端粒酶在原发性肝癌中的表达
1中国人民解放军北京军区总院肝病研究所 北京市 100070
2 中国医学科学院肿瘤医院
项目负责人 范公忍中国人民解放军北京军区总院肝病研究所 北京市 100070
收稿日期 2000-01-23 接收日期 2000-02-02
Subject headings liver neoplasms; telomerase; tumor markers, biological; carcinoma,hepatocellular/pathology;
hepatitis, B virus; expression
, 百拇医药
主题词 肝肿瘤；端粒酶；肿瘤标记，生物学；癌，肝细胞/病理学；乙型肝炎病毒；表达
范公忍,汪毅,邬光惠,黄苏里. 端粒酶在原发性肝癌中的表达. 世界华人消化杂志，2000；8(5)：573
1 材料和方法
1.1 材料 手术切除PHC 38例，男26例，女12例，年龄32岁～71岁，平均47.4岁，术前均未放疗，标本均于离体后数小时内采集，液氮速冻后，转至-80℃冰箱贮存备用，所有病例均经病理证实.
1.2 方法 端粒酶提取：每例标本取原发性肝癌及癌旁组织各100mg，置组织研蘑器内研成粉沫，再转至1.5mL小管中，立即加入预冷的裂解液200μL(10mmol/L Tris-Hcl PH7.5)；1mmol/L MgCl2；1mmol/L DTT，1mmol/L EGTA，5mmol/L二硫基乙醇，5g/L CHAPS，100mL/L甘油混均后30min 0℃裂解，4℃离心30min，吸取上清进行蛋白质含量测定，置-80℃冰箱冻存. 端粒酶检测：采用TRAP法检测端粒酶活性，反应体积25μL，反应体系含20mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，MgCl2 1mmol/L，KCl 63mmol/L，0.005g/L Tween 20，1mmol/L EGTA，50mmol/L dNTP，T4基因32蛋白1μg，双乙酰胺BSA 0.1μg/mL α32p-dCTP74KBg, Tag酶2u和0.1μg(TS)引物(5＇-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3＇)加组织蛋白6μg，混匀后20℃保温30min，以灭活端粒酶，然后加0.03μg (cx)引物(5＇-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3＇)，混匀后，于PCR循环仪进行扩增，循环参数为94℃ 40s，48℃ 40s，72℃ 60s，循环35次，产物加电泳加样缓冲液6μL，在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳后放射自显影观察，每次检测以已知端粒酶阳性的组织作为阳性对照，阴性对照在反应液中不加组织提取物.
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统计学处理 采用χ2 检验进行统计分析.
2 结果
2.1 肝癌及癌旁组织端粒酶活性表达 肝癌及癌旁组织阳性结果放射自显影后可见间隔6bp的梯形带. 在38例PHC中32例端粒酶表达阳性(84.2%)，癌旁组织阳性率15.8%(6/38)，二者端粒酶表达其差异有显著意义(P<0.01)，3例阴性对照正常肝组织均端粒酶表达阴性.
2.2 端粒酶活性表达与临床资料间关系 根据肝癌检测指标，肿瘤大小，转移情况等不同进行分组(见表1). 结果显示：端粒酶活性与患者性别、年龄、AFP值水平、肿瘤大小、组织型别及有无转移间无显著性相关，各组内端粒酶活性差异无显著性(P>0.05)，端粒酶表达阳性的癌旁组织均伴有明显肝硬变. 只有HBsAg阳性患者组较阴性者端粒酶阳性检出率明显增高(P<0.01)，38例肝癌组织中端粒酶活性表达的阳性率为84.2%.
, 百拇医药
表1 肝癌组织中端粒酶活性表达及临床资料的关系
, 百拇医药
HBsAg阳性端粒酶检出率比较 aP<0.01 vs 阴性组.
3 讨论
肝癌细胞端粒酶活性的研究已成为当前肿瘤标志物研究的热门课题，端粒酶是维持端粒长度变化所必需的逆转录酶，其活性表达对细胞增殖衰老，及细胞的永生化关系密切，在肝癌的发生发展中起重要作用[1]，自1994年Kim建立了高灵敏度的PCR-TRAP端粒酶检测方法以来，端粒酶活性已在人类的绝大多数恶性肿瘤中被检出. Kim et al[2]总结分析了895例恶性肿瘤和646例非恶性组织端粒酶的研究结果，发现端粒酶作为肿瘤标志物的特异性为91%，敏感性为85%，阳性预测值为91%，阴性预测值为81%，这充分说明了端粒酶在肿瘤诊断中的潜在价值. Shay et al[3]，总结了近两年来文献报道的HCC端粒酶活性研究，其阳性率为86%(149/173)癌旁阳性率为1/50(2%)，正常肝组织中未见端粒酶活性. 本文检测了38例HCC组织端粒酶活性，阳性率为(84.2%)，癌旁组织阳性率为15.8%，端粒酶检出率在肝癌组织与癌旁组织间具有显著性差异，结果与国内外报道相近，提示端粒酶活化在PHC发生与发展过程中起重要作用.
, 百拇医药
本文所选病例均为临床证实，病理组织学检查确诊的PHC患者，其端粒酶检测未发现与肿瘤大小及肿瘤转移有显著相关性. 仅只是HBsAg阳性患者比HBsAg阴性者端粒酶阳性检出率高(P<0.01)，这可能与PHC患者中HBV感染率高有关. 其中大多数PHC患者起源于HBsAg阳性携带者慢性进展性肝炎，一些研究认为慢性肝病中可能含有少数端粒酶阳性细胞，这些永生性的细胞可能是肝癌前细胞，积累发展最终导致PHC. Tahara et al[4]曾观察过HBV感染引起的6例肝硬变患者，端粒酶检测均阳性. 其中1例4a后发展为肝癌. 因此积极开展端粒酶活性检测，尤其是建立准确的定量系统，可能会对肝癌的早期诊断，预防及治疗提供帮助.
4 参考文献
1 Allsopp RC, Vaziri H, Patterson C, Goldstein S, Younglai EV, Futcher AB, Greider CW, Harley CB. Tecomere length predicts
, 百拇医药
replicatire capacity of human fibroblasts. Proc Natc Acad Sai USA, 1992;89:10114-10118
2 Kim NW, Piatysiek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PL, Coviello GN, Wright WE, Weinrich SL, Shay JW. Specific association
of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994;266:2011-2015
3 Shay JW, Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer, 1997;33:787-791
4 Tahara H, Nakanishi T, Kitamoto M, Nakashio R, Shay JW, Tahara E, Kajiyama G, Ide T. Telomerease activity in human liver
tissues: Comparison between chronic liver disease and hepatocellular carcinomas. Cancer Res, 1995;55:2734-2736, 百拇医药(范公忍1 汪 毅1 邬光惠1 黄苏里2 )
2 中国医学科学院肿瘤医院
项目负责人 范公忍中国人民解放军北京军区总院肝病研究所 北京市 100070
收稿日期 2000-01-23 接收日期 2000-02-02
Subject headings liver neoplasms; telomerase; tumor markers, biological; carcinoma,hepatocellular/pathology;
hepatitis, B virus; expression
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主题词 肝肿瘤；端粒酶；肿瘤标记，生物学；癌，肝细胞/病理学；乙型肝炎病毒；表达
范公忍,汪毅,邬光惠,黄苏里. 端粒酶在原发性肝癌中的表达. 世界华人消化杂志，2000；8(5)：573
1 材料和方法
1.1 材料 手术切除PHC 38例，男26例，女12例，年龄32岁～71岁，平均47.4岁，术前均未放疗，标本均于离体后数小时内采集，液氮速冻后，转至-80℃冰箱贮存备用，所有病例均经病理证实.
1.2 方法 端粒酶提取：每例标本取原发性肝癌及癌旁组织各100mg，置组织研蘑器内研成粉沫，再转至1.5mL小管中，立即加入预冷的裂解液200μL(10mmol/L Tris-Hcl PH7.5)；1mmol/L MgCl2；1mmol/L DTT，1mmol/L EGTA，5mmol/L二硫基乙醇，5g/L CHAPS，100mL/L甘油混均后30min 0℃裂解，4℃离心30min，吸取上清进行蛋白质含量测定，置-80℃冰箱冻存. 端粒酶检测：采用TRAP法检测端粒酶活性，反应体积25μL，反应体系含20mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，MgCl2 1mmol/L，KCl 63mmol/L，0.005g/L Tween 20，1mmol/L EGTA，50mmol/L dNTP，T4基因32蛋白1μg，双乙酰胺BSA 0.1μg/mL α32p-dCTP74KBg, Tag酶2u和0.1μg(TS)引物(5＇-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3＇)加组织蛋白6μg，混匀后20℃保温30min，以灭活端粒酶，然后加0.03μg (cx)引物(5＇-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3＇)，混匀后，于PCR循环仪进行扩增，循环参数为94℃ 40s，48℃ 40s，72℃ 60s，循环35次，产物加电泳加样缓冲液6μL，在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳后放射自显影观察，每次检测以已知端粒酶阳性的组织作为阳性对照，阴性对照在反应液中不加组织提取物.
, 百拇医药
统计学处理 采用χ2 检验进行统计分析.
2 结果
2.1 肝癌及癌旁组织端粒酶活性表达 肝癌及癌旁组织阳性结果放射自显影后可见间隔6bp的梯形带. 在38例PHC中32例端粒酶表达阳性(84.2%)，癌旁组织阳性率15.8%(6/38)，二者端粒酶表达其差异有显著意义(P<0.01)，3例阴性对照正常肝组织均端粒酶表达阴性.
2.2 端粒酶活性表达与临床资料间关系 根据肝癌检测指标，肿瘤大小，转移情况等不同进行分组(见表1). 结果显示：端粒酶活性与患者性别、年龄、AFP值水平、肿瘤大小、组织型别及有无转移间无显著性相关，各组内端粒酶活性差异无显著性(P>0.05)，端粒酶表达阳性的癌旁组织均伴有明显肝硬变. 只有HBsAg阳性患者组较阴性者端粒酶阳性检出率明显增高(P<0.01)，38例肝癌组织中端粒酶活性表达的阳性率为84.2%.
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表1 肝癌组织中端粒酶活性表达及临床资料的关系
| 临床资料 | n | 端粒酶活性(n) | 阳性率(%) | |
| 阳性 | 阴性 | |||
| 性别 | ||||
| 男 | 26 | 23 | 3 | 88.5 |
| 女 | 12 | 9 | 3 | 75.0 |
| HBsAg | ||||
| 阳性 | 25 | 23 | 2 | 92.0a |
| 阴性 | 13 | 9 | 4 | 69.2 |
| AFP | ||||
| >30ng/mL | 26 | 22 | 4 | 84.6 |
| <30ng/mL | 12 | 10 | 2 | 83.3 |
| 肿瘤大小 | ||||
| >5cm | 31 | 27 | 4 | 87.1 |
| <5cm | 7 | 5 | 2 | 71.4 |
| 组织学类型 | ||||
| 低分化 | 8 | 7 | 1 | 87.5 |
| 中分化 | 17 | 15 | 2 | 88.2 |
| 高分化 | 13 | 10 | 3 | 76.9 |
| 转移 | ||||
| 有转移 | 8 | 7 | 1 | 87.5 |
| 无转移 | 30 | 25 | 5 | 83.3 |
| 合计 | 38 | 32 | 6 | 84.2 |
, 百拇医药
HBsAg阳性端粒酶检出率比较 aP<0.01 vs 阴性组.
3 讨论
肝癌细胞端粒酶活性的研究已成为当前肿瘤标志物研究的热门课题，端粒酶是维持端粒长度变化所必需的逆转录酶，其活性表达对细胞增殖衰老，及细胞的永生化关系密切，在肝癌的发生发展中起重要作用[1]，自1994年Kim建立了高灵敏度的PCR-TRAP端粒酶检测方法以来，端粒酶活性已在人类的绝大多数恶性肿瘤中被检出. Kim et al[2]总结分析了895例恶性肿瘤和646例非恶性组织端粒酶的研究结果，发现端粒酶作为肿瘤标志物的特异性为91%，敏感性为85%，阳性预测值为91%，阴性预测值为81%，这充分说明了端粒酶在肿瘤诊断中的潜在价值. Shay et al[3]，总结了近两年来文献报道的HCC端粒酶活性研究，其阳性率为86%(149/173)癌旁阳性率为1/50(2%)，正常肝组织中未见端粒酶活性. 本文检测了38例HCC组织端粒酶活性，阳性率为(84.2%)，癌旁组织阳性率为15.8%，端粒酶检出率在肝癌组织与癌旁组织间具有显著性差异，结果与国内外报道相近，提示端粒酶活化在PHC发生与发展过程中起重要作用.
, 百拇医药
本文所选病例均为临床证实，病理组织学检查确诊的PHC患者，其端粒酶检测未发现与肿瘤大小及肿瘤转移有显著相关性. 仅只是HBsAg阳性患者比HBsAg阴性者端粒酶阳性检出率高(P<0.01)，这可能与PHC患者中HBV感染率高有关. 其中大多数PHC患者起源于HBsAg阳性携带者慢性进展性肝炎，一些研究认为慢性肝病中可能含有少数端粒酶阳性细胞，这些永生性的细胞可能是肝癌前细胞，积累发展最终导致PHC. Tahara et al[4]曾观察过HBV感染引起的6例肝硬变患者，端粒酶检测均阳性. 其中1例4a后发展为肝癌. 因此积极开展端粒酶活性检测，尤其是建立准确的定量系统，可能会对肝癌的早期诊断，预防及治疗提供帮助.
4 参考文献
1 Allsopp RC, Vaziri H, Patterson C, Goldstein S, Younglai EV, Futcher AB, Greider CW, Harley CB. Tecomere length predicts
, 百拇医药
replicatire capacity of human fibroblasts. Proc Natc Acad Sai USA, 1992;89:10114-10118
2 Kim NW, Piatysiek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PL, Coviello GN, Wright WE, Weinrich SL, Shay JW. Specific association
of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994;266:2011-2015
3 Shay JW, Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer, 1997;33:787-791
4 Tahara H, Nakanishi T, Kitamoto M, Nakashio R, Shay JW, Tahara E, Kajiyama G, Ide T. Telomerease activity in human liver
tissues: Comparison between chronic liver disease and hepatocellular carcinomas. Cancer Res, 1995;55:2734-2736, 百拇医药(范公忍1 汪 毅1 邬光惠1 黄苏里2 )