人肝癌细胞冷冻保存方法研究
汕头大学医学院组织学与胚胎学教研室 广东省汕头市 515031
项目负责人 周燕琼汕头大学医学院组织学与胚胎学教研室 广东省汕头市 515031
收稿日期 2000-02-23 接收日期 2000-04-06
Subject headings cryopreservation; DMSO; Bel-7402
主题词 冷冻保存；二甲基亚砜；Bel-7402
周燕琼,刘小辉,刘幸平,曾自立. 人肝癌细胞冷冻保存方法研究. 世界华人消化杂志，2000；8(6)：714
, http://www.100md.com
有关利用普通冰箱-18℃冷冻保存组织及细胞，迄今未见报道[1-4]. 本实验对-18℃冷冻保存人肝癌细胞株Bel-7402进行实验研究，现报告如下：
1 材料和方法
人肝癌细胞株Bel-7402引自中山医科大学实验动物中心，置于含100mL/L新生牛血清的RPMI*"1640培养液中，在37℃，50mL/L CO2，饱湿条件下传代培养，细胞贴壁生长. 将处于对数生长期的细胞经D-Hank＇s液洗2次，后用2.5g/L胰蛋白酶消化，再用含100mL/L新生牛血清的1640液洗涤1次. 后分别用含0mL/L，5mL/L，10mL/L，15mL/L，20mL/L DMSO的完全培养基(含100mL/L新生牛血清1640)重新制成细胞悬液[5]. 细胞浓度保持在1×106/mL左右. 将细胞悬液置于2mL的硬塑料冻存管中，加盖密封，做好标记. 直接迅速地放入-18℃冰箱中冻存[6-9]. 每种浓度各分装12支冻存管，每管装1mL悬液. 于1wk，1mo,2mo,3mo后分别进行融冻[10，11]. 将上述的冻存管，直接从-18℃冰箱中取出，迅速投入40℃水浴中使之迅速完全融化(约1min左右). 迅速倒入已备好的RPMI*"1640营养液中，并用RPMI 1640洗涤冻存管2次. 后离心，再用RPMI*"1640洗涤细胞2次，置瓶培养；同时制成一定量的细胞悬液，取其中0.5mL的细胞悬液加入4mL/L台盼蓝染液0.5mL，混匀，取少许滴于计数板的计数池内，静置2min后计算细胞存活率(不着蓝色的细胞为活细胞).
, 百拇医药
细胞存活率=活细胞数 / 活细胞数+死细胞数 ×100%
观察指标：①存活率：台盼蓝拒染试验计数；②冻存后复苏的细胞接种入培养瓶，置于含100mL/L新生牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃，50mL/L CO2，饱湿培养箱中培养，24h后半保留换液，每天观察.
2 结果
-18℃条件下用不同浓度的DMSO为冷冻保护剂，冻存Bel-7402 1wk，1mo, 2mo及3mo后细胞存活率及镜下观察到的生长状况见表1.
表1 不同浓度DMSO对Bel-7402的影响
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从表1中看出，不同浓度的DMSO的冷冻保护液中细胞存活率有所不同，其中不含DMSO组的细胞存活率很低， 接种后未见生长；含50mL/L DMSO的冷冻保护液组与其他三组比较，台盼蓝拒染率相差不甚大，但接种后一直未见细胞贴壁生长；含100mL/L DMSO组与含150mL/L DMSO组细胞存活率均较高[12]，经统计学比较两组间无显著性差异(P>0.05)，且接种后见细胞贴壁生长的天数几乎一致.
3 讨论
一般认为，低温冻存细胞须依靠液氮或-80℃低温冰箱. 本实验大胆探索，利用普通冻箱-18℃温度条件，寻找冷冻保护剂的适宜浓度. DMSO是一种双极性有机溶剂，作为冷冻保护剂能较好防止细胞低温冷冻损伤，是一种细胞内的保护剂. 一些研究表明，无冷冻保护剂的细胞冷冻至-5℃～-10℃时，胞质内脱水不全，冰晶形成和电解质浓度升高引起细胞损伤. DMSO能与具活性的水分子结合，减缓水的结晶过程，降低电解质浓度，缩小冷冻时危险温度范围. 随着保护剂浓度增高，危险区上限温度下降，缩小危险区范围. 因此，DMSO的应用使-18℃冷冻细胞成为一种可能，且以10%～15%浓度时冷冻效果较好，在升高DMSO浓度冷冻存活率并无明显增高. 此外，经-18℃冻存后复苏培养的细胞其电镜下微细胞结构及磷酸酶活性检测方面有待于进一步阐明.
, 百拇医药
通过实验发现，冻存1mo～2mo的细胞存活率较高，且其生长率及分裂指数同经液氮冻存的细胞差别甚小. 在高校，科研工作往往在假期暂告一段落，培养中的细胞往往要冻存一段时间(1mo～2mo)，待开学后再复苏培养. 该实验方法非常适合高校这种情况，且省去假期添加液氮的烦琐，也不似-80℃低温冰箱功率大、耗电多，节省科研经费，且操作简便. 其他细胞株是否适宜此法有待尝试.
4 参考文献
1 Makino S, Harada M, Akashi K, Taniguchi S, Shibuya T, Inaba S, Niho Y. A simplified method for cryopreservation of peripheral
blood stem cells at -80℃ without rate-controlled freezing. Bone Marrow Transplantation, 1991;8:239-244
, http://www.100md.com
2 刘开彦. -80℃低温冷冻保存人外周血造血干细胞. 新疆医学院学报，1995；18：102-104
3 钟胜荣，张洪德，胡远峰，徐静娟，张洪，董维平，张爱芳，王丽娟. 多种添加剂对冻存人胎胰岛存活性的影响.
中国糖尿病杂志，1997；5：32-36
4 张宏，杨春森，邬旭群，罗肇敏，吴国光. 低温-80℃保存的浓缩血小板回收率及冻存后形态学的观察. 深圳医学，1998；11：8-9
5 牟雅军，杨伟力，于广晴，曹文斌. 深低温贮存对小鼠脾淋巴细胞功能的影响. 佳木斯医学院学报，1994；17：7-8
6 杨善民，陈福，陈美玉. 移植瘤株冷冻保护的实验研究. 实验动物科学与管理，1997；14：21-25
, 百拇医药
7 高玉民，谢艳，韩范锡，窦新强，蒿凤英. 不同冷冻条件对胃髓造血细胞的CFU-GM形成能力及DNA活性的影响.
中国组织化学与细胞化学杂志，1994；3：167-170
8 黄云中，刘忆湘，高凤久. 低温保护剂和降温速率对低温保存的新生大鼠胰岛活性的影响. 中国应用生理学杂志，1993；9：270-271
9 罗克桓，吴冠青，王奇璐，孙燕，柳杯斌，储衍信. 二甲基亚砜和羟乙基淀粉联合冷冻保护人骨髓造血细胞的实验研究.
中华器官移植杂志，1994；15：125-127
10 杨嗣星，詹炳炎，王玲珑，金化民，徐颖. 新生大鼠睾丸组织冷冻保存的研究. 中华实验外科杂志，1994；11：199-200
11 杨嗣星，詹炳炎，王玲珑，金化民，徐颖. 睾丸组织冷冻保存与睾丸组织移植的实验研究. 湖北医科大学学报，1994；15：357-360
12 于丽敏. 二甲基亚砜与甘油两种冻存保护液对细胞保护作用的比较. 大连医科大学学报，1995；17：6-7, http://www.100md.com(周燕琼 刘小辉 刘幸平 曾自立)
项目负责人 周燕琼汕头大学医学院组织学与胚胎学教研室 广东省汕头市 515031
收稿日期 2000-02-23 接收日期 2000-04-06
Subject headings cryopreservation; DMSO; Bel-7402
主题词 冷冻保存；二甲基亚砜；Bel-7402
周燕琼,刘小辉,刘幸平,曾自立. 人肝癌细胞冷冻保存方法研究. 世界华人消化杂志，2000；8(6)：714
, http://www.100md.com
有关利用普通冰箱-18℃冷冻保存组织及细胞，迄今未见报道[1-4]. 本实验对-18℃冷冻保存人肝癌细胞株Bel-7402进行实验研究，现报告如下：
1 材料和方法
人肝癌细胞株Bel-7402引自中山医科大学实验动物中心，置于含100mL/L新生牛血清的RPMI*"1640培养液中，在37℃，50mL/L CO2，饱湿条件下传代培养，细胞贴壁生长. 将处于对数生长期的细胞经D-Hank＇s液洗2次，后用2.5g/L胰蛋白酶消化，再用含100mL/L新生牛血清的1640液洗涤1次. 后分别用含0mL/L，5mL/L，10mL/L，15mL/L，20mL/L DMSO的完全培养基(含100mL/L新生牛血清1640)重新制成细胞悬液[5]. 细胞浓度保持在1×106/mL左右. 将细胞悬液置于2mL的硬塑料冻存管中，加盖密封，做好标记. 直接迅速地放入-18℃冰箱中冻存[6-9]. 每种浓度各分装12支冻存管，每管装1mL悬液. 于1wk，1mo,2mo,3mo后分别进行融冻[10，11]. 将上述的冻存管，直接从-18℃冰箱中取出，迅速投入40℃水浴中使之迅速完全融化(约1min左右). 迅速倒入已备好的RPMI*"1640营养液中，并用RPMI 1640洗涤冻存管2次. 后离心，再用RPMI*"1640洗涤细胞2次，置瓶培养；同时制成一定量的细胞悬液，取其中0.5mL的细胞悬液加入4mL/L台盼蓝染液0.5mL，混匀，取少许滴于计数板的计数池内，静置2min后计算细胞存活率(不着蓝色的细胞为活细胞).
, 百拇医药
细胞存活率=活细胞数 / 活细胞数+死细胞数 ×100%
观察指标：①存活率：台盼蓝拒染试验计数；②冻存后复苏的细胞接种入培养瓶，置于含100mL/L新生牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃，50mL/L CO2，饱湿培养箱中培养，24h后半保留换液，每天观察.
2 结果
-18℃条件下用不同浓度的DMSO为冷冻保护剂，冻存Bel-7402 1wk，1mo, 2mo及3mo后细胞存活率及镜下观察到的生长状况见表1.
表1 不同浓度DMSO对Bel-7402的影响
| DMSO浓度(mL/L) | 细胞存活率(%) | 接种后见细胞贴壁生长天数 | ||||||
| 1wk | 1mo | 2mo | 3mo | 1wk | 1mo | 2mo | 3mo | |
| 0 | 22.1 | 17.2 | 8.2 | 5.6 | — | — | — | — |
| 50 | 84.3 | 82.3 | 78.1 | 70.1 | — | — | — | — |
| 100 | 90.3 | 86.5 | 84.1 | 79.2 | 1 | 2 | 3 | 5 |
| 150 | 89.8 | 85.3 | 83.9 | 78.9 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 200 | 85.1 | 81.6 | 78.3 | 74.0 | 1 | 3 | 4 | 6 |
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从表1中看出，不同浓度的DMSO的冷冻保护液中细胞存活率有所不同，其中不含DMSO组的细胞存活率很低， 接种后未见生长；含50mL/L DMSO的冷冻保护液组与其他三组比较，台盼蓝拒染率相差不甚大，但接种后一直未见细胞贴壁生长；含100mL/L DMSO组与含150mL/L DMSO组细胞存活率均较高[12]，经统计学比较两组间无显著性差异(P>0.05)，且接种后见细胞贴壁生长的天数几乎一致.
3 讨论
一般认为，低温冻存细胞须依靠液氮或-80℃低温冰箱. 本实验大胆探索，利用普通冻箱-18℃温度条件，寻找冷冻保护剂的适宜浓度. DMSO是一种双极性有机溶剂，作为冷冻保护剂能较好防止细胞低温冷冻损伤，是一种细胞内的保护剂. 一些研究表明，无冷冻保护剂的细胞冷冻至-5℃～-10℃时，胞质内脱水不全，冰晶形成和电解质浓度升高引起细胞损伤. DMSO能与具活性的水分子结合，减缓水的结晶过程，降低电解质浓度，缩小冷冻时危险温度范围. 随着保护剂浓度增高，危险区上限温度下降，缩小危险区范围. 因此，DMSO的应用使-18℃冷冻细胞成为一种可能，且以10%～15%浓度时冷冻效果较好，在升高DMSO浓度冷冻存活率并无明显增高. 此外，经-18℃冻存后复苏培养的细胞其电镜下微细胞结构及磷酸酶活性检测方面有待于进一步阐明.
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通过实验发现，冻存1mo～2mo的细胞存活率较高，且其生长率及分裂指数同经液氮冻存的细胞差别甚小. 在高校，科研工作往往在假期暂告一段落，培养中的细胞往往要冻存一段时间(1mo～2mo)，待开学后再复苏培养. 该实验方法非常适合高校这种情况，且省去假期添加液氮的烦琐，也不似-80℃低温冰箱功率大、耗电多，节省科研经费，且操作简便. 其他细胞株是否适宜此法有待尝试.
4 参考文献
1 Makino S, Harada M, Akashi K, Taniguchi S, Shibuya T, Inaba S, Niho Y. A simplified method for cryopreservation of peripheral
blood stem cells at -80℃ without rate-controlled freezing. Bone Marrow Transplantation, 1991;8:239-244
, http://www.100md.com
2 刘开彦. -80℃低温冷冻保存人外周血造血干细胞. 新疆医学院学报，1995；18：102-104
3 钟胜荣，张洪德，胡远峰，徐静娟，张洪，董维平，张爱芳，王丽娟. 多种添加剂对冻存人胎胰岛存活性的影响.
中国糖尿病杂志，1997；5：32-36
4 张宏，杨春森，邬旭群，罗肇敏，吴国光. 低温-80℃保存的浓缩血小板回收率及冻存后形态学的观察. 深圳医学，1998；11：8-9
5 牟雅军，杨伟力，于广晴，曹文斌. 深低温贮存对小鼠脾淋巴细胞功能的影响. 佳木斯医学院学报，1994；17：7-8
6 杨善民，陈福，陈美玉. 移植瘤株冷冻保护的实验研究. 实验动物科学与管理，1997；14：21-25
, 百拇医药
7 高玉民，谢艳，韩范锡，窦新强，蒿凤英. 不同冷冻条件对胃髓造血细胞的CFU-GM形成能力及DNA活性的影响.
中国组织化学与细胞化学杂志，1994；3：167-170
8 黄云中，刘忆湘，高凤久. 低温保护剂和降温速率对低温保存的新生大鼠胰岛活性的影响. 中国应用生理学杂志，1993；9：270-271
9 罗克桓，吴冠青，王奇璐，孙燕，柳杯斌，储衍信. 二甲基亚砜和羟乙基淀粉联合冷冻保护人骨髓造血细胞的实验研究.
中华器官移植杂志，1994；15：125-127
10 杨嗣星，詹炳炎，王玲珑，金化民，徐颖. 新生大鼠睾丸组织冷冻保存的研究. 中华实验外科杂志，1994；11：199-200
11 杨嗣星，詹炳炎，王玲珑，金化民，徐颖. 睾丸组织冷冻保存与睾丸组织移植的实验研究. 湖北医科大学学报，1994；15：357-360
12 于丽敏. 二甲基亚砜与甘油两种冻存保护液对细胞保护作用的比较. 大连医科大学学报，1995；17：6-7, http://www.100md.com(周燕琼 刘小辉 刘幸平 曾自立)