当前位置: 首页 > 期刊 > 《世界华人消化杂志》 > 2000年第3期
编号:10696771
散发性结直肠癌46例微卫星不稳定性的研究
http://www.100md.com 2000年3月15日 《世界华人消化杂志》 2000年第3期
     1 中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所普外科 重庆市 400042

    2
中国人民解放军第三军医大学西南医院 重庆市 400038

    项目负责人
陈健 中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所普外科 重庆市 400042

    收稿日期 1999-07-14 接收日期 1999-08-20

    

    Subject headings
colorectal neoplasms; microsatellite instability; polymerase chain reaction
, http://www.100md.com
    主题词 结直肠肿瘤;微卫星不稳定性;聚合酶链反应

    结直肠癌可以分为遗传性的和非遗传的,遗传性结直肠癌有两种,一种是家族性腺瘤样息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP);另一种是遗传性非息肉样结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC). 非遗传性结直肠癌即为散发性结直肠癌. 近来研究表明,HNPCC和散发性结直肠癌的发生起因于DNA错配修复基因的缺陷,表现为微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI),是按复制错误(replication error, RER)途径进行的. 不同于癌基因和抑癌基因的杂合丢失(loss of heterozygosity, LOH)途径,是一种新的致癌机制. 本实验采用PCR方法了解MSI在散发性结直肠癌中的发生情况,旨在探讨国人中RER的发生率及MSI与散发性结直肠癌临床病理特征的关系.
, 百拇医药
    1 材料和方法

    1.1 材料
结直肠癌46例来源于第三军医大学大坪医院1998-11/1999-01手术切除的新鲜标本,同时收集每例相应的正常肠组织(切除肠管断端且病理证实为正常组织)共46对标本,置于液氮中保存备用. 其中男23例,女23例,年龄26岁~82岁,平均53.8岁. 右半结肠癌13例. 左半结肠癌15例,直肠癌18例. 按以下标准除外HNPCC患者[1]:①在一个家族的两代人中至少有三个成员患结肠癌. ②三个成员中至少有一个在50岁前发病. ③其中一个患者是另两个患者的第一级亲属,且家族性腺瘤样息肉病(FAP)应排除. 每例标本均首先取一部分行100mL/L甲醛固定24h. 常规包埋切片,行HE染色进行病理诊断.

    1.2 方法
, http://www.100md.com
    1.2.1 DNA的提取 DNA的提取采用消化液消化后,用25∶24∶1酚/氯仿/异戊醇提取[2].

    1.2.2 微卫星不稳定性的检测 ①引物准备:四个微卫星引物的位置和序列(表1). ②微卫星的扩增:扩增四个微卫星DNA用2400型PCR仪扩增(Perkin-Elmer公司),反应总体积为10μL,含有:1×PCR缓冲液(50mM KCl, 10mM Tris. 盐酸(pH 8.3),2.0mM MgCl2);200mM dNTP;25pmol引物;1.5U的Taq酶;0.25μg DNA;超纯水补足10μL. 循环参数为:94℃变性5min后再进循环;94℃ 30s,50℃~60℃ 40s,72℃ 40s. 35个循环后置于72℃继续反应10min. 取5μL扩增产物在15mL/L琼脂糖上,溴化乙啶染色,电泳证实成功后则重复以上步骤,同时另加0.75μ Ciα-32P dCTP重新扩增. 取5μL扩增产物与等量上样缓冲液(980mL/L甲酰胺,0.25mL/L二甲苯蓝和溴酚蓝,10mM EDTANa2)混合,95℃变性5min后快速冷却. 将上样液点入80mL/L的聚丙烯酰胺凝胶(含7M尿素)内电泳(恒功率60W)2h~4h后,用过滤纸揭胶并放入干胶器中干燥. 将干燥后的凝胶与X线片置于片夹中放入-80℃冰箱内行放射自显影14h~72h,洗片观察结果. ③MSI阳性的判定标准:与正常组织比较,结直肠癌有额外的DNA等位片段或等位片段出现泳动,即可判为阳性.
, 百拇医药
    统计学处理 采用χ2或四格表确切概率法及t检验进行统计学分析,P<0.05为相差显著,P<0.01为相差非常显著.

    2 结果

    2.1 散发性结直肠癌的MSI检出率 46例标本总的MSI检出率为21.7%(10/46). 其中表现2个位点以上的MSI定为RER(+),检出率为17.4%(8/46),有2例仅表现有一个位点的MSI. 在RER(+)病例中均表现有BAT-26位点的MSI. 各位点的MSI检出率见表2,结果判断见(图1).

    2.2 MSI与散发性结直肠癌的临床病理关系 HE染色发现病例均为腺癌,其中19例高分化,20例中等分化,7例低分化;24例有淋巴结转移,22例无淋巴结转移;25例浸及浆膜,21例未浸及浆膜. MSI的检出率与性别、年龄无相关. 右半结肠癌的MSI检出率为53.8%(7/13),显著高于左半结肠癌(13.3%,2/15)和直肠癌(5.6%,1/18)的MSI检出率(P<0.05). 低分化标本的MSI检出率为71.4%(5/7),显著高于高分化(15.8%,3/19)和中分化(10%,2/20)标本(P<0.01). MSI在有、无淋巴结转移和是否浸及浆膜的患者中的检出率无显著差别.
, http://www.100md.com
    1 BAT-26位点的MSI D2s123位点的MSI

    2 D17s261位点的MSI D17s799位点的MSI

    表1 四个位点的位置、序列和退火温度
引物位置序列退火温度
D2s1232p15-165'AAT GGA CAA AAA CAG GAT GCC 3'54℃
5'CCC TTT CTG ACT TGG ATA CC 3'
BAT-262p21-225' TGA CTA CTT TTG ACT TCA GCC 3’55℃
5'AAC CAT TCA ACA TTT TTA ACC C 3'
D17s26117p11.2-5' CAG GTT CTG TCA TAG GAC TA 3'56℃
125' TTC TGG AAA CCT ACT CCT GA 3'
D17s79917p12-5' ATT GCC AGC CGT CAC TTT 3'55℃
13.15' GAC CAG CAT ATC ATT ATA CTA CAA 3'

, http://www.100md.com
    表2 散发性结直肠癌各位点的微卫星不稳定性检出率
微卫星位点阳性(%)阴性(%)
D17s7994/46(8.7%)42/46(91.3%)
D2s1235/46(10.9%)41/46(89.1%)
D17s2615/46(10.9%)41/46(89.1%)
BAT-268/46(17.4%)38/46(82.6%)


    

    3 讨论

, http://www.100md.com
    3.1 散发性结直肠癌中MSI与RER的检测 散发性结直肠癌患者中MSI的检出率国外报道不一. 英国的Cawkwell et al[3]报道在对54例散发性结直肠癌的8个微卫星位点的检测中,MSI的检出率为22%;美国的Samowitz et al[4]对188例结直肠癌患者的10个位点的MSI检出率为16.5%. Yagci et al[5]分析了88个土尔其结直肠癌患者的5个微卫星位点,MSI发生率为9%,本文46例散发性结直肠癌中,MSI检出率21.7%,出现以上的差异性目前考虑有以下几个原因:①种族差异性. ②所选择的MSI位点及数目不同. ③病例选择标准不一,如是否含有HNPCC患者,是否随机选择等. 由于RER(+)比RER(-)的结肠癌有好的预后,并且RER(+)结肠癌的肿瘤基因形成与RER(-)结肠癌存在明显的不同,所以,RER(+)的分类具有实际和理论意义. 对于RER(+)的判断是通过MSI来判断的,但并非所有的MSI发生是错配修复基因突变引起的[6],所以将一个位点出现MSI的病例定为RER(+)是不能让人信服的,但到底应检测多少个位点,目前没有统一的标准,但在实际运用中,大多数研究者是在检测三个以上位点时,表现有两个以上位点的MSI的患者定为RER(+),而把那些表现有一个位点的不稳定性的患者确定为低频率微卫星不稳定性.
, http://www.100md.com
    BAT-26是一个(A)n重复序列,位于hMSH2基因中第Ⅴ个内含子中. 它在个体之间甚至不同个体之间均表现稳定,唯独在RER(+)的患者中出现不稳定性[7]. 本组将表现为两个位点(包括两个位点)以上的患者定为RER(+),为17.4%,有两例为低频率微卫星不稳定性. 同时发现RER(+)的病例均表现有BAT-26位点的MSI,故认为BAT-26是一种简便、快速的RER(+)判别方法.

    3.2 MSI与散发性结直肠癌临床病理参数的关系文献报道MSI与散发性结直肠癌患者的年龄有关系. Samowitz et al[4]发现MSI主要集中于那些年轻或年老患者中. 但本实验发现MSI与年龄不相关,提示微卫星不稳定性在不同种族、不同性别的发生率可能不同,同时发现MSI与有无淋巴结转移,有无侵及浆膜不相关. 提示MSI可能发生在肿瘤形成的初期,它促进了散发性结直肠癌的发展.
, 百拇医药
    我们发现右半结肠癌中MSI显著高于左半结肠癌及直肠癌,提示左、右半结肠癌的发生在基因水平上是不同的,既右半结肠癌的 发生主要是通过RER途径引起肿瘤相关基因的突变而引发肿瘤,而左半结肠癌的发生主要通过LOH途径引起癌基因和抑癌基因的突变而导致肿瘤的,说明MSI主要参予了右半结肠癌的发生过程.

    目前研究证实基因的变化将赋予结直肠癌特殊的病理特征. 本实验发现MSI与低分化明显相关,提示具有MSI的散发性结直肠癌的恶性程度较高. 但也有研究报道[8 ],具有MSI的散发性结直肠癌显示膨胀样生长方式,并用流式细胞仪检查发现具有MSI的散发性结直肠癌表现低增长活性,提示有良性倾向. 所以RER(+)患者在肿瘤生物学行为上表现出的恶性程度是高还是低,目前尚无定论. 这有待于进一步研究证实.

    
, http://www.100md.com
    4 参考文献


    1 Mecklin JP,Svendsen LB, Peltomaki P, Vasen HFA. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Scand J Gastroenterol,

    1994;29:673-677

    2 奥斯伯 F, 布伦特 R, 金斯顿 RE, 穆尔 DD,塞德曼 JG, 史密斯 JA,斯特拉尔 K. 精编分子生物学实验指南. 第1版. 北京:

    科学出版社,1998:35-36

    3 Cawkwell L, Li D, Lewis FA, Martin I, Dixon MF, Quirke P. Microsatellite instability in colorectal cancer: improved assessment
, http://www.100md.com
    using fluorescent polymerase chain reaction. Gastroenterology, 1995;109:465-471

    4 Samowitz WS, Slattery ML, Kerber RA. Microsatellite instability in human colonic cancer is not a useful clinical indicator of

    familial colorectal cancer. Gastroenterology, 1995;109:1765-1771

    5 Yagci T, Goksel S, Dogan O, Ozturk M, Yurdusev N. Genomic instability in colorectal cancers in turkey. 
, 百拇医药
    Int J Cancer, 1996;68:291-295

    6 Chung YJ, Park SW, Song JM, Lee KY, Seo EJ, Choi SW, Rhyu MG. Evidence of genetic progression in human gastric carcinomas

    with microsatellite instability. Oncogene, 1997;15:1719-1726

    7 Zhou XP, Hoang JM, Cottu P, Thomas G, Hamelin R. Allelic profiles of mononucleotide repeat microsaltellites in control individuals and

    in colorectal tumors with and without replication errors. Oncogene, 1997;15:1713-1718

    8 Parsons R, Myeroff LL, Liu B, Willson JK, Markowitz SD, Kinzler KW. Microsatellite instability and mutations of the transforming

    growth factor beta type Ⅱ receptor gene in colorectal cancer. Cancer Res, 1995;55:5548-5550, 百拇医药(陈 健1 顾红光1 林武华2 罗元辉2 )