细胞培养板中，每孔200μL细胞悬液，置于37℃、含50mL/L CO2和950mL/L空气的细胞培养箱中孵育24h后，换用无血清RPMI-1640培养液，并分别加入不同浓度的药物，正常对照组加入等量的药物溶剂，每孔总体积仍为200μL. 每一种处理均设5个复孔. 继续培养24h后，每孔加入5g/L MTT溶液20μL，再培养7h后，弃培养液. 每孔加入二甲基亚砜200μL，震荡使形成的甲月赞 充分溶解，30min后在514MC-酶联免疫测定仪上测540nm处OD值.
, 百拇医药
统计学处理 各组数据以平均数±标准差(x±s)表示. 两组均数间的差异采用t检验.
2 结果
Emd和Tet各剂量组均明显抑制HLF增殖(P<0.01)，且剂量呈依赖性. Emd 5mg/L+Tet 2.5mg/L和Emd 10mg/L+Tet 5mg/L联合用药与同浓度单一用药比较其抑制HLF增殖的作用增强，但无统计学差异(P>0.05，表1).
表1 Emd,Tet对HLF增殖作用的影响
| 组别 | 剂量(mg/L) | OD值 |
| 正常对照组 | 0.732±0.0875 | 0.460±0.065b |
| Emd | 10 | 0.413±0.053b |
| 20 | 0.401±0.067b | |
| 2.5 | 0.476±0.059b | |
| Tet | 5 | 0.407±0.039b |
| 10 | 0.395±0.032b | |
| Emd(5mg/L)+Tet(2.5mg/L) | 0.395±0.071b | |
| Emd(10mg/L)+Tet(5mg/L) | 0.389±0.052b |
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bP<0.01，vs 正常对照组.
3 讨论
MTT法测定细胞存活、增殖具有简便、灵敏、稳定可靠等优点[1]，故我们采用本法测定了Emd，Tet对HLF增殖的作用.
Emd是从中草药大黄中分离提纯的蒽醌衍生物，化学结构为1，6，8-三羟基-3甲基蒽醌. 研究发现[2，3]，Emd有抗肿瘤作用，能明显抑制小鼠黑素瘤、艾氏腹水瘤及人肺癌A-549细胞的分裂、增殖. 最近有学者报道[4，5]，Emd对纤维增生性细胞如肾系膜细胞、血管平滑肌细胞的增殖亦有明显的抑制作用，提示Emd可能有抗脏器纤维化作用. 然而对肝脏纤维化的影响，目前尚未见报道. 为此，本实验观察了Emd对HLF增殖的影响，结果发现Emd在浓度为5mg/L，10mg/L和20mg/L时均能明显抑制HLF的增殖，提示Emd可能有抗脏器纤维化作用.
, 百拇医药
Emd抑制成纤维细胞增殖的作用机制仍不清楚. 据研究[2，3]，Emd抗肿瘤作用与其抑制癌细胞的氧化和脱氧、干扰DNA模板的功能及减少G2+M期细胞有关. 在细胞周期的调控中，c-myc原癌基因能促使细胞从G1期向S期转化，从而实现其对细胞增殖、分化的调控作用. Emd能明显抑制系膜细胞c-myc原癌基因的表达，提示Emd可能通过阻滞系膜细胞由G1期进入S期，从而抑制系膜细胞增殖[6]. 此外，Emd还能诱导单核细胞分泌γ-干扰素(interferon gamma, IFN-γ)[7]，而IFN-γ具有抑制成纤维细胞增殖和抗病毒、抗肝纤维化作用[8]. 但是，Emd究竟通过何种机制抑制成纤维细胞的增殖，有待进一步研究.
, 百拇医药
Tet是从防己科植物的根中提取的一种生物碱，具有钙通道阻滞作用. 本实验结果显示，Tet在浓度为5mg/L，10mg/L和20mg/L时均能明显抑制HLF的增殖. 细胞外和细胞内适宜的Ca2+浓度对细胞增殖是必需的，胞质中Ca2+浓度在G1/S期突发性增加被认为是细胞复制增殖原始信号[9]. Tet是钙通道阻滞剂，能抑制细胞内Ca2+浓度的升高，导致细胞增殖信号不能有效传递，使细胞受阻于G1期，从而阻止细胞从G1期进入S期，进而抑制细胞的增殖.
在本实验中还观察到，Emd和Tet合用时对HLF增殖的抑制作用与同浓度单独用药时有所增强，但无统计学上的差异. 总之，本研究结果表明，Emd和Tet均能明显抑制成纤维细胞的增殖，提示它们可能有良好的抗肝纤维化作用.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 郑永唐，贲昆龙. 测定细胞存活和增殖的MTT方法的建立. 免疫学杂志，1992；8：266-269
2 周远鹏，江京莉. 大黄的药理研究概述. 中药药理与临床，1991；7：41-48
3 陈家，吴中亮，杨晖，高宏光，冯健威，李乃明，丁宙. 大黄素对人肺癌，A-549细胞杀伤作用的研究. 中草药，1991；22：543-546
4 黎磊石，刘志红，张景红，姚建，杨俊伟，郑丰. 大黄延缓慢性肾衰的临床及实验研究. 中西医结合杂志，1991；11：392-396
5 郭丹杰，徐成斌，陈源源. 大黄素对血管平滑肌细胞增殖影响的实验研究. 中华内科杂志，1996；35：157-159
, http://www.100md.com
6 Liu ZH, Li LS, Hu WX, Zhou H. Effect of Emodin on c-myc proto-oncongen expression in cultured rat mesangial cells.
Acta Pharmacologica Sinica, 1996;17:61-63
7 王文俊，吴咸中，姚智，李会强，卢奕. 中药有效成分对IL-2及IFN-γ分泌的影响. 天津中医，1995；12：23-24
8 Clemens MT, Mcnurlan MA. Regulation of cell proliferation and differentiation by interferons. Biochem J, 1985;226:345-360
9 Hickie RA, Wei JW, Blyth LM, Wong DY, Klaassen DJ. Cations and calmodulin in normal and neoplastic cell growth regulation.
Can J Biochem Cell Biol, 1983;61:934-941, http://www.100md.com(卫新革1,2 陈颖伟1 展玉涛1 沈礼勇1 李定国1 陆汉明1)