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编号:10696854
幽门螺杆菌尿素酶依赖性试验
http://www.100md.com 2000年5月15日 《世界华人消化杂志》 2000年第5期
    

    Subject headings Helicobacter pylori; urease; breath tests; indicators and reagents; reagent kits, diagnostic; gastroscopy

    主题词 螺杆菌，幽门；尿素酶；呼吸试验；指示剂和试剂；试剂盒，诊断；胃镜检查

    黄跃,许鲁宁. 幽门螺杆菌尿素酶依赖性试验. 世界华人消化杂志，2000；8(5)：549-550

    幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是人类最常见的一种致病菌[1]，是慢性胃炎和消化性溃疡的重要致病因素之一，并且与胃癌的发生密切相关[2]，世界卫生组织国际癌症研究机构已将该菌纳入第一类致癌原，因此，Hp日益受到各国学者的高度重视. Hp的重要生物学特征之一是含有丰富及高活性的尿素酶[3]. 目前临床对Hp感染的诊断主要是利用Hp的这一特性. 现就Hp尿素酶依赖性试验进行评价.
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    1 尿素酶试验

    1984年Langenberg发现Hp能够产生大量的尿素酶[4]，该酶具有很高的酶活性，Hp产生的尿素酶活性相当于奇异变形杆菌的2倍，尿素酶阳性肠道菌的7倍，对Hp具有自身保护作用，它水解尿素，生成氨和二氧化碳，氨能在Hp菌体周围形成一层“氨云”，对抵御胃酸的杀菌作用具有重要意义. 基于这种特性，尿素酶活性的测定可以作为Hp的快速诊断方法.

    1.1 pH指示剂法 该法是目前临床上较常用的，试剂中含尿素和pH指示剂(如酚红)，从胃内取出的组织活检标本通常呈酸性，pH<6.0，一般情况下试剂颜色不变，如果胃内有Hp感染，当标本放入试剂中，Hp所产生的尿素酶则分解尿素产生氨，使pH值升高，导致指示剂酚红变为粉红色. 1986年西澳大利亚Delta West公司研制了商品化的CLOtest，将尿素、酚红、叠氮钠(防腐剂)和琼脂用磷酸缓冲液制成半固体胶粒，密封于有机玻璃板的凹孔内，试验时取胃粘膜活检标本一块植入胶粒内，置室温下观察24h. 此法特异性为95%～100%，敏感性为86%～98%[5]. Marshall et al报道敏感性在20min为75%，3h为92%[6]. 1988年Arvind报道了1min尿素酶试验，用无离子水配制100g/L尿素溶液，分装在小管内，每管为1mL加入10g/L的酚红2滴，pH 6.8，1min看结果，未见假阳性，敏感性为91%. 现国内大部分已应用此方法进行Hp感染的诊断，如深圳爱利国医学科学开发有限公司生产的1min尿素酶试验试剂及兰州军医卫校生产的尿素酶试验反应板. 此类试剂由于反应时间很短，避免了产生尿素酶的污染菌繁殖所致的假阳性，但因为尿素浓度很高，在水溶液中极易自然水解，无离子水无缓冲作用，pH稍微升高即可引起指示剂变色，在提高敏感性的同时是否会引起假阳性率升高，有待进行更多的病例观察.
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    1.2 分析化学法 福建三强生化有限公司生产的HpUT试剂盒属于这种方法. 是采用分析化学原理检测Hp尿素酶的最终产物，由于阳性显色反应不是取决于试剂中pH改变，可以避免一些影响pH的因素所致的假阳性，敏感性99%，特异性为100%，该试剂盒的特点是可半定量指示Hp感染的程度(+,++,+++,++++)，由于是将尿素制成颗粒状，干燥保存，临用时植入半固体中，在室温下保存时间可达1a. 观察时间为5min[7]. 快速尿素酶试验作为内镜检查中快速开展的检验项目，方法简便实用，快速灵敏，特别适合于在基层单位开展，应用本法诊断Hp感染的准确性可达90%以上，缺点是有一定的假阴性和假阳性，且不能用于治疗后疗效判断，试剂质量不稳定或观察时间不够长可严重影响结果判断.

    2 呼吸试验

    由于Hp在体内产生大量的尿素酶，因此若给感染Hp的患者口服同位素标记的尿素溶液，则尿素分解后产生同位素标记的CO2从肺呼出，可收集呼气样品，用气体同位素质谱仪或用液体闪烁计数器检测同位素CO2的量，根据标记物不同，分为13C呼吸试验及14C呼吸试验.
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    2.1 13C呼吸试验 1987年Graham et al[8]首先报道了13C-尿素呼吸试验诊断Hp感染，受试者口服13C-尿素5mg/kg，随后每10min收集一次呼气标本，连续3h. 收集的气体标本用质谱仪分析，计算CO2含量. 对26例患者同时进行呼吸试验，细菌培养和Warthin-Starry银染色检查3种方法的结果安全符合；经抗菌治疗清除Hp以后，呼吸试验也转为阴性. 13C尿素呼气试验的检查要求受检查者在空腹状态下进行，并在整个检查过程中保持安静(坐、卧位均可)的状态. 具体试验步骤如下[9]：①口服一杯试验餐(约120mL)；②收集零时的呼气；③口服13C-尿素，并开始计时(剂量：成人为100mg，13C丰度>99%；儿童：12岁以下，60mg，13C丰度>99%)；④收集10，20，30，40和50min时的呼气. 在采用简便方法时，仅收集30min时的呼气；⑤样品分析.13C尿素呼气试验采用了稳定同位素以及质谱学等技术，不仅具有准确、特异、快捷的特点，而且根据国内及国际报道，该方法的灵敏度和特异性都在95%左右. 检查时，受检者无痛苦、无创伤、无放射性损伤，十分受临床的欢迎. 但13CO2的测定较为复杂，需用质谱仪，费用昂贵，在多数医院尚不能开展.
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    2.2 14C-呼吸试验 为了克服 13C-呼吸试验操作复杂、费用昂贵的缺点，1988年Marshall et al[10]建立了无创性14C-呼吸试验，其仅需价廉的液体闪烁计数仪，操作简单，诊断Hp感染同样具有高度的敏感性和特异性，故国外已普遍开展，此法也是让患者服用14C-尿素110kBq～400kBq，收集气体的时间一般从30min～2h，敏感性89%～100%，特异性达92%～94%. 但14C属放射性同位素，物理T1/2很长，然而，其进入胃内后72h内几乎全部被代谢和排出体外，为了降低14C-尿素呼气试验，加大氢氧化海胺(CO2吸收剂)用量[11]，仍然获得同样高的敏感性和特异性，这不仅减少了患者同位素负荷和经济负担，而且消除了口腔尿素酶的干扰，还减少了环境污染的可能性，其辐射量仅为一次胃肠钡餐量的1/500，相当于自然环境24h的暴露量[9]，具有极高的安全性.
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    胶囊微量法14C-尿素呼气试验的具体步骤是：患者禁食6h以上，用温水送服整粒14C-尿素胶囊一粒，然后静坐20min后，通过吹气导管向盛有CO2吸收剂的闪烁瓶内徐徐吹气，直至液体由紫红色变为无色透明时停止吹气即采样完毕. 样品测定：向样品液闪瓶内加入闪烁剂4.5mL，用14C-液体闪烁计数仪计数2min，得出每分钟计数(dpm)，减去本底样品dpm，再除以厂家提供的校正系数，即得出样品每分钟衰变数(dpm).

    3 15N-尿氨排出试验

    吴继琮et al[12]根据15N可以国产这一条件，设计了15N-尿氨排出试验. 其原理基本与标记碳的CO2呼气试验相同，即用15N-尿素供被测者口服，在胃中经Hp的尿素酶作用后，分解成标记的15NH3和未标记的CO2，同样经消化道吸收后进入血液循环，而15N标记的氨则随着机体代谢产物氨、尿素等一起由肾脏排出，采集尿液标本，然后取尿标本作预处理后，即可上色质联用仪检测，并计算出2h内15N-尿氨排出率.
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    15N-尿氨排出试验是一种非侵袭性的、无放射性的、有一定定量意义的，敏感性与特异性均极高的Hp感染体内诊断试验，但因其需价格昂贵的设备，一般医院都无力添置，阻碍该方法的普及及推行.

    

    4 参考文献

    1 Guisset M, Cotot Rey P, Debonne JM. Helicobacter pylori infection in developing countries. Med Trop (Mars), 1997;57:77-82

    2 Bjorkholm B, Befrits R, Jaup B, Engstrand L. Rapid PCR detection of Helicobacter pylori—associated virulence and resistance
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    gene directly from gastric biopsy material. J Clin Microbiol, 1978;36:3689-3690

    3 Hawtin PR, Stacey AR, Newcli DG. Investigation of the structure and localization of the urease of Helicobacter pylori

    using monoelonal antibodies. J Gene Microbiol, 1990;136:1995-2000

    4 Williams CL. Helicobacter pylori: bacteriology and laboratory diagnosis. J Infect, 1997;34:1-5
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    5 Megraud F. Comparison of different tests for Campylobacter pylori. Scand J Gastroenterol, 1988;23(Suppl 142):64-68

    6 Marshall BJ, Warren JR, Francis GJ, Langton SR, Good win CS, Blincow E. Rapid urease test in the management of 

    Campylobact pyloridis—associated gastritis. Am J Gastroenterol, 1987;92:200-210

    7 徐朝斌. 快速检测胃幽门弯曲菌感染： CPUT试剂盒的临床应用. 中华消化杂志，1989；9：248
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    8 Graham DY, Klein PD, Evans DJ, Evans DG, Alpert LC, Opekun AR. Campylobacter pylori detected noninvasively by 

    13C-urea breath test. Lancet, 1987;23:1174-1175

    9 胡伏莲，周殿元，贾博琦. 幽门螺杆菌感染的基础与临床. 第1版. 北京：中国科学技术出版社，1997：339-347

    10 Marshall BJ, Surveyor I. Carban-14 urea breath test for the diagnosis of Campylobacter pylori associated gastritis. 
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    J Nucl Med, 1988;29:11-14

    11 Raju GS, Smith MJ, Morton DM Sc, Bardhan KD. Mini-dose (1hg ci) 14C-urea breath test for the detection of Helicobacter pylori.

    Am J Gastroenterol, 1994;89:1027-1031

    12 Wu JC, Liu GL, Zhang ZH. 15NH-4 excretion test: a new method for detection of Helicobacter pylori infection. 

    J Clin Microbiol, 1992;30:181-184, 百拇医药(黄 跃 许鲁宁)