幽门螺杆菌感染与胃癌和癌旁组织中MUC1和MUC6基因表达的关系
中国人民解放军第三军医大学西南医院消化科 重庆市 400038
本课题受全军“九五”医药卫生科研基金资助，No.96M091
项目负责人 汪荣泉中国人民解放军第三军医大学西南医院消化科 重庆市 400038
收稿日期 2000-01-14 接收日期 2000-02-08
Subject headings Helicobacter pylori/pathogenicity; gastritis; peptic ulcer; stomach neoplasms; gastric mucosa/injuries;
, 百拇医药
mucins; gene expression
主题词 螺杆菌，幽门/致病力；胃炎；消化性溃疡；胃肿瘤；胃粘膜/损伤；粘蛋白类；基因表达
汪荣泉,房殿春,刘为纹,罗元辉. 幽门螺杆菌感染与胃癌和癌旁组织中MUC1和MUC6基因表达的关系.
世界华人消化杂志，2000；8(5)：584-585
1 材料和方法
1.1 材料 正常胃粘膜10例取自胃癌手术切缘组织，经HE染色不存在癌组织及癌前病变，十二指肠组织2例取自胃癌切除标本的十二指肠部分；胃癌组织47例取自本院手术切除标本，其中39例含癌旁胃粘膜，29例含癌旁肠化粘膜；1例胃溃疡标本取自胃溃疡患者胃切除标本. 所有标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续切片，HE染色，病理确诊. 胃癌患者47例，男34例，女13例，年龄32岁～72岁，平均54.6岁. 抗MUC1核心肽的单克隆抗体BC1，BC2由墨尔本大学奥斯汀研究所的IAN FC Mckenzie教授和Xing博士[1]惠赠，抗MUC6核粘蛋白的多克隆抗体由西班牙巴塞罗那大学临床医学研究所的Carme De Bolos教授惠赠，前者以人乳脂球体膜(HMFGM)制备，后者以合成肽SFQTTTTYPTPSHPQTTLP免疫新西兰兔制备[2]. ABC试剂盒购自北京中山公司，SP试剂盒、DAB显色试剂盒、多聚赖氨酸购自福州迈新生物技术公司.
, 百拇医药
1.2 方法 Hp的染色按Warthin-Starry银染方法进行. 切片常规脱蜡至水，醋酸缓冲液洗片后，用10g/L硝酸银液37℃置3min，60℃温水洗两次后，醋酸缓冲液洗1次，切片脱水、透明、封片，油镜下观察. Hp的阳性判断标准：组织染成浅黄棕色后，胃粘膜的表面及粘膜的隐窝等处出现黑点状、穹曲杆状、短杆状物质则判为阳性，否则为阴性.
切片常规脱蜡、水化后，用内源性过氧化物酶阻断剂和正常马血清分别室温孵育30min，以减低非特异性染色；BC1，BC2、抗MUC6抗体(1∶100)4℃孵育过夜，生物素标记的二抗和抗生物素-过氧化物酶连接物室温分别孵育30min，DAB显色1min～3min，苏木素衬染、脱水、透明、封片，光镜观察. 实验中以空白试验和替代试验作为阴性对照，以确保实验的特异和可靠性.
统计学处理 各组数据采用χ2检验，P<0.05为相差显著，P<0.01为相差非常显著. 癌旁粘膜中MUC1，MUC6核粘蛋白表达强度分级：+++:强阳性，++：中等阳性，+：弱阳性.
, 百拇医药
2 结果
2.1 胃癌及癌旁组织中Hp的检测 胃癌和癌旁胃粘膜中只要其中之一出现Hp阳性染色，则认定该患者存在Hp感染. 46例胃癌患者中有Hp感染26例，占56.5%. 1例胃溃疡患者存在Hp感染，Hp主要位于胃粘膜的表面粘液层及粘膜的隐窝处，呈点状，弯曲短杆状的黑色影.
2.2 胃癌及癌旁粘膜中MUC1，MUC6核粘蛋白的表达 用BC1抗体检测MUC1核粘蛋白，结果显示：47例胃癌组织中MUC1核粘蛋白阳性表达29例，占63.0%，阳性染色胃癌细胞呈灶状或弥漫分布，抗原位于阳性癌细胞的胞质内，29例癌旁肠化粘膜标本中MUC1核粘蛋白阳性22例，占75.9%. 用BC2抗体检测MUC1核粘蛋白表达，结果显示：47例胃癌组织中MUC1核粘蛋白阳性表达38例，占82.6%，MUC1核粘蛋白在阳性癌细胞中亦以弥漫胞质为主，29例癌旁肠化粘膜标本中MUC1核粘蛋白阳性表达24例，占82.8%. 用抗MUC6合成肽抗体检测MUC6核粘蛋白，结果显示：47例胃癌组织中MUC6核粘蛋白阳性表达21例，占44.7%，抗原呈细颗粒状，位于癌细胞胞质内，29例癌旁肠化粘膜组织中MUC6核粘蛋白阳性4例(13.8%). 癌旁粘膜中MUC1和MUC6核粘蛋白的表达强弱不等，不同患者之间有明显区别.
, 百拇医药
2.3 胃癌患者Hp感染与胃癌及癌旁粘膜中MUC1，MUC6核粘蛋白表达的关系 胃癌患者Hp感染与胃癌组织中用BC1抗体所检测的MUC1核粘蛋白表达(P<0.05)和MUC6基因蛋白表达(P<0.01)密切相关(表1)，即胃癌患者Hp的感染可引起胃癌组织中MUC1，MUC6核粘蛋白表达的明显下调. 胃癌患者Hp感染可引起胃癌癌旁粘膜组织中用BC1抗体检测的MUC1核粘蛋白表达和MUC6核粘蛋白表达明显下调(P<0.05)(表2).
表1 Hp感染与胃癌组织中MUC1，MUC6基因表达的关系
, 百拇医药
aP<0.05 vs 阴性Hp感染, bP<0.01 vs 阴性Hp感染.
表2 Hp感染与癌旁粘膜组织中MUC1，MUC6核粘蛋白的表达
, 百拇医药
aP<0.05 vs 阴性Hp感染.
3 讨论
Hp导致慢性胃炎、消化性溃疡的机制非常复杂，与胃癌的发生可能存在一定的关联，目前认为Hp感染后产生尿素酶、磷脂酶、蛋白酶和细胞毒素等诸多有害物质引起炎症及免疫反应，损害胃粘膜上皮细胞，Hp感染后产氨损伤粘膜并可降低胃酸，使胃内寄生菌生长；Hp致炎可引致胃粘膜上皮细胞萎缩变性及增生过程中易产生DNA复制错误，随着时间的推移，DNA损伤可致恶性转化. 梁后杰等体外实验已证实Hp培养滤液可诱导胃粘膜细胞DNA损伤[3]. 本文报道胃癌及癌旁粘膜中Hp的检出率为56.5%，低于胃炎和溃疡病的检出率[4]，其原因可能是由于胃癌的发生改变了胃内微环境，不利于Hp继续生长或胃癌组织释放某种破坏因子使局部Hp破坏崩解.
, 百拇医药
相对于Hp这种胃粘膜破坏因子而言，胃粘膜存在胃粘膜保护屏障和胃粘液保护屏障，这两种屏障都涉及一群高度糖化的粘蛋白分子，其中包括MUC1基因所指导的膜相关性粘蛋白和MUC6基因所指导的分泌性粘蛋白. 对于揭示这对矛盾因素之间的关系对进一步明确Hp的致病机制、MUC1和MUC6核粘蛋白的功能和可能指导的抗Hp措施均具有一定的意义，本文经文献复习，未发现类似的文章报道.
我们用免疫组化方法检测了胃癌组织MUC1和MUC6核粘蛋白的表达，结果均提示癌组织中这些粘蛋白的核心骨架是下调表达，提示MUC1，MUC6两种核粘蛋白表达的改变涉及了胃癌的发生、发展. MUC1，MUC6基因在正常人胃粘膜表达主要起细胞保护、粘弹性维持、细胞识别，在肿瘤的发生中，其可能影响肿瘤细胞的粘附力、免疫识别和转移预后[5]. 所以本文的主要目的是揭示MUC1，MUC6核粘蛋白表达的异常是否与Hp的感染有关，这不仅对胃癌的发生有意义，并可指示慢性胃炎和溃疡病中Hp的致病意义.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Xing PX, Tjandra JJ, Stacker SA, The JG, Thompson CH, McLaughlin PJ, Mckenzie IFC. Monoclonal antibodies reactive with
mucin expressed in breast cancer. Immunol Cell Biol, 1989;67:183-195
2 Bolos CD, Garrido M, Real FX. MUC6 apomucin shows a distinct normal tissue distribution that correlates with lewis antigen expression
, 百拇医药
in the human stomach. Gastroenterology, 1995;109:723-734
3 梁后杰，刘为纹，房殿春. 幽门螺杆菌培养滤液诱导胃粘膜细胞DNA损伤. 中华消化杂志，1995;15(增刊):21-22
4 范平，程留芳，祝庆孚，胡益云. 幽门螺杆菌及ras癌基因与早期胃癌关系的研究. 中国肿瘤临床, 1996;23(增刊):179
5 Nakamori S, Ota DM, Cleary KR, Shirotani K. MUC1 mucin expression as a marker of progression and metastasis of human
colorectal carcinoma. Gastroenterology, 1994;106:353-361, 百拇医药(汪荣泉 房殿春 刘为纹 罗元辉)
本课题受全军“九五”医药卫生科研基金资助，No.96M091
项目负责人 汪荣泉中国人民解放军第三军医大学西南医院消化科 重庆市 400038
收稿日期 2000-01-14 接收日期 2000-02-08
Subject headings Helicobacter pylori/pathogenicity; gastritis; peptic ulcer; stomach neoplasms; gastric mucosa/injuries;
, 百拇医药
mucins; gene expression
主题词 螺杆菌，幽门/致病力；胃炎；消化性溃疡；胃肿瘤；胃粘膜/损伤；粘蛋白类；基因表达
汪荣泉,房殿春,刘为纹,罗元辉. 幽门螺杆菌感染与胃癌和癌旁组织中MUC1和MUC6基因表达的关系.
世界华人消化杂志，2000；8(5)：584-585
1 材料和方法
1.1 材料 正常胃粘膜10例取自胃癌手术切缘组织，经HE染色不存在癌组织及癌前病变，十二指肠组织2例取自胃癌切除标本的十二指肠部分；胃癌组织47例取自本院手术切除标本，其中39例含癌旁胃粘膜，29例含癌旁肠化粘膜；1例胃溃疡标本取自胃溃疡患者胃切除标本. 所有标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续切片，HE染色，病理确诊. 胃癌患者47例，男34例，女13例，年龄32岁～72岁，平均54.6岁. 抗MUC1核心肽的单克隆抗体BC1，BC2由墨尔本大学奥斯汀研究所的IAN FC Mckenzie教授和Xing博士[1]惠赠，抗MUC6核粘蛋白的多克隆抗体由西班牙巴塞罗那大学临床医学研究所的Carme De Bolos教授惠赠，前者以人乳脂球体膜(HMFGM)制备，后者以合成肽SFQTTTTYPTPSHPQTTLP免疫新西兰兔制备[2]. ABC试剂盒购自北京中山公司，SP试剂盒、DAB显色试剂盒、多聚赖氨酸购自福州迈新生物技术公司.
, 百拇医药
1.2 方法 Hp的染色按Warthin-Starry银染方法进行. 切片常规脱蜡至水，醋酸缓冲液洗片后，用10g/L硝酸银液37℃置3min，60℃温水洗两次后，醋酸缓冲液洗1次，切片脱水、透明、封片，油镜下观察. Hp的阳性判断标准：组织染成浅黄棕色后，胃粘膜的表面及粘膜的隐窝等处出现黑点状、穹曲杆状、短杆状物质则判为阳性，否则为阴性.
切片常规脱蜡、水化后，用内源性过氧化物酶阻断剂和正常马血清分别室温孵育30min，以减低非特异性染色；BC1，BC2、抗MUC6抗体(1∶100)4℃孵育过夜，生物素标记的二抗和抗生物素-过氧化物酶连接物室温分别孵育30min，DAB显色1min～3min，苏木素衬染、脱水、透明、封片，光镜观察. 实验中以空白试验和替代试验作为阴性对照，以确保实验的特异和可靠性.
统计学处理 各组数据采用χ2检验，P<0.05为相差显著，P<0.01为相差非常显著. 癌旁粘膜中MUC1，MUC6核粘蛋白表达强度分级：+++:强阳性，++：中等阳性，+：弱阳性.
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2 结果
2.1 胃癌及癌旁组织中Hp的检测 胃癌和癌旁胃粘膜中只要其中之一出现Hp阳性染色，则认定该患者存在Hp感染. 46例胃癌患者中有Hp感染26例，占56.5%. 1例胃溃疡患者存在Hp感染，Hp主要位于胃粘膜的表面粘液层及粘膜的隐窝处，呈点状，弯曲短杆状的黑色影.
2.2 胃癌及癌旁粘膜中MUC1，MUC6核粘蛋白的表达 用BC1抗体检测MUC1核粘蛋白，结果显示：47例胃癌组织中MUC1核粘蛋白阳性表达29例，占63.0%，阳性染色胃癌细胞呈灶状或弥漫分布，抗原位于阳性癌细胞的胞质内，29例癌旁肠化粘膜标本中MUC1核粘蛋白阳性22例，占75.9%. 用BC2抗体检测MUC1核粘蛋白表达，结果显示：47例胃癌组织中MUC1核粘蛋白阳性表达38例，占82.6%，MUC1核粘蛋白在阳性癌细胞中亦以弥漫胞质为主，29例癌旁肠化粘膜标本中MUC1核粘蛋白阳性表达24例，占82.8%. 用抗MUC6合成肽抗体检测MUC6核粘蛋白，结果显示：47例胃癌组织中MUC6核粘蛋白阳性表达21例，占44.7%，抗原呈细颗粒状，位于癌细胞胞质内，29例癌旁肠化粘膜组织中MUC6核粘蛋白阳性4例(13.8%). 癌旁粘膜中MUC1和MUC6核粘蛋白的表达强弱不等，不同患者之间有明显区别.
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2.3 胃癌患者Hp感染与胃癌及癌旁粘膜中MUC1，MUC6核粘蛋白表达的关系 胃癌患者Hp感染与胃癌组织中用BC1抗体所检测的MUC1核粘蛋白表达(P<0.05)和MUC6基因蛋白表达(P<0.01)密切相关(表1)，即胃癌患者Hp的感染可引起胃癌组织中MUC1，MUC6核粘蛋白表达的明显下调. 胃癌患者Hp感染可引起胃癌癌旁粘膜组织中用BC1抗体检测的MUC1核粘蛋白表达和MUC6核粘蛋白表达明显下调(P<0.05)(表2).
表1 Hp感染与胃癌组织中MUC1，MUC6基因表达的关系
| Hp感染 | n | MUC1(BC1) | MUC1(BC2) | MUC6 | |||
| + | - | + | - | + | - | ||
| 阳性 | 26 | 13a | 13 | 21 | 5 | 10b | 16 |
| 阴性 | 20 | 16 | 4 | 17 | 3 | 16 | 4 |
, 百拇医药
aP<0.05 vs 阴性Hp感染, bP<0.01 vs 阴性Hp感染.
表2 Hp感染与癌旁粘膜组织中MUC1，MUC6核粘蛋白的表达
| Hp感染 | n | MUC1(BC1) | MUC1(BC2) | MUC6 | |||
| +++ | ++～+ | +++ | ++～+ | +++ | ++～+ | ||
| 阳性 | 21 | 7a | 14 | 11 | 10 | 7a | 14 |
| 阴性 | 16 | 12 | 4 | 10 | 6 | 11 | 5 |
, 百拇医药
aP<0.05 vs 阴性Hp感染.
3 讨论
Hp导致慢性胃炎、消化性溃疡的机制非常复杂，与胃癌的发生可能存在一定的关联，目前认为Hp感染后产生尿素酶、磷脂酶、蛋白酶和细胞毒素等诸多有害物质引起炎症及免疫反应，损害胃粘膜上皮细胞，Hp感染后产氨损伤粘膜并可降低胃酸，使胃内寄生菌生长；Hp致炎可引致胃粘膜上皮细胞萎缩变性及增生过程中易产生DNA复制错误，随着时间的推移，DNA损伤可致恶性转化. 梁后杰等体外实验已证实Hp培养滤液可诱导胃粘膜细胞DNA损伤[3]. 本文报道胃癌及癌旁粘膜中Hp的检出率为56.5%，低于胃炎和溃疡病的检出率[4]，其原因可能是由于胃癌的发生改变了胃内微环境，不利于Hp继续生长或胃癌组织释放某种破坏因子使局部Hp破坏崩解.
, 百拇医药
相对于Hp这种胃粘膜破坏因子而言，胃粘膜存在胃粘膜保护屏障和胃粘液保护屏障，这两种屏障都涉及一群高度糖化的粘蛋白分子，其中包括MUC1基因所指导的膜相关性粘蛋白和MUC6基因所指导的分泌性粘蛋白. 对于揭示这对矛盾因素之间的关系对进一步明确Hp的致病机制、MUC1和MUC6核粘蛋白的功能和可能指导的抗Hp措施均具有一定的意义，本文经文献复习，未发现类似的文章报道.
我们用免疫组化方法检测了胃癌组织MUC1和MUC6核粘蛋白的表达，结果均提示癌组织中这些粘蛋白的核心骨架是下调表达，提示MUC1，MUC6两种核粘蛋白表达的改变涉及了胃癌的发生、发展. MUC1，MUC6基因在正常人胃粘膜表达主要起细胞保护、粘弹性维持、细胞识别，在肿瘤的发生中，其可能影响肿瘤细胞的粘附力、免疫识别和转移预后[5]. 所以本文的主要目的是揭示MUC1，MUC6核粘蛋白表达的异常是否与Hp的感染有关，这不仅对胃癌的发生有意义，并可指示慢性胃炎和溃疡病中Hp的致病意义.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Xing PX, Tjandra JJ, Stacker SA, The JG, Thompson CH, McLaughlin PJ, Mckenzie IFC. Monoclonal antibodies reactive with
mucin expressed in breast cancer. Immunol Cell Biol, 1989;67:183-195
2 Bolos CD, Garrido M, Real FX. MUC6 apomucin shows a distinct normal tissue distribution that correlates with lewis antigen expression
, 百拇医药
in the human stomach. Gastroenterology, 1995;109:723-734
3 梁后杰，刘为纹，房殿春. 幽门螺杆菌培养滤液诱导胃粘膜细胞DNA损伤. 中华消化杂志，1995;15(增刊):21-22
4 范平，程留芳，祝庆孚，胡益云. 幽门螺杆菌及ras癌基因与早期胃癌关系的研究. 中国肿瘤临床, 1996;23(增刊):179
5 Nakamori S, Ota DM, Cleary KR, Shirotani K. MUC1 mucin expression as a marker of progression and metastasis of human
colorectal carcinoma. Gastroenterology, 1994;106:353-361, 百拇医药(汪荣泉 房殿春 刘为纹 罗元辉)