Cyclin D1和P16蛋白在胃癌中的表达及其临床意义
1 延边大学医学院附属医院消化内科 吉林省延吉市 133000
2延边大学医学院病理生理教研室 吉林省延吉市 133000
项目负责人 金顺花延边大学医学院附属医院消化内科 吉林省延吉市 133000
收稿日期 1999-12-08 接收日期 2000-01-10
Subject headings stomach neoplasms; P16 protein; Cyclin D1
主题词 胃肿瘤; P16蛋白质; 细胞周期蛋白质D1
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 为本院1994/1997手术切除，病理确诊为胃癌72例，其中早期癌17例，中、晚期癌55例，72例癌旁组织中，包括肠上皮化生36例，不典型增生15例，正常上皮21例. 鼠抗人Cyclin D1单克隆抗体，兔抗人P16多克隆抗体，相应的生物素化二抗均购于北京中山公司，为美国Zymed公司产品.
1.2 方法 采用免疫组化链霉素亲生物素-辣根过氧化物酶法(SP法). 步骤如下：组织块按常规100mL/L中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成厚4μm切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PBS洗5min，微波抗原修复，PBS清洗，一抗(工作浓度Cyclin D1为1∶20，P16为1∶40)室温过夜，PBS洗5min，生物素标记二抗(1∶150)15min，PBS洗5min；SP(1∶150)15min，PBS洗5min；DAB显色5min～10min，自来水充分冲洗，苏木精复染、脱水、透明、封固. 每批实验用已知阳性切片做阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照. 结果判断：阳性细胞显棕黄或棕黑色，且强度高于本底.
, 百拇医药
统计学处理 采用χ2 检验和2×2交叉分类资料的χ2检验.
2 结果
2.1 Cyclin D1，P16蛋白在胃癌和癌旁组织中的表达 Cyclin D1，P16蛋白在胃癌组织中的阳性表达率分别与癌旁组织比较有非常显著性差异(P<0.01)，其中P16蛋白阳性表达在早期癌组明显低于中、晚期癌组(P<0.01)，癌旁不典型增生组明显低于癌旁正常上皮或肠上皮化生组(P<0.01)，Cyclin D1与之无关(P>0.05，表1).
表1 Cyclin D1，P16蛋白在胃癌和癌旁组织的表达(n=72，%)
, http://www.100md.com
aP<0.01 vs 癌旁组织；b P<0.01 vs 中、晚期癌；c P<0.01 vs 癌旁肠上皮化生或正常上皮.
2.2 Cyclin D1，P16蛋白的表达与胃癌生物学行为之间关系 胃癌中Cyclin D1，P16蛋白在高、中分化癌组的阳性表达率分别与低分化比较有显著性差异(P<0.01)，5例未分化癌中Cyclin D1均有表达，而P16蛋白均无表达；但均与肿瘤深度、淋巴结转移、远处转移无关(P>0.05，表2).
表2 Cyclin D1，P16蛋白表达与胃癌分化程度及PTNM分期的关系
, 百拇医药
aP<0.01 vs 低分化癌组织.
2.3 胃癌中Cyclin D1与P16蛋白的相互关系 胃癌中Cyclin D1与P16蛋白表达呈负相关(r=-0.59，表3).
表3 胃癌中Cyclin D1与P16蛋白表达之间的关系
, 百拇医药
r=-0.59.
2.4 胃癌中Cyclin D1和P16蛋白在组织中分布情况 P16蛋白主要在细胞浆，偶见细胞核着色；Cyclin D1分布在胞质.
3 讨论
细胞周期的调控异常导致细胞的增殖和凋亡失衡，是肿瘤发生的生物学基础[1,2]. Cyclin D1和P16作为两种细胞周期调控蛋白，在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用. p16基因是位于人类染色体9p16的抑癌基因，由3个外显子，2个内含子组成，其产物为15.84kDa的单链多肽，故称p16. 研究表明P16蛋白在胃癌组织中阳性表达率为45.83%，明显低于癌旁组织(P<0.01)，与张丹et al[3]报道一致. P16蛋白阳性表达率在早期胃癌组明显高于中、晚期胃癌组(P<0.01)，癌旁组织中不典型增生组明显低于癌旁正常上皮或肠上皮化生组(P<0.01)，提示P16基因缺失与胃癌的发生有关；低分化胃癌组明显低于高、中分化胃癌组(P<0.01)，但与肿瘤深度、淋巴结转移、远处转移无关，表明P16基因缺失可做为判断胃癌分化程度的一个参考指标，是胃癌发生中的较早事件，具有早期诊断价值. 其抑癌机制可能是P16蛋白特异性抑制CDK4活性，使之不能解除RB基因对转录因子的抑制，从而阻止细胞从G1期进入S期，启动细胞凋亡，防止突变积累、抑制肿瘤发生[4].p16基因小，仅为P53基因的1/4，操作方便，非常适合基因重组和导入，随着基因治疗的进步，p16基因治疗进入临床是很有可能的. P16只作用于CDK4，特异性强，可以模仿其作用原理，设计出直接调控细胞周期，诱导细胞凋亡的抗癌药.
, http://www.100md.com
编码Cyclin D1的基因CCND1基因定位于11q13，文献报道乳腺癌，食管癌和头颈部鳞状细胞癌有明显的Cyclin D1扩增和过表达. 我们结果显示，Cyclin D1在胃癌组织中阳性表达率为47.22%，明显低于癌旁组织(P<0.01)，表明Cyclin D1与胃癌发生有密切关系. 其机制可能是在G1期Cyclin D1与CDK4结合，使后者激活，活化的CDK4可使RB磷酸化，失去抑制E2F(细胞转录活化因子)的启动DNA合成作用，使细胞由G1→S期，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，而发生肿瘤[5]. Cyclin D1阳性表达率在高、中分化胃癌组明显低于低分化胃癌组(P<0.01)，但与肿瘤深度、淋巴结转移、远处转移无关，提示Cyclin D1异常表达可能是胃癌发生过程中的较早分子事件，可做为早期诊断，判断胃癌分化程度的一个参考指标.
Cyclin D1与P16蛋白表达呈负相关(r=-0.59). 目前认为P16失活或下调时，p16亦下调，CDK4被激活，随之RB蛋白的磷酸化，RB蛋白的抑制作用减弱，从而使P16蛋白代偿性增加，导致Cyclin D1活性下降，P16的激活与Cyclin D1的下调，又反过来使CDK4活性抑制. 因此RB，P16，Cyclin D1，CDK4共同组成一个反馈调节圈，调节细胞的生长周期. Cyclin D1激活CDK4的过程可通过P16，P21蛋白，与CDK4竞争性的结合而受到抑制，即P16 CDK4，P21 CDK4复合物不能使RB磷酸化，使RB正常地行使G1期停滞功能，从而启动细胞凋亡，抑制细胞增殖[6] . 通过检测Cyclin D1，P16，研究细胞周期调控与细胞凋亡、癌变之间的关系，不仅有助于提示肿瘤的发生机制，而且为肿瘤的诊断、防治可提供新的思维方法.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Sachs L, Lotem J. Control of programmed cell death in normal and lea kemic cells: nen implicatinos for therapy.
Blood, 1993;73:2013-2015
2 Del vecchio, Leoncini L, Buer ki K, Grutzner KU. Diffuse centrocytic and lor centroblastic malignant. Non-Hodg Kin＇s
Lymphomas: comparison of mitotic and pyknotic (apoptotic) indices. Int J Cancer,1991;47:381-382
3 张丹，王继红，姜彦多，刘晓波. 胃癌P16基因产物表达的研究.中华消化杂志，1997;17:178-179
4 崔玉芳，闫平. 肿瘤抑制基因与细胞凋亡. 国外医学生理、病理科学与临床分册，1997;17:157-160
5 郭德玉. 细胞周期调控与细胞癌变. 国外医学生理、病理科学与临床分册，1997；17：1-4
6 郭山春. 多肿瘤抑制基因与肿瘤. 国外医学生理、病理科学与临床分册，1997；17：160-162, http://www.100md.com(金顺花1 朴日龙2 金永日1 赵玉霞1 )
2延边大学医学院病理生理教研室 吉林省延吉市 133000
项目负责人 金顺花延边大学医学院附属医院消化内科 吉林省延吉市 133000
收稿日期 1999-12-08 接收日期 2000-01-10
Subject headings stomach neoplasms; P16 protein; Cyclin D1
主题词 胃肿瘤; P16蛋白质; 细胞周期蛋白质D1
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 为本院1994/1997手术切除，病理确诊为胃癌72例，其中早期癌17例，中、晚期癌55例，72例癌旁组织中，包括肠上皮化生36例，不典型增生15例，正常上皮21例. 鼠抗人Cyclin D1单克隆抗体，兔抗人P16多克隆抗体，相应的生物素化二抗均购于北京中山公司，为美国Zymed公司产品.
1.2 方法 采用免疫组化链霉素亲生物素-辣根过氧化物酶法(SP法). 步骤如下：组织块按常规100mL/L中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成厚4μm切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PBS洗5min，微波抗原修复，PBS清洗，一抗(工作浓度Cyclin D1为1∶20，P16为1∶40)室温过夜，PBS洗5min，生物素标记二抗(1∶150)15min，PBS洗5min；SP(1∶150)15min，PBS洗5min；DAB显色5min～10min，自来水充分冲洗，苏木精复染、脱水、透明、封固. 每批实验用已知阳性切片做阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照. 结果判断：阳性细胞显棕黄或棕黑色，且强度高于本底.
, 百拇医药
统计学处理 采用χ2 检验和2×2交叉分类资料的χ2检验.
2 结果
2.1 Cyclin D1，P16蛋白在胃癌和癌旁组织中的表达 Cyclin D1，P16蛋白在胃癌组织中的阳性表达率分别与癌旁组织比较有非常显著性差异(P<0.01)，其中P16蛋白阳性表达在早期癌组明显低于中、晚期癌组(P<0.01)，癌旁不典型增生组明显低于癌旁正常上皮或肠上皮化生组(P<0.01)，Cyclin D1与之无关(P>0.05，表1).
表1 Cyclin D1，P16蛋白在胃癌和癌旁组织的表达(n=72，%)
| n | P16阳性 n1(%) | Cyclin D1阳性 n2(%) | |
| 胃癌组织 | 72 | 33(45.83)a | 34(47.22)a |
| 早期 | 17 | 16(94.12)b | 5(29.41) |
| 中晚期 | 55 | 17(30.91) | 29(52.72) |
| 癌旁组织 | 72 | 52(72.22) | 14(19.44) |
| 正常上皮 | 21 | 19(90.47) | 2( 9.52) |
| 肠上皮化生 | 36 | 31(86.11) | 10(27.78) |
| 不典型增生 | 15 | 2(15.28)c | 2(15.28) |
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aP<0.01 vs 癌旁组织；b P<0.01 vs 中、晚期癌；c P<0.01 vs 癌旁肠上皮化生或正常上皮.
2.2 Cyclin D1，P16蛋白的表达与胃癌生物学行为之间关系 胃癌中Cyclin D1，P16蛋白在高、中分化癌组的阳性表达率分别与低分化比较有显著性差异(P<0.01)，5例未分化癌中Cyclin D1均有表达，而P16蛋白均无表达；但均与肿瘤深度、淋巴结转移、远处转移无关(P>0.05，表2).
表2 Cyclin D1，P16蛋白表达与胃癌分化程度及PTNM分期的关系
| n | P16阳性 n1(%) | Cyclin D1阳性 n2(%) | |
| 病理分级 | |||
| 高、中分化 | 36 | 24(66.67)a | 7(19.44)a |
| 低分化 | 31 | 9(40.91) | 22(70.97) |
| 未分化 | 5 | 0( 0.0) | 5(100.0) |
| 肿瘤深度 | |||
| T1～T2 | 33 | 15(45.45) | 14(42.42) |
| T3～T4 | 39 | 18(46.15) | 20(51.28) |
| 淋巴结转移 | |||
| N0 | 26 | 11(42.31) | 10(38.46) |
| N1～N2 | 46 | 22(47.83) | 24(52.17) |
| 远处转移 | |||
| M0 | 51 | 23(45.10) | 25(49.02) |
| M1 | 21 | 10(47.62) | 9(42.86) |
, 百拇医药
aP<0.01 vs 低分化癌组织.
2.3 胃癌中Cyclin D1与P16蛋白的相互关系 胃癌中Cyclin D1与P16蛋白表达呈负相关(r=-0.59，表3).
表3 胃癌中Cyclin D1与P16蛋白表达之间的关系
| Cyclin D1 | P16 | 合计 | |
| + | - | ||
| + | 5 | 29 | 34 |
| - | 28 | 10 | 38 |
| 合计 | 33 | 39 | 72 |
, 百拇医药
r=-0.59.
2.4 胃癌中Cyclin D1和P16蛋白在组织中分布情况 P16蛋白主要在细胞浆，偶见细胞核着色；Cyclin D1分布在胞质.
3 讨论
细胞周期的调控异常导致细胞的增殖和凋亡失衡，是肿瘤发生的生物学基础[1,2]. Cyclin D1和P16作为两种细胞周期调控蛋白，在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用. p16基因是位于人类染色体9p16的抑癌基因，由3个外显子，2个内含子组成，其产物为15.84kDa的单链多肽，故称p16. 研究表明P16蛋白在胃癌组织中阳性表达率为45.83%，明显低于癌旁组织(P<0.01)，与张丹et al[3]报道一致. P16蛋白阳性表达率在早期胃癌组明显高于中、晚期胃癌组(P<0.01)，癌旁组织中不典型增生组明显低于癌旁正常上皮或肠上皮化生组(P<0.01)，提示P16基因缺失与胃癌的发生有关；低分化胃癌组明显低于高、中分化胃癌组(P<0.01)，但与肿瘤深度、淋巴结转移、远处转移无关，表明P16基因缺失可做为判断胃癌分化程度的一个参考指标，是胃癌发生中的较早事件，具有早期诊断价值. 其抑癌机制可能是P16蛋白特异性抑制CDK4活性，使之不能解除RB基因对转录因子的抑制，从而阻止细胞从G1期进入S期，启动细胞凋亡，防止突变积累、抑制肿瘤发生[4].p16基因小，仅为P53基因的1/4，操作方便，非常适合基因重组和导入，随着基因治疗的进步，p16基因治疗进入临床是很有可能的. P16只作用于CDK4，特异性强，可以模仿其作用原理，设计出直接调控细胞周期，诱导细胞凋亡的抗癌药.
, http://www.100md.com
编码Cyclin D1的基因CCND1基因定位于11q13，文献报道乳腺癌，食管癌和头颈部鳞状细胞癌有明显的Cyclin D1扩增和过表达. 我们结果显示，Cyclin D1在胃癌组织中阳性表达率为47.22%，明显低于癌旁组织(P<0.01)，表明Cyclin D1与胃癌发生有密切关系. 其机制可能是在G1期Cyclin D1与CDK4结合，使后者激活，活化的CDK4可使RB磷酸化，失去抑制E2F(细胞转录活化因子)的启动DNA合成作用，使细胞由G1→S期，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，而发生肿瘤[5]. Cyclin D1阳性表达率在高、中分化胃癌组明显低于低分化胃癌组(P<0.01)，但与肿瘤深度、淋巴结转移、远处转移无关，提示Cyclin D1异常表达可能是胃癌发生过程中的较早分子事件，可做为早期诊断，判断胃癌分化程度的一个参考指标.
Cyclin D1与P16蛋白表达呈负相关(r=-0.59). 目前认为P16失活或下调时，p16亦下调，CDK4被激活，随之RB蛋白的磷酸化，RB蛋白的抑制作用减弱，从而使P16蛋白代偿性增加，导致Cyclin D1活性下降，P16的激活与Cyclin D1的下调，又反过来使CDK4活性抑制. 因此RB，P16，Cyclin D1，CDK4共同组成一个反馈调节圈，调节细胞的生长周期. Cyclin D1激活CDK4的过程可通过P16，P21蛋白，与CDK4竞争性的结合而受到抑制，即P16 CDK4，P21 CDK4复合物不能使RB磷酸化，使RB正常地行使G1期停滞功能，从而启动细胞凋亡，抑制细胞增殖[6] . 通过检测Cyclin D1，P16，研究细胞周期调控与细胞凋亡、癌变之间的关系，不仅有助于提示肿瘤的发生机制，而且为肿瘤的诊断、防治可提供新的思维方法.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Sachs L, Lotem J. Control of programmed cell death in normal and lea kemic cells: nen implicatinos for therapy.
Blood, 1993;73:2013-2015
2 Del vecchio, Leoncini L, Buer ki K, Grutzner KU. Diffuse centrocytic and lor centroblastic malignant. Non-Hodg Kin＇s
Lymphomas: comparison of mitotic and pyknotic (apoptotic) indices. Int J Cancer,1991;47:381-382
3 张丹，王继红，姜彦多，刘晓波. 胃癌P16基因产物表达的研究.中华消化杂志，1997;17:178-179
4 崔玉芳，闫平. 肿瘤抑制基因与细胞凋亡. 国外医学生理、病理科学与临床分册，1997;17:157-160
5 郭德玉. 细胞周期调控与细胞癌变. 国外医学生理、病理科学与临床分册，1997；17：1-4
6 郭山春. 多肿瘤抑制基因与肿瘤. 国外医学生理、病理科学与临床分册，1997；17：160-162, http://www.100md.com(金顺花1 朴日龙2 金永日1 赵玉霞1 )