免疫金层析试验快速检测血清HBsAg
中国人民解放军第四军医大学全军基因诊断技术研究所 陕西省西安市 710032
项目负责人 侯瑜中国人民解放军第四军医大学全军基因诊断技术研究所 陕西省西安市 710032
收稿日期 1999-12-08 接收日期 2000-01-05
Subject headings HBs surface antigen/analysis; antibody monoclonal; immunogold chromatography assay
主题词 乙型肝炎病毒表面抗原/分析；免疫金层析试验；抗体，单克隆
免疫金层析试验是20世纪90年代初在免疫渗滤技术[1]的基础上建立的一种快速简便的免疫检测技术. 我国有40%左右的人感染过乙型肝炎病毒，其中约有10%的人携带HBsAg，因而快速准确地检测和普查HBsAg，对于乙型肝炎的预防、诊断和治疗，具有极大的实用价值. 为此，我们研究建立了快速检测HBsAg的免疫金层析试验(GICA)，取得了较为满意的结果.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 氯金酸购于上海试剂一厂；免疫层析的材料由吸水玻璃纤维、吸附胶体金的玻璃纤维纸、硝酸纤维素薄膜和塑料支持物四部分构成；抗-HBs购于北京302医院；检测HBsAg诊断试剂国家参比品购于中国药品生物制品检定所；HBsAg酶免疫诊断试剂盒购于南京军事医科所；血清标本收集于西京医院检验科(经上海科华ELISA乙肝5项酶免试剂检测为乙肝者.
1.2 方法
1.2.1 胶体金的制备与抗-HBs的标记 参照Dar et al[2]方法制备，用超纯水将氯金酸配成2g/L，取该液100mL煮沸后加入10g/L柠蒙酸三钠水溶液2.5mL，继续煮沸8min，即为胶体金溶液. 标记抗-HBs时取胶体金溶液10mL，加K2CO3调pH至8.2，在冰浴环境中，磁力搅拌下逐滴加入单克隆抗-HBs 500μg，继续搅拌30min后，加入BSA至终浓度为10g/L，再继续搅拌15min，3000×g离心5min，弃沉淀，上清液再12000×g离心15min，小心吸弃上清液，沉淀加冻干保护液(含甘露醇、BSA等)溶解. 将溶液铺于吸水玻璃纤维上，放-20℃ 30min，然后冻干机上冷冻干燥3h，即成单克隆抗-HBs胶体金标记物.
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1.2.2 免疫层析检测卡的制备 在处理过的硝酸纤维素薄膜上，用点膜器将1g/L单克隆抗-HBs点成线状或带状，其包被体积为1.2μL/cm
作为检测线；在距检测线0.5mm的膜上，用1g/L的羊抗鼠IgG再划一条对照线. 用PBS漂洗2次，再用50g/L BSA封闭2h. 取出后再加蛋白稳定剂处理3min凉干. 在一长方形塑料支持物的中部贴上已包被的单克隆抗-HBs的硝酸纤维素薄膜，在其下端贴上吸附有胶体金标记物的玻璃纸，在此纸的上面覆盖一层玻璃纤维，在塑料支持物上端也贴上同样大小的玻璃纤维，其外面再覆盖一层带有颜色的铜板纸. 切成70mm×4mm条形的HBsAg检测卡.
1.2.3 试验方法 将检测卡的下端插入被检标本内约35s后取出，平放在桌面上3min～15min观察结果. 在硝酸纤维素膜上出现两条红线(检测线和对照线)者为阳性，仅出现一条线(对照线)为阴性，如无红色线条出现判为试剂有质量问题. 中和试验：取患者血清200μL加入单克隆抗-HBs 15μg，37℃ 2h，8000×g离心5min，将检测卡插入血清中，15min内观察结果. 重复性实验：随机选择HBsAg阳性血清30份和HBsAg阴性20份，重复检测3次，结果完全相符. 观察时间设定为3，5，10，15和30min，分析条带出现时间与乙肝5项指标的关系.
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 试剂盒的特异性及灵敏度 用免疫金层析法与ELISA法对比检测血清标本280份，结果可知若以ELISA检测HBsAg试剂盒作为参照标准，本法的特异性97%，灵敏性98%，总符合率97.5%(表1). 用卫生部检测HBsAg血清panel国家参考品考核本方法的准确性，灵敏度达1μg/L，其中特异性血清20份，除一份略显弱阳性外，全部为阴性，3份阳性参比血清本法检测均为阳性. 从而表明本法的特异性和阳性检出率是准确可靠的.
表1 GICA与ELISA检测结果比较
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2.2 中和试验和重复试验 ①随机抽取15份血清做中和试验，结果HBsAg阳性结果全部转阴，无一例出现阳性条带. ②ELISA阴性(HBsAg)而本法阳性的10份血清，有8份做中和试验后转为阴性，表明痉测的结果准确，且ELISA法也存在有漏检的问题. 随机抽取阳性血清30份和阴性血清20份做重复性试验，重复检测3次，结果完全相符.
2.3 观察结果的时间 乙型肝炎(HBsAg+，HBeAg+，抗HBc+)血清39份有35份在3min出现阳性结果，5min时全部阳性. 全部血清的结果观察在15min时与ELISA结果最相符. 30min时有极少阴性标本判读较困难. 因而判定结果以15min内为准，不能延长时间.
3 讨论
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我国约有1亿左右人口携带HBsAg，目前检测HBsAg多采用ELISA. ELISA虽具有特异性强，灵敏度高等优点，但操作较为复杂，时间相对较长，一般不做单份检测，并且需要检测仪器. 这对大型医院的门、急诊及县级以下医疗单位的实验检测是有困难的. 用胶体金免疫层析法检测HBsAg，该法集免疫反应与色谱层析之特点. 使待测样品的HBsAg与吸水纤维上的金标抗-HBs不断结合. 形成HBsAg-金标抗体复合物，再与硝酸纤维素膜作毛细泳动与膜上固相抗HBs结合，实际上对被测的物质起到了浓缩、聚集作用. 从而加快了反应速度，整个操作时间仅需3min～15min，其特性和敏感性不亚于ELISA，并具有操作简便，不需任何仪器和实验工具，可在任何地方及任何医疗单位包括个体诊所、家庭甚至自我检查都可应用的特点. 我国是乙型肝炎高发区，准确、快速的检测HBsAg，对于乙肝病毒感染的诊断、普查、疫苗的预防接种及流行病学调查等具有相当重要的应用价值和实际意义.
4 参考文献
1 周继文，戎广亚，杨守纯. 胶体金免疫层析法检测乙型肝炎病毒表面抗原. 中华医学检验杂志，1998；21：30-32
2 Dar Vs, Ghosh S, Broon S. Rapid detection of rotavirus by colloidal gold particles labeled with monoclonal antibody.
J Virol Methods, 1994;47:5-58, http://www.100md.com(侯 瑜 阎小君 韩锋产 郭晏海 李陕区 段 杰 冯永强 张 )
项目负责人 侯瑜中国人民解放军第四军医大学全军基因诊断技术研究所 陕西省西安市 710032
收稿日期 1999-12-08 接收日期 2000-01-05
Subject headings HBs surface antigen/analysis; antibody monoclonal; immunogold chromatography assay
主题词 乙型肝炎病毒表面抗原/分析；免疫金层析试验；抗体，单克隆
免疫金层析试验是20世纪90年代初在免疫渗滤技术[1]的基础上建立的一种快速简便的免疫检测技术. 我国有40%左右的人感染过乙型肝炎病毒，其中约有10%的人携带HBsAg，因而快速准确地检测和普查HBsAg，对于乙型肝炎的预防、诊断和治疗，具有极大的实用价值. 为此，我们研究建立了快速检测HBsAg的免疫金层析试验(GICA)，取得了较为满意的结果.
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1 材料和方法
1.1 材料 氯金酸购于上海试剂一厂；免疫层析的材料由吸水玻璃纤维、吸附胶体金的玻璃纤维纸、硝酸纤维素薄膜和塑料支持物四部分构成；抗-HBs购于北京302医院；检测HBsAg诊断试剂国家参比品购于中国药品生物制品检定所；HBsAg酶免疫诊断试剂盒购于南京军事医科所；血清标本收集于西京医院检验科(经上海科华ELISA乙肝5项酶免试剂检测为乙肝者.
1.2 方法
1.2.1 胶体金的制备与抗-HBs的标记 参照Dar et al[2]方法制备，用超纯水将氯金酸配成2g/L，取该液100mL煮沸后加入10g/L柠蒙酸三钠水溶液2.5mL，继续煮沸8min，即为胶体金溶液. 标记抗-HBs时取胶体金溶液10mL，加K2CO3调pH至8.2，在冰浴环境中，磁力搅拌下逐滴加入单克隆抗-HBs 500μg，继续搅拌30min后，加入BSA至终浓度为10g/L，再继续搅拌15min，3000×g离心5min，弃沉淀，上清液再12000×g离心15min，小心吸弃上清液，沉淀加冻干保护液(含甘露醇、BSA等)溶解. 将溶液铺于吸水玻璃纤维上，放-20℃ 30min，然后冻干机上冷冻干燥3h，即成单克隆抗-HBs胶体金标记物.
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1.2.2 免疫层析检测卡的制备 在处理过的硝酸纤维素薄膜上，用点膜器将1g/L单克隆抗-HBs点成线状或带状，其包被体积为1.2μL/cm
作为检测线；在距检测线0.5mm的膜上，用1g/L的羊抗鼠IgG再划一条对照线. 用PBS漂洗2次，再用50g/L BSA封闭2h. 取出后再加蛋白稳定剂处理3min凉干. 在一长方形塑料支持物的中部贴上已包被的单克隆抗-HBs的硝酸纤维素薄膜，在其下端贴上吸附有胶体金标记物的玻璃纸，在此纸的上面覆盖一层玻璃纤维，在塑料支持物上端也贴上同样大小的玻璃纤维，其外面再覆盖一层带有颜色的铜板纸. 切成70mm×4mm条形的HBsAg检测卡.
1.2.3 试验方法 将检测卡的下端插入被检标本内约35s后取出，平放在桌面上3min～15min观察结果. 在硝酸纤维素膜上出现两条红线(检测线和对照线)者为阳性，仅出现一条线(对照线)为阴性，如无红色线条出现判为试剂有质量问题. 中和试验：取患者血清200μL加入单克隆抗-HBs 15μg，37℃ 2h，8000×g离心5min，将检测卡插入血清中，15min内观察结果. 重复性实验：随机选择HBsAg阳性血清30份和HBsAg阴性20份，重复检测3次，结果完全相符. 观察时间设定为3，5，10，15和30min，分析条带出现时间与乙肝5项指标的关系.
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2 结果
2.1 试剂盒的特异性及灵敏度 用免疫金层析法与ELISA法对比检测血清标本280份，结果可知若以ELISA检测HBsAg试剂盒作为参照标准，本法的特异性97%，灵敏性98%，总符合率97.5%(表1). 用卫生部检测HBsAg血清panel国家参考品考核本方法的准确性，灵敏度达1μg/L，其中特异性血清20份，除一份略显弱阳性外，全部为阴性，3份阳性参比血清本法检测均为阳性. 从而表明本法的特异性和阳性检出率是准确可靠的.
表1 GICA与ELISA检测结果比较
| GICA | ELISA | 合计 | |
| + | - | ||
| + | 148 | 4 | 152 |
| - | 3 | 125 | 128 |
| 合计 | 151 | 129 | 280 |
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2.2 中和试验和重复试验 ①随机抽取15份血清做中和试验，结果HBsAg阳性结果全部转阴，无一例出现阳性条带. ②ELISA阴性(HBsAg)而本法阳性的10份血清，有8份做中和试验后转为阴性，表明痉测的结果准确，且ELISA法也存在有漏检的问题. 随机抽取阳性血清30份和阴性血清20份做重复性试验，重复检测3次，结果完全相符.
2.3 观察结果的时间 乙型肝炎(HBsAg+，HBeAg+，抗HBc+)血清39份有35份在3min出现阳性结果，5min时全部阳性. 全部血清的结果观察在15min时与ELISA结果最相符. 30min时有极少阴性标本判读较困难. 因而判定结果以15min内为准，不能延长时间.
3 讨论
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我国约有1亿左右人口携带HBsAg，目前检测HBsAg多采用ELISA. ELISA虽具有特异性强，灵敏度高等优点，但操作较为复杂，时间相对较长，一般不做单份检测，并且需要检测仪器. 这对大型医院的门、急诊及县级以下医疗单位的实验检测是有困难的. 用胶体金免疫层析法检测HBsAg，该法集免疫反应与色谱层析之特点. 使待测样品的HBsAg与吸水纤维上的金标抗-HBs不断结合. 形成HBsAg-金标抗体复合物，再与硝酸纤维素膜作毛细泳动与膜上固相抗HBs结合，实际上对被测的物质起到了浓缩、聚集作用. 从而加快了反应速度，整个操作时间仅需3min～15min，其特性和敏感性不亚于ELISA，并具有操作简便，不需任何仪器和实验工具，可在任何地方及任何医疗单位包括个体诊所、家庭甚至自我检查都可应用的特点. 我国是乙型肝炎高发区，准确、快速的检测HBsAg，对于乙肝病毒感染的诊断、普查、疫苗的预防接种及流行病学调查等具有相当重要的应用价值和实际意义.
4 参考文献
1 周继文，戎广亚，杨守纯. 胶体金免疫层析法检测乙型肝炎病毒表面抗原. 中华医学检验杂志，1998；21：30-32
2 Dar Vs, Ghosh S, Broon S. Rapid detection of rotavirus by colloidal gold particles labeled with monoclonal antibody.
J Virol Methods, 1994;47:5-58, http://www.100md.com(侯 瑜 阎小君 韩锋产 郭晏海 李陕区 段 杰 冯永强 张 )