蛋白酪氨酸激酶与一氧化氮合酶活性的变化 在胃粘膜损伤修复中的作用和意义
1 中国人民解放军第二军医大学国际合作生物信息传导研究中心
中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 上海市 200438
2 中国人民解放军第一军医大学南方医院全军消化内科研究所
项目负责人 曾锦章，200438，上海市长海路225号，东方肝胆外科医院.
收稿日期 1999-09-12 接收日期 1999-12-25
Subject headings protein tyrosine kinase; nitric oxide; nitric oxide synthase; gastric mucosa
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主题词 蛋白酪氨酸激酶；一氧化氮；一氧化氮合酶；胃粘膜
胃粘膜损伤后可迅速修复，及时维持了胃粘膜上皮的完整性，从而避免了损伤向深层发展，研究这一过程的分子机制对提高胃粘膜屏障以及防治胃粘膜病变具有重要的意义.
1 材料和方法
1.1 材料 ♂SD大鼠，体重220g～250g(第一军医大学动物所提供)，禁食24h，以20mmol/L去氧胆酸钠(DOC)4mL灌胃损伤胃粘膜(实验组)，用生理盐水作为对照(对照组). 胃粘膜损伤后30min，1h，3h，6h，12h，24h和48h取胃. 应用PTK抑制剂(Tyrphostin-51, 300μg·kg-1)于DOC灌胃前1h ip，以同样方法注射生理盐水作为对照，处理后3h取胃液和胃粘膜组织以备检测. 每组动物6只.
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1.2 方法 ①蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性检测：刮取胃粘膜，以5～10倍容积预冷新配制的组织匀浆缓冲液(10mmol/L HEPES，pH 7.2；150mmol/L NaCl; 1mmol/L Na3VO4；10μg/mL leupeptin; 1μg/mL aprotinin; 1mmol/L PMSF；1mmol/L 1，10-phenanthroline)进行匀浆，尼龙滤布过滤后，于4℃，30000g离心40min，上清液为胞质部分，沉淀为细胞膜粗提物. 以适量含0.1% Triton X-10匀浆缓冲液重悬沉淀，测定总蛋白含量(Protein assay kit, Bio-Rad公司产品)，调整总蛋白浓度为10mg/mL，分装后于-70℃保存备用. PTK活性的检测按照PTK kit(Promega公司产品)说明进行，参见Relan [1]. 反应体系25μL(8mmol/L盐酸咪唑，pH 7.3；8mmol/Lβ-巯基乙醇；0.2mmol/L EGTA；20mmol/L MgCl2； 1mmol/L MnCl2；0.1mg/mL BSA；0.1mmol/L Na3VO4；0.25mmol/L底物；20mmol/L ATP；0.74 kBq γ-32P-ATP 20μg膜组份)于30℃孵育15min，体系中以不加底物作为对照. 在反应体系中加入12.5μL 7.5mol/L盐酸胍终止反应，总体积37.5μL，置冰上5min，14000g离心5min，留上清. 取10μL上清液点于NC膜上，凉干后经洗膜处理，另取5μL点膜但不作洗膜处理. 洗膜过程为：2mol/L NaCl, 1×30s；2mol/L NaCl， 3×2min；2mol/L NaCl/1% H3PO4，4×2min；ddH2O，2×30s. NC膜于室温凉干30min，膜片入闪烁瓶，加5mL闪烁液进行闪烁计数(LS 6500型闪烁仪，美国Beckman公司产品). 每一样品设2个复管进行反应和检测，取其平均值进行分析. ②胃粘膜一氧化氮合酶(NOS)活性以及组织和胃液一氧化氮(NO)的检测；按实验设计处理动物，取材时先取胃液，然后用预冷PBS将胃粘膜洗涤干净，再取腺胃组织，于液氮速冻后转移至-70℃保存备用. 刮取胃粘膜，加9倍体积预冷的生理盐水作组织匀浆，3500g 离心10min，取上清，测总蛋白质含量，调整浓度为1mg/mL，分装后保存于-70℃以备用于组织NOS活性和NO水平的检测(试剂盒购于南京建成生物试剂公司). 胃液经3500g离心10min后取上清检测NO水平. 检测步骤按说明书以比色法进行. 每一样品设2个复管进行反应和检测，取其平均值进行结果分析.
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2 结果
20mmol/L DOC灌胃造成中度胃粘膜损伤、损伤后检测胃粘膜PTK活性和NOS活性，结果呈相似的时间依赖性变化. 损伤后30min均短暂下降，1h后均开始上升，3h上升至最大值，PTK活性、NOS活性、组织和胃液NO浓度的最大值较对照组分别上升了160.69%,118.5%,123.2%和130.15%(O均<0.01). 应用PTK特异性阻断剂tyrphostin-51，NOS活性、组织和胃液NO水平分别较对照组下降了25.4%，22.5%和19.3%. 结果见表1，2.
表1 胃粘膜损伤后蛋白酪氨酸激酶活性随时间变化比较
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a O<0.01，vs 0h组；bO<0.01， vs 0h组.
表2 不同阻断剂对NOS活性及NO合成水平的影响
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aP<0.01, vs 其余各组，bP<0.01vs 对照组.
3 讨论
胃粘膜在受到一定程度的损伤性刺激后，可启动快修复机制使胃粘膜迅速恢复其完整性，以避免损伤向深层发展，这是胃粘膜抵抗疾病的一种重要的屏障能力[1,2]. 胃粘膜快修复机制主要表现为损伤区周围或深部活细胞的迁移，由于不需要DNA的复制和蛋白质的合成，只需要对细胞内一系列功能蛋白质的适当修饰即可完成，因而是一种快速的反应，但这种机制仍不甚清楚[3-6]. 在胃粘膜损伤修复过程中，生长因子多肽参与其调节，而蛋白酪氨酸激酶(PTK)是生长因子受体胞内区行使信号传递的一个主墓δ懿糠郑其活性变化必然对胃粘膜修复具有重要影响，但其机制仍不清楚[2].
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本文结果表明，胃粘膜损伤后，PTK活性发生显著变化，而且这种变化主要发生于胃粘膜修复的早期. 损伤后30min呈短暂下降，可能是因为损伤性因素仍然大于修复性因素，1h后开始上升，并在3h内迅速达到峰值，提高的幅度为160.69%. 虽然在胃粘膜修复的中后期，PTK活性逐渐降低，但其活性较基础水平增高一直持续至48h，表明PTK可能参与胃粘膜完整性修复的整个过程. 而损伤后24h PTK活性二度增高可能是由于多种生长因子表达增加的结果. 这一时期PTK活性再度增高的主要作用可能是加速细胞增殖，可能还有促进分化的作用.
我们在胃粘膜组织匀浆中检测到NOS活性[7,8]，并且在胃粘膜中度损伤性刺激后可诱发NOS活性发生与PTK相似的变化，在损伤后的早期迅速提高，并且NO的合成增加. 组织NOS活性和NO以及胃腔内的NO水平在胃粘膜损伤后3h达到峰值，上升的幅度分别为118.5%，123.2%和130.15%，其增高的程度持续至损伤后24h.
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胃粘膜损伤后PTK和NOS活性呈现相似的变化规律，应用PTK选择性抑制剂使胃粘膜NOS活性、组织和胃液NO水平分别下降了25.4%，22.5%和19.3%. 表明PTK可能参与NO合成的调节. 但PTK激活后导致细胞内NOS活性变化的机制仍不清楚，推测PTK激活后导致细胞内Ca2+浓度增高可能是其重要的机制之一，因为细胞内Ca2+浓度增高是受体型PTK激活后细胞内第二信息传递者，而细胞内NOS活性的提高有赖于细胞内Ca2+浓度的增高[4,9]. NOS激活后合成NO增加，而NO反过来又对细胞内Ca2+浓度起负调控作用，因而生长因子受体的激活、NO的合成、以及Ca2+稳态组成细胞内信号传导的一个复杂的调节网络[4].
胃粘膜表达有多种生长因子多肽，而且有结构型NOS高表达，在胃粘膜损伤后，PTK和NO出现迅速的反应性变化，表明PTK和NO共同促进了损伤后胃粘膜上皮的快速修复. 由于PTK对NO的合成有一定的影响，PTK的作用可能在一定程度上通过影响NOS的活性以及NO合成而完成，但其深层机制有待进一步研究.
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4 参考文献
1 Relan NK, Fligiel SEG, Dutta S, Tureaud J, Chauhan DP, Majumdar APN. Indutction of EGF-receptor tyrosine kinase during
early reparative phase of gastric mucosa and effects of aging. Lab Invest, 1995;73:717-726
2 Playford RJ. Peptides and gastrointestinal mucosal integrity. Gut, 1995;37:595-597
3 Paimela H, Goddard PJ, William S. Present views on restitution of gastrointestinal epithelium. Dig Dis Sci, 1995;40:2495-2496
, http://www.100md.com
4 Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev,1991;43:109-142
5 Tepperman BL, Vozzolo BL, Soper BD. Effect of neutropenia on gastric mucosal integrity and mucosal nitric oxide synthesis in the
rat. Dig Dis Sci, 1993;38:2056-2061
6 Konturek SK, Konturek PC. Role of nitric oxide in the digestive system. Digestion, 1995;56:1-13
, 百拇医药
7 Andrews FJ, Malcontenti-Wilson C, O＇Brien PE. Protection against gastric ischemia-reperfusion injury by nitric oxide generators.
Dig Dis Sci, 1994;39:366-373
8 Coskun T, Yegen BC, Alican I, Peker O, Kurtel H. Cold restraint stress-induced gastric mucosal dysfunction: role of nitric oxide.
Dig Dis Sci, 1996;41:956-963
9 Gyires K. The role of endogenous nitric oxide in the gastroprotective action of morphine. Eur J Pharmacol, 1994;255:33-37, 百拇医药(曾锦章1 张万岱2 刘晓霞2 张振书2 张亚历2 周殿元2 )
中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 上海市 200438
2 中国人民解放军第一军医大学南方医院全军消化内科研究所
项目负责人 曾锦章，200438，上海市长海路225号，东方肝胆外科医院.
收稿日期 1999-09-12 接收日期 1999-12-25
Subject headings protein tyrosine kinase; nitric oxide; nitric oxide synthase; gastric mucosa
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主题词 蛋白酪氨酸激酶；一氧化氮；一氧化氮合酶；胃粘膜
胃粘膜损伤后可迅速修复，及时维持了胃粘膜上皮的完整性，从而避免了损伤向深层发展，研究这一过程的分子机制对提高胃粘膜屏障以及防治胃粘膜病变具有重要的意义.
1 材料和方法
1.1 材料 ♂SD大鼠，体重220g～250g(第一军医大学动物所提供)，禁食24h，以20mmol/L去氧胆酸钠(DOC)4mL灌胃损伤胃粘膜(实验组)，用生理盐水作为对照(对照组). 胃粘膜损伤后30min，1h，3h，6h，12h，24h和48h取胃. 应用PTK抑制剂(Tyrphostin-51, 300μg·kg-1)于DOC灌胃前1h ip，以同样方法注射生理盐水作为对照，处理后3h取胃液和胃粘膜组织以备检测. 每组动物6只.
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1.2 方法 ①蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性检测：刮取胃粘膜，以5～10倍容积预冷新配制的组织匀浆缓冲液(10mmol/L HEPES，pH 7.2；150mmol/L NaCl; 1mmol/L Na3VO4；10μg/mL leupeptin; 1μg/mL aprotinin; 1mmol/L PMSF；1mmol/L 1，10-phenanthroline)进行匀浆，尼龙滤布过滤后，于4℃，30000g离心40min，上清液为胞质部分，沉淀为细胞膜粗提物. 以适量含0.1% Triton X-10匀浆缓冲液重悬沉淀，测定总蛋白含量(Protein assay kit, Bio-Rad公司产品)，调整总蛋白浓度为10mg/mL，分装后于-70℃保存备用. PTK活性的检测按照PTK kit(Promega公司产品)说明进行，参见Relan [1]. 反应体系25μL(8mmol/L盐酸咪唑，pH 7.3；8mmol/Lβ-巯基乙醇；0.2mmol/L EGTA；20mmol/L MgCl2； 1mmol/L MnCl2；0.1mg/mL BSA；0.1mmol/L Na3VO4；0.25mmol/L底物；20mmol/L ATP；0.74 kBq γ-32P-ATP 20μg膜组份)于30℃孵育15min，体系中以不加底物作为对照. 在反应体系中加入12.5μL 7.5mol/L盐酸胍终止反应，总体积37.5μL，置冰上5min，14000g离心5min，留上清. 取10μL上清液点于NC膜上，凉干后经洗膜处理，另取5μL点膜但不作洗膜处理. 洗膜过程为：2mol/L NaCl, 1×30s；2mol/L NaCl， 3×2min；2mol/L NaCl/1% H3PO4，4×2min；ddH2O，2×30s. NC膜于室温凉干30min，膜片入闪烁瓶，加5mL闪烁液进行闪烁计数(LS 6500型闪烁仪，美国Beckman公司产品). 每一样品设2个复管进行反应和检测，取其平均值进行分析. ②胃粘膜一氧化氮合酶(NOS)活性以及组织和胃液一氧化氮(NO)的检测；按实验设计处理动物，取材时先取胃液，然后用预冷PBS将胃粘膜洗涤干净，再取腺胃组织，于液氮速冻后转移至-70℃保存备用. 刮取胃粘膜，加9倍体积预冷的生理盐水作组织匀浆，3500g 离心10min，取上清，测总蛋白质含量，调整浓度为1mg/mL，分装后保存于-70℃以备用于组织NOS活性和NO水平的检测(试剂盒购于南京建成生物试剂公司). 胃液经3500g离心10min后取上清检测NO水平. 检测步骤按说明书以比色法进行. 每一样品设2个复管进行反应和检测，取其平均值进行结果分析.
, 百拇医药
2 结果
20mmol/L DOC灌胃造成中度胃粘膜损伤、损伤后检测胃粘膜PTK活性和NOS活性，结果呈相似的时间依赖性变化. 损伤后30min均短暂下降，1h后均开始上升，3h上升至最大值，PTK活性、NOS活性、组织和胃液NO浓度的最大值较对照组分别上升了160.69%,118.5%,123.2%和130.15%(O均<0.01). 应用PTK特异性阻断剂tyrphostin-51，NOS活性、组织和胃液NO水平分别较对照组下降了25.4%，22.5%和19.3%. 结果见表1，2.
表1 胃粘膜损伤后蛋白酪氨酸激酶活性随时间变化比较
| 0h | 0.5h | 1h | 3h | |
| PTK pmol·mg蛋白·min-1 | 24.72±2.55 | 21.38±2.71 | 28.70±4.11 | 64.43±2.91a |
| NOS nmol·g蛋白-1·min-1 | 3.19±0.23 | 2.40±0.35b | 3.48±0.51 | 7.12±68a |
| 6h | 12h | 24h | 48h | |
| PTK pmol·mg蛋白·min-1 | 50.28±5.07a | 39.70±2.60a | 43.59±3.24a | 27.84±4.81 |
| NOS nmol·g蛋白-1 ·min-1 | 5.46±0.61a | 4.79±0.32a | 4.24±0.47a | 3.63±0.37 |
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a O<0.01，vs 0h组；bO<0.01， vs 0h组.
表2 不同阻断剂对NOS活性及NO合成水平的影响
| 分组 | NOS(nmol·g蛋白-1 ·min-1) | NO组织(nmol·mg蛋白-1 ·min-1) | NO胃液(μmol/L) |
| 对照组 | 3.12±0.53 | 9.31±1.68 | 181.39±19.24 |
| DOC组 | 6.89±0.51a | 19.60±2.88a | 394.79±22.13a |
| DOC+Tyrp组 | 5.14±0.37b | 15.19±2.35b | 318.78±26.48b |
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aP<0.01, vs 其余各组，bP<0.01vs 对照组.
3 讨论
胃粘膜在受到一定程度的损伤性刺激后，可启动快修复机制使胃粘膜迅速恢复其完整性，以避免损伤向深层发展，这是胃粘膜抵抗疾病的一种重要的屏障能力[1,2]. 胃粘膜快修复机制主要表现为损伤区周围或深部活细胞的迁移，由于不需要DNA的复制和蛋白质的合成，只需要对细胞内一系列功能蛋白质的适当修饰即可完成，因而是一种快速的反应，但这种机制仍不甚清楚[3-6]. 在胃粘膜损伤修复过程中，生长因子多肽参与其调节，而蛋白酪氨酸激酶(PTK)是生长因子受体胞内区行使信号传递的一个主墓δ懿糠郑其活性变化必然对胃粘膜修复具有重要影响，但其机制仍不清楚[2].
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本文结果表明，胃粘膜损伤后，PTK活性发生显著变化，而且这种变化主要发生于胃粘膜修复的早期. 损伤后30min呈短暂下降，可能是因为损伤性因素仍然大于修复性因素，1h后开始上升，并在3h内迅速达到峰值，提高的幅度为160.69%. 虽然在胃粘膜修复的中后期，PTK活性逐渐降低，但其活性较基础水平增高一直持续至48h，表明PTK可能参与胃粘膜完整性修复的整个过程. 而损伤后24h PTK活性二度增高可能是由于多种生长因子表达增加的结果. 这一时期PTK活性再度增高的主要作用可能是加速细胞增殖，可能还有促进分化的作用.
我们在胃粘膜组织匀浆中检测到NOS活性[7,8]，并且在胃粘膜中度损伤性刺激后可诱发NOS活性发生与PTK相似的变化，在损伤后的早期迅速提高，并且NO的合成增加. 组织NOS活性和NO以及胃腔内的NO水平在胃粘膜损伤后3h达到峰值，上升的幅度分别为118.5%，123.2%和130.15%，其增高的程度持续至损伤后24h.
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胃粘膜损伤后PTK和NOS活性呈现相似的变化规律，应用PTK选择性抑制剂使胃粘膜NOS活性、组织和胃液NO水平分别下降了25.4%，22.5%和19.3%. 表明PTK可能参与NO合成的调节. 但PTK激活后导致细胞内NOS活性变化的机制仍不清楚，推测PTK激活后导致细胞内Ca2+浓度增高可能是其重要的机制之一，因为细胞内Ca2+浓度增高是受体型PTK激活后细胞内第二信息传递者，而细胞内NOS活性的提高有赖于细胞内Ca2+浓度的增高[4,9]. NOS激活后合成NO增加，而NO反过来又对细胞内Ca2+浓度起负调控作用，因而生长因子受体的激活、NO的合成、以及Ca2+稳态组成细胞内信号传导的一个复杂的调节网络[4].
胃粘膜表达有多种生长因子多肽，而且有结构型NOS高表达，在胃粘膜损伤后，PTK和NO出现迅速的反应性变化，表明PTK和NO共同促进了损伤后胃粘膜上皮的快速修复. 由于PTK对NO的合成有一定的影响，PTK的作用可能在一定程度上通过影响NOS的活性以及NO合成而完成，但其深层机制有待进一步研究.
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4 参考文献
1 Relan NK, Fligiel SEG, Dutta S, Tureaud J, Chauhan DP, Majumdar APN. Indutction of EGF-receptor tyrosine kinase during
early reparative phase of gastric mucosa and effects of aging. Lab Invest, 1995;73:717-726
2 Playford RJ. Peptides and gastrointestinal mucosal integrity. Gut, 1995;37:595-597
3 Paimela H, Goddard PJ, William S. Present views on restitution of gastrointestinal epithelium. Dig Dis Sci, 1995;40:2495-2496
, http://www.100md.com
4 Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev,1991;43:109-142
5 Tepperman BL, Vozzolo BL, Soper BD. Effect of neutropenia on gastric mucosal integrity and mucosal nitric oxide synthesis in the
rat. Dig Dis Sci, 1993;38:2056-2061
6 Konturek SK, Konturek PC. Role of nitric oxide in the digestive system. Digestion, 1995;56:1-13
, 百拇医药
7 Andrews FJ, Malcontenti-Wilson C, O＇Brien PE. Protection against gastric ischemia-reperfusion injury by nitric oxide generators.
Dig Dis Sci, 1994;39:366-373
8 Coskun T, Yegen BC, Alican I, Peker O, Kurtel H. Cold restraint stress-induced gastric mucosal dysfunction: role of nitric oxide.
Dig Dis Sci, 1996;41:956-963
9 Gyires K. The role of endogenous nitric oxide in the gastroprotective action of morphine. Eur J Pharmacol, 1994;255:33-37, 百拇医药(曾锦章1 张万岱2 刘晓霞2 张振书2 张亚历2 周殿元2 )