肝癌和癌旁肝组织中IGF-Ⅱ的表达及突变分析
中国人民解放军第一军医大学珠江医院消化科 广东省广州市 510282
国家自然科学基金资助项目，No.39470774
项目负责人 范子荣
Tel. 0086-20-85143361
Email.fanzr @fimmu.edu.cn
收稿日期 2000-01-29 接收日期 2000-02-17
Subject headings hepatocellular carcinoma; insulin-like growth factor; in situ hybridization; polymerase chain reaction;
, http://www.100md.com
mutation; gene expression
主题词 肝细胞瘤；IGF-Ⅱ基因；原位分子杂交；聚合酶链反应
范子荣,杨冬华,覃汉荣. 肝癌和癌旁肝组织中IGF-Ⅱ的表达及突变分析. 世界华人消化杂志，2000；8(6)：704-705
胰岛素样生长因子Ⅱ(Insulin-like growth factor Ⅱ, IGF-Ⅱ)主要由肝脏合成和分泌，在人肝癌和癌旁肝组织中存在IGF-Ⅱ基因的异常过量表达，可能通过自分泌或邻分泌循环短路在肝癌的发生发展中起某种直接作用[1-4]. 陈思红et al[5]在人肝癌中发现了IGF-Ⅱ cDNA变异体的存在，但IGF-Ⅱ的异常过量表达机制尚不明确. 我们采用原位杂交技术和银染PCR-SSCP方法，检测IGF-Ⅱ转录水平的表达，并分析其基因结构改变，旨在探讨IGF-Ⅱ表达的规律及其在肝细胞癌变过程中的意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 肝癌和癌旁肝组织取自外科手术切除的新鲜标本. 男23例，女7例，年龄19岁～79岁，平均45.8岁，按Edmondson分级法：Ⅰ级2例，Ⅱ级2例，Ⅲ级20例，Ⅳ级6例. IGF-Ⅱ探针序列: 5＇GTG CTT CTC ACC TTC GCC TTC GCC TCG TGC TGC ATT G 3＇.
1.2 方法
1.2.1 原位杂交 常规脱蜡、水化，30mg/L蛋白酶K 37℃消化30min，预杂交40℃ 2h，杂交40℃ 16h. 洗涤，抗地高辛抗体室温孵育2h，NBT-BCIP显色3h～6h. 原位杂交设置阳性对照，空白对照及阴性对照.
, 百拇医药 1.2.2 PCR-SSCP 常规酚-氯仿抽提基因组DNA，采用三对引物分别扩增IGF-Ⅱ基因蛋白编码区的第2，3外显子及第4外显子的一部分，取扩增成功的PCR产物在60g/L～80g/L聚丙烯酰胺凝胶中(含50mL/L或100mL/L甘油)进行SSCP电泳，电泳结束后进行银染色
分析[6].
2 结果
2.1 IGF-Ⅱ mRNA的表达及细胞定位 IGF-Ⅱ mRNA在肝癌和癌旁肝组织中的表达率分别为73%(22/30例)和80%(24/30例)，癌旁肝组织的表达率略高于肝癌组织的表达率，但经统计学分析无显著差异(P>0.05). 进一步细胞定位发现，在分化较差的癌细胞、肝细胞再生结节及肝细胞不典型增生(liver cell dysplasia，LCD)中IGF-Ⅱ mRNA呈现高表达.
, 百拇医药
2.2 IGF-Ⅱ mRNA表达与癌旁LCD的关系 在30例癌旁肝组织中，伴有明显的LCD占12例(40%)，IGF-Ⅱ mRNA在癌旁肝组织中的表达与是否伴有LCD有关(P<0.05)，伴有LCD者IGF-Ⅱ mRNA表达率明显增高.
2.3 IGF-Ⅱ基因2，3，4外显子PCR-SSCP电泳结果 30例肝癌和癌旁肝组织DNA经用不同引物扩增，分别得到了IGF-Ⅱ基因第2，3，4外显子PCR产物，进一步进行银染SSCP电泳检测，均未发现单链多态性改变.
3 讨论
我们的研究结果发现，在肝癌和癌旁肝组织中均存在IGF-Ⅱ的异常过量表达，提示IGF-Ⅱ可能参与了肝细胞癌变的演化过程[7-9]. 在肝癌组织中，肝癌细胞通过自分泌大量的IGF-Ⅱ，直接作用于自身或邻近癌细胞的IGF-ⅡR，产生胞质内循环短路，放大了细胞持续生长信号的传递，加速了肝癌细胞的自主性生长，维持肝癌细胞的恶性表型[10-13].在低分化癌细胞中可见较强的阳性信号，提示IGF-Ⅱ的表达与肝癌细胞的分化有关，可作为肝癌细胞分化程度的一种标志，对临床判定肝癌的预后有一定的指导意义[14,15].
, 百拇医药
在癌旁肝组织，IGF-Ⅱ的表达与是否伴有LCD有关，更有意义的是在肝细胞再生结节和LCD中见到IGF-Ⅱ的异常高表达，提示IGF-Ⅱ可能通过自分泌或旁分泌途径与IGF-ⅡR结合，刺激肝细胞的异常增殖，为肝细胞再生结节和LCD形成提供了条件[16]. LCD和肝细胞再生结节中的肝细胞，细胞增殖较活跃，IGF-Ⅱ在这些癌前病变中的大量表达，进一步刺激癌前肝细胞的异常增殖，增加癌前肝细胞突变的概率[17]，并在一定条件下诱导癌前肝细胞的恶性转化，最终发生肝细胞的癌变[18,19]. IGF-Ⅱ的过表达与癌前肝细胞异常增殖有关，可作为癌前肝细胞异常增殖状态的标志，具有较高表达的癌前病灶具有较大的癌变危险性[20,21].
人类IGF-Ⅱ基因的表达受不同启动子的调控，在胚胎生长发育过程中，IGF-Ⅱ由强启动子P3启动转录，产生大量的IGF-Ⅱ，促进胚胎的生长发育，出生后P3启动子关闭转由弱启动子P1调控，故在成人正常肝组织中IGF-Ⅱ几乎不表达[22]. 本研究未发现IGF-Ⅱ基因2，3，4外显子存在突变、插入或缺失等改变，提示IGF-Ⅱ在肝癌和癌旁肝组织中的异常激活和过量表达与其2，3，4外显子的异常结构改变无关，很可能与IGF-Ⅱ基因启动子调控区域的改变或突变导致已关闭的IGF-Ⅱ强启动子P3再次被激活有关[23].
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Su Q, Liu YF, Zhang JF, Zhang SX, Li DF, Yang JJ. Expression of insulin-like growth factor Ⅱ in hepatitis, cirrhosis and
hepatocellular carcinoma: its relationship with hepatitis B virus antigen expression. Hepatology, 1994;20:788-799
2 杨冬华. IGFs家族与肝癌. 临床肝胆病杂志, 1995;11:69-72
3 顾公望, 周汉高. 肝癌病因的新概念. 华人消化杂志, 1998;6:185-187
, 百拇医药
4 宁晓燕, 杨冬华. 原发性肝癌的体内基因治疗研究与进展. 世界华人消化杂志, 2000;8:89-90
5 陈思红，周筱梅，李岱宗，钱莲芳，顾健人. 人肝癌组织IGF-Ⅱ cDNA变异体的克隆和顺序分析. 科学通报, 1994;39:664-666
6 崔建涛, 吕有勇. 改良PCR/SSCP和PCR直接测序在基因突变检测中的应用. 新消化病学杂志, 1997;5:593
7 邓涛, 陈乃玲, 贾克明. 肝癌组织IGF-Ⅱ、IGF-ⅡR、HBxAg的表达与细胞DNA倍体和S期的关系. 中华内科杂志, 1994;33:743-746
8 Luo YQ, Wu MC, Cong WM. Gene expression of hepatocyte growth factor and its receptor in HCC and nontumorous liver
, 百拇医药
tissues. World J Gastroenterol, 1999;5:119-121
9 陈士葆. 肝癌发病的分子机制及基因治疗. 新消化病学杂志, 1995;3:156-157
10 Rogler CE, Yang D, Rossetti L, Donohoe J, Alt E, Chang CJ, Rosenfeld R, Neely K, Hintz R. Altered body composition and
increased frequency of diverse malignancies in insulin-like growth factor-Ⅱ transgenic mice.
J Biol Chem, 1994;269:13779-13784
, 百拇医药
11 杨冬华，刘为纹，顾健人，万大方，李宏年，马安卿，曲淑敏，许秀兰. IGF-Ⅱ、IGF-Ⅱ受体和CSF-Ⅰ受体基因产物在肝癌、癌旁肝组织的表达. 中华医学杂志, 1992;72:476-480
12 Fiorentino M, Grigioni WF, Baccarini P, D＇Errico A, De Mitri MS, Pisi E, Mancini AM. Different in situ expression of insulin-like
growth factor type Ⅱ in hepatocellular carcinoma. An in situ hybridization and immunohistochemical study.
Diagn Mol Pathol, 1994;3:59-65
, 百拇医药
13 Yang DH, Zhang MQ, Du J, Xu C, Liang QM, Mao JF, Qin HR. Inhibitory effect of IGF-Ⅱ antisense RNA on malignant phenotype
of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol, 2000;6:266-267
14 D＇Errico A, Grigioni WF, Fiorentino M, Baccarini P, Lamas E, De Mitri S, Gozzetti G, Mancini AM, Brechot C. Expression of
insulin-like growth factor Ⅱ (IGF-Ⅱ) in human hepatocellular carcinomas: an immunohistochemical study.
, 百拇医药
Pathol Int, 1994;44:131-137
15 Lamas E, Le Bail B, Housset C, Boucher O， Brechot C. Localization of insulin-like growth factor-Ⅱ and hepatitis B virus mRNAs
and proteins in human hepatocellular carcinomas. Lab Invest, 1991;64:98-104
16 Seo JH, Park BC. Expression of insulin-like growth factor II in chronic hepatitis B, liver cirrhosis, and hepatocellular carcinoma.
, 百拇医药
Gan To Kagaku Ryoho, 1995;22(Suppl 3):292-307
17 Yang DH, Xiu C, Yang B, Gu JR, Qian LF, Qu SM. Expression of insulin like growth factor Ⅱ and its receptor in livercells of chronic
liver diseases. China Natl J New Gastroenterol, 1997;3:117-118
18 Cariani E, Seurin D, Lasserre C, Franco D, Binoux M, Brechot C. Expression of insulin-like growth factor Ⅱ(IGF-Ⅱ) in human primary
, http://www.100md.com
liver cancer: mRNA and protein analysis. J Hepatol, 1990;11:226-231
19 Yang D, Faris R, Hixson D, Affigne S, Rogler CE. Insulin-like growth factor Ⅱ blocks apoptosis of N-myc2-expressing woodchuck
liver epithelial cells. J Virol, 1996;70:6260-6268
20 Sohda T, Yun K, Iwata K, Soejima H, Okumura M. Increased expression of insulin-like growth factor 2 in hepatocellular carcinoma
, http://www.100md.com
is primarily regulated at the transcriptional level. Lab Invest, 1996;75:307-311
21 Yang DY, Rogler CE. Analysis of insulin-like growth factor Ⅱ (IGF-Ⅱ) expression in neoplastic nodules and hepatocellular carcinomas
of woodchucks utilizing in situ hybridization and immunocytochemistry. Carcinogenesis, 1991;12:1893-1901
22 dArville CN, Nouri Aria KT, Johnson P, Williams R. Regulation of insulin-like growth factor Ⅱ gene expression by hepatitis B virus
in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1991;13:310-315
23 张农. 人肝癌中IGF-2表达与基因印迹异常调控的关系. 上海医科大学学报, 1999;26:79-82, http://www.100md.com(范子荣 杨冬华 覃汉荣)
国家自然科学基金资助项目，No.39470774
项目负责人 范子荣
Tel. 0086-20-85143361
Email.fanzr @fimmu.edu.cn
收稿日期 2000-01-29 接收日期 2000-02-17
Subject headings hepatocellular carcinoma; insulin-like growth factor; in situ hybridization; polymerase chain reaction;
, http://www.100md.com
mutation; gene expression
主题词 肝细胞瘤；IGF-Ⅱ基因；原位分子杂交；聚合酶链反应
范子荣,杨冬华,覃汉荣. 肝癌和癌旁肝组织中IGF-Ⅱ的表达及突变分析. 世界华人消化杂志，2000；8(6)：704-705
胰岛素样生长因子Ⅱ(Insulin-like growth factor Ⅱ, IGF-Ⅱ)主要由肝脏合成和分泌，在人肝癌和癌旁肝组织中存在IGF-Ⅱ基因的异常过量表达，可能通过自分泌或邻分泌循环短路在肝癌的发生发展中起某种直接作用[1-4]. 陈思红et al[5]在人肝癌中发现了IGF-Ⅱ cDNA变异体的存在，但IGF-Ⅱ的异常过量表达机制尚不明确. 我们采用原位杂交技术和银染PCR-SSCP方法，检测IGF-Ⅱ转录水平的表达，并分析其基因结构改变，旨在探讨IGF-Ⅱ表达的规律及其在肝细胞癌变过程中的意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 肝癌和癌旁肝组织取自外科手术切除的新鲜标本. 男23例，女7例，年龄19岁～79岁，平均45.8岁，按Edmondson分级法：Ⅰ级2例，Ⅱ级2例，Ⅲ级20例，Ⅳ级6例. IGF-Ⅱ探针序列: 5＇GTG CTT CTC ACC TTC GCC TTC GCC TCG TGC TGC ATT G 3＇.
1.2 方法
1.2.1 原位杂交 常规脱蜡、水化，30mg/L蛋白酶K 37℃消化30min，预杂交40℃ 2h，杂交40℃ 16h. 洗涤，抗地高辛抗体室温孵育2h，NBT-BCIP显色3h～6h. 原位杂交设置阳性对照，空白对照及阴性对照.
, 百拇医药 1.2.2 PCR-SSCP 常规酚-氯仿抽提基因组DNA，采用三对引物分别扩增IGF-Ⅱ基因蛋白编码区的第2，3外显子及第4外显子的一部分，取扩增成功的PCR产物在60g/L～80g/L聚丙烯酰胺凝胶中(含50mL/L或100mL/L甘油)进行SSCP电泳，电泳结束后进行银染色
分析[6].
2 结果
2.1 IGF-Ⅱ mRNA的表达及细胞定位 IGF-Ⅱ mRNA在肝癌和癌旁肝组织中的表达率分别为73%(22/30例)和80%(24/30例)，癌旁肝组织的表达率略高于肝癌组织的表达率，但经统计学分析无显著差异(P>0.05). 进一步细胞定位发现，在分化较差的癌细胞、肝细胞再生结节及肝细胞不典型增生(liver cell dysplasia，LCD)中IGF-Ⅱ mRNA呈现高表达.
, 百拇医药
2.2 IGF-Ⅱ mRNA表达与癌旁LCD的关系 在30例癌旁肝组织中，伴有明显的LCD占12例(40%)，IGF-Ⅱ mRNA在癌旁肝组织中的表达与是否伴有LCD有关(P<0.05)，伴有LCD者IGF-Ⅱ mRNA表达率明显增高.
2.3 IGF-Ⅱ基因2，3，4外显子PCR-SSCP电泳结果 30例肝癌和癌旁肝组织DNA经用不同引物扩增，分别得到了IGF-Ⅱ基因第2，3，4外显子PCR产物，进一步进行银染SSCP电泳检测，均未发现单链多态性改变.
3 讨论
我们的研究结果发现，在肝癌和癌旁肝组织中均存在IGF-Ⅱ的异常过量表达，提示IGF-Ⅱ可能参与了肝细胞癌变的演化过程[7-9]. 在肝癌组织中，肝癌细胞通过自分泌大量的IGF-Ⅱ，直接作用于自身或邻近癌细胞的IGF-ⅡR，产生胞质内循环短路，放大了细胞持续生长信号的传递，加速了肝癌细胞的自主性生长，维持肝癌细胞的恶性表型[10-13].在低分化癌细胞中可见较强的阳性信号，提示IGF-Ⅱ的表达与肝癌细胞的分化有关，可作为肝癌细胞分化程度的一种标志，对临床判定肝癌的预后有一定的指导意义[14,15].
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在癌旁肝组织，IGF-Ⅱ的表达与是否伴有LCD有关，更有意义的是在肝细胞再生结节和LCD中见到IGF-Ⅱ的异常高表达，提示IGF-Ⅱ可能通过自分泌或旁分泌途径与IGF-ⅡR结合，刺激肝细胞的异常增殖，为肝细胞再生结节和LCD形成提供了条件[16]. LCD和肝细胞再生结节中的肝细胞，细胞增殖较活跃，IGF-Ⅱ在这些癌前病变中的大量表达，进一步刺激癌前肝细胞的异常增殖，增加癌前肝细胞突变的概率[17]，并在一定条件下诱导癌前肝细胞的恶性转化，最终发生肝细胞的癌变[18,19]. IGF-Ⅱ的过表达与癌前肝细胞异常增殖有关，可作为癌前肝细胞异常增殖状态的标志，具有较高表达的癌前病灶具有较大的癌变危险性[20,21].
人类IGF-Ⅱ基因的表达受不同启动子的调控，在胚胎生长发育过程中，IGF-Ⅱ由强启动子P3启动转录，产生大量的IGF-Ⅱ，促进胚胎的生长发育，出生后P3启动子关闭转由弱启动子P1调控，故在成人正常肝组织中IGF-Ⅱ几乎不表达[22]. 本研究未发现IGF-Ⅱ基因2，3，4外显子存在突变、插入或缺失等改变，提示IGF-Ⅱ在肝癌和癌旁肝组织中的异常激活和过量表达与其2，3，4外显子的异常结构改变无关，很可能与IGF-Ⅱ基因启动子调控区域的改变或突变导致已关闭的IGF-Ⅱ强启动子P3再次被激活有关[23].
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4 参考文献
1 Su Q, Liu YF, Zhang JF, Zhang SX, Li DF, Yang JJ. Expression of insulin-like growth factor Ⅱ in hepatitis, cirrhosis and
hepatocellular carcinoma: its relationship with hepatitis B virus antigen expression. Hepatology, 1994;20:788-799
2 杨冬华. IGFs家族与肝癌. 临床肝胆病杂志, 1995;11:69-72
3 顾公望, 周汉高. 肝癌病因的新概念. 华人消化杂志, 1998;6:185-187
, 百拇医药
4 宁晓燕, 杨冬华. 原发性肝癌的体内基因治疗研究与进展. 世界华人消化杂志, 2000;8:89-90
5 陈思红，周筱梅，李岱宗，钱莲芳，顾健人. 人肝癌组织IGF-Ⅱ cDNA变异体的克隆和顺序分析. 科学通报, 1994;39:664-666
6 崔建涛, 吕有勇. 改良PCR/SSCP和PCR直接测序在基因突变检测中的应用. 新消化病学杂志, 1997;5:593
7 邓涛, 陈乃玲, 贾克明. 肝癌组织IGF-Ⅱ、IGF-ⅡR、HBxAg的表达与细胞DNA倍体和S期的关系. 中华内科杂志, 1994;33:743-746
8 Luo YQ, Wu MC, Cong WM. Gene expression of hepatocyte growth factor and its receptor in HCC and nontumorous liver
, 百拇医药
tissues. World J Gastroenterol, 1999;5:119-121
9 陈士葆. 肝癌发病的分子机制及基因治疗. 新消化病学杂志, 1995;3:156-157
10 Rogler CE, Yang D, Rossetti L, Donohoe J, Alt E, Chang CJ, Rosenfeld R, Neely K, Hintz R. Altered body composition and
increased frequency of diverse malignancies in insulin-like growth factor-Ⅱ transgenic mice.
J Biol Chem, 1994;269:13779-13784
, 百拇医药
11 杨冬华，刘为纹，顾健人，万大方，李宏年，马安卿，曲淑敏，许秀兰. IGF-Ⅱ、IGF-Ⅱ受体和CSF-Ⅰ受体基因产物在肝癌、癌旁肝组织的表达. 中华医学杂志, 1992;72:476-480
12 Fiorentino M, Grigioni WF, Baccarini P, D＇Errico A, De Mitri MS, Pisi E, Mancini AM. Different in situ expression of insulin-like
growth factor type Ⅱ in hepatocellular carcinoma. An in situ hybridization and immunohistochemical study.
Diagn Mol Pathol, 1994;3:59-65
, 百拇医药
13 Yang DH, Zhang MQ, Du J, Xu C, Liang QM, Mao JF, Qin HR. Inhibitory effect of IGF-Ⅱ antisense RNA on malignant phenotype
of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol, 2000;6:266-267
14 D＇Errico A, Grigioni WF, Fiorentino M, Baccarini P, Lamas E, De Mitri S, Gozzetti G, Mancini AM, Brechot C. Expression of
insulin-like growth factor Ⅱ (IGF-Ⅱ) in human hepatocellular carcinomas: an immunohistochemical study.
, 百拇医药
Pathol Int, 1994;44:131-137
15 Lamas E, Le Bail B, Housset C, Boucher O， Brechot C. Localization of insulin-like growth factor-Ⅱ and hepatitis B virus mRNAs
and proteins in human hepatocellular carcinomas. Lab Invest, 1991;64:98-104
16 Seo JH, Park BC. Expression of insulin-like growth factor II in chronic hepatitis B, liver cirrhosis, and hepatocellular carcinoma.
, 百拇医药
Gan To Kagaku Ryoho, 1995;22(Suppl 3):292-307
17 Yang DH, Xiu C, Yang B, Gu JR, Qian LF, Qu SM. Expression of insulin like growth factor Ⅱ and its receptor in livercells of chronic
liver diseases. China Natl J New Gastroenterol, 1997;3:117-118
18 Cariani E, Seurin D, Lasserre C, Franco D, Binoux M, Brechot C. Expression of insulin-like growth factor Ⅱ(IGF-Ⅱ) in human primary
, http://www.100md.com
liver cancer: mRNA and protein analysis. J Hepatol, 1990;11:226-231
19 Yang D, Faris R, Hixson D, Affigne S, Rogler CE. Insulin-like growth factor Ⅱ blocks apoptosis of N-myc2-expressing woodchuck
liver epithelial cells. J Virol, 1996;70:6260-6268
20 Sohda T, Yun K, Iwata K, Soejima H, Okumura M. Increased expression of insulin-like growth factor 2 in hepatocellular carcinoma
, http://www.100md.com
is primarily regulated at the transcriptional level. Lab Invest, 1996;75:307-311
21 Yang DY, Rogler CE. Analysis of insulin-like growth factor Ⅱ (IGF-Ⅱ) expression in neoplastic nodules and hepatocellular carcinomas
of woodchucks utilizing in situ hybridization and immunocytochemistry. Carcinogenesis, 1991;12:1893-1901
22 dArville CN, Nouri Aria KT, Johnson P, Williams R. Regulation of insulin-like growth factor Ⅱ gene expression by hepatitis B virus
in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1991;13:310-315
23 张农. 人肝癌中IGF-2表达与基因印迹异常调控的关系. 上海医科大学学报, 1999;26:79-82, http://www.100md.com(范子荣 杨冬华 覃汉荣)