狗胆囊上皮细胞的分离及原代培养
中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所 1分子生物学中心 2消化内科 重庆市 400042
项目负责人 刘苹中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所 分子生物学中心 重庆市 400042
收稿日期 2000-09-21 接收日期 2000-09-28
主题词 胆囊；上皮细胞；胶原酶；胶原；细胞分离；狗，免疫组织化学
刘苹, 陈东风. 狗胆囊上皮细胞的分离及原代培养. 世界华人消化杂志，2001；9(1)：99-100
胆囊的主要功能是贮存、浓缩和排泄胆汁，上述功能的发挥与胆囊上皮细胞有着十分密切的联系[1-6]. 胆囊好发疾病如胆囊炎、胆石症、胆囊癌等，都是以胆囊上皮细胞为病变的靶位、损伤因素攻击的中心[7,8]. 可以认为，胆囊上皮细胞是胆囊生理功能及病理状态的中心环节[9]. 而要研究胆囊上皮细胞的粘液分泌能力、离子转运功能、对炎症递质的反应和病理状态改变等，首先需进行胆囊上皮细胞的分离和原代培养. 由于正常人胆囊标本来源困难，狗和兔被作为胆囊上皮细胞分离培养的常用动物. 我们经过反复摸索，在国内首次成功地原代分离培养了狗胆囊上皮细胞，为进一步研究胆囊的生理功能和相关疾病奠定了基础.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 成年健康2岁龄狗，雌雄不拘，本院所动物中心提供. D-Hanks，Hanks及PBS液. DMEM/HamF12培养基(Sigma)：按说明分别配制，加入青、链霉素(100kU·L-1，100kug·L-1)，过滤除菌，冻存备用，用时1∶1混合. Ⅳ型胶原酶(Sigma)：以超纯水配制2.5g·L-1溶液，过滤除菌后-20℃保存. 包被液：Ⅳ型胶原(Sigma)配成200g·L-1，4℃保存. 小牛血清(Hyclon)：加入培养基至终体积分数100mL·L-1. CK19抗体(Santa Cruze).
1.2 方法 先用小牛血清包被培养板，37℃烘干后，再用配制好的包被液进行包被. 成年健康家犬，10g·L-1戊巴比妥钠麻醉后，剪毛消毒，剖腹，无菌条件下取出胆囊，剪开胆囊翻出粘膜，弃胆汁，Hanks缓冲液冲洗，无菌纱布蘸干，修剪胆囊，仅留胆囊粘膜层，将其剪成1cm×1cm小块，置于消化液中，37℃孵育，每5min收集消化液，共4次，置于离心管中，800r·min-1 5min×2. 弃上清，加入完全培养基，台盼蓝染色活细胞计数>95%，调整细胞密度至5～10×107·L-1，接种于12孔板，置37℃，50mL·L-1 CO2培养箱培养. 4h行细胞计数，制作生长曲线，每2d～3d换液，倒置显微镜观察细胞形态及贴壁情况. 上述培养细胞用胆囊上皮细胞特异性标记物角蛋白
, 百拇医药
CK19抗体通过免疫组化方法来鉴定，观察反应情况.
2 结果
2.1 狗胆囊上皮细胞的分离与生长
图1 狗胆囊上皮细胞的生长曲线.
2.2 形态变化与鉴定 狗胆囊上皮细胞体外培养最初呈圆形或卵圆形，1d后出现典型分裂相，胞质内可见二倍体核型；进入2d细胞分裂旺盛，相互聚积有贴壁倾向；3d细胞明显贴壁，呈扁平多角形，胞质中央可见圆形细胞核，细胞间连接成片，此状态可持续到7d. 此后细胞分裂减慢，活细胞开始解离和死亡，至10d细胞明显减少，14d细胞完全死亡. 形态观察表明，原代培养的狗胆囊上皮细胞在1wk内生长、分裂能力很强，此后逐渐减退，最长可达14d. 分离培养的细胞与胆囊上皮细胞特异性标记物角蛋白CK19呈棕褐色阳性反应，证实为胆囊上皮细胞.
, 百拇医药
3 讨论
胆囊上皮细胞(gallbladder epithelial cell, GBEC)是胆囊与胆汁相互作用的临界，它有分泌和吸收功能，在胆汁浓缩、结石形成中有着重要意义，同时也是许多病原体如细菌、寄生虫等作用的部位[10]. 胆囊上皮细胞的分离培养是研究胆囊疾病的前提条件. 与其他上皮细胞一样，胆囊粘膜上皮细胞分化程度高，生长条件要求苛刻，体外培养困难. 1991年Oda Dolphine在世界上首次成功地建立了胆囊上皮细胞体外培养方法[11]，而国内一直没有成功的报道. 我们经过反复摸索并改进既往文献中的方法，在国内首次成功地建立了狗胆囊上皮细胞(DGBEC)的分离培养方法，为人体胆囊上皮细胞的分离培养奠定了基础.
将狗胆囊上皮细胞从胆囊粘膜分离下来较为困难，既往文献[12]常用胰酶-EDTA消化液分离GBEC，与我们选用的Ⅳ型胶原酶消化法相比，前者分离时间长，细胞解离不充分且损伤大，所得细胞极少，培养时细胞活性差，而Ⅳ型胶原酶消化法基本克服了上述缺点，分离效果好. 判断细胞体外培养是否成功的重要标志是培养的细胞能否贴壁并融合成单层. 培养于未包被的塑料瓶皿中的DGBEC，始终处于悬浮状态，贴壁性很差，细胞分裂缓慢. 我们将塑料瓶皿预先用Ⅳ型胶原和100mL·L-1小牛血清联合包被用于培养，培养的DGBEC在3d便可贴壁，生长旺盛，相互接触形成单层，甚至可形成腺管样结构. 提示体外培养较困难的细胞，可采用预先包被培养器皿的办法.
, 百拇医药
DGBEC对培养液要求较高，我们发现它在RPMI1640培养液中生长缓慢，细胞死亡快，即使增加接种量也不能明显延长存活时间. 可能由于RPMI1640培养液不含无机盐和次黄嘌呤等细胞代谢所需物质. 我们将DGBEC置于营养丰富的DMED/HAM F12培养基中，细胞生长旺盛，贴壁快，迅速形成单层，培养效果满意.
4 参考文献
1 Alpini G, Lenzi R, Zhai WR, Slott PA, Liu MH, Sarkozi L, Tavoloni N. Bile secretory function of intrahepatic biliary epithelium in the
rat. Am J Physiol, 1989;257:G124-133
, 百拇医药
2 LaRusso NF. Proteins in bile: how they get there and what they do. Am J Physiol, 1984;247:G199-205
3 Lee SP. The mechanism of mucus secretion by the gallbladder epithelium. Br J Exp Path, 1980;61:117-119
4 Neiderbiser DH, Harmon CK, Roth HP. Absorption of cholesterol by the gallbladder. J Lipid Res, 1976;17:117-123
5 Reuss L. Ion transport across gallbi adder epithelium. Physiol Reviews, 1989;69:503-505
, 百拇医药
6 Tavoloni N. Role of ductular bile water reabsorption in canine bile secretion. J Lab Clin Med, 1985;106:154-161
7 Lee SP, Scott AJ. The evolution of morphologic changes in the gallbladder before stone formation in mice fed a cholesterol-cholic
acid diet. Am J Pathol, 1982;108:1-8
8 Nakanuma Y, Hirai N, Kono N, Ohta G. Histological and ultrastructural examination of the mtrahepatic biliary tree in primary
, 百拇医药
sclerosing cholangitis. Liver, 1986;6:317-323
9 LaRusso NF, Hoerl BJ, Vroman BT, Scott RE. Biological characteristics of cultured human gallbladder epithelial cells
(abstr). Hepatology, 1989;10:636-645
10 Chalifoux LV, MacKey J, Carville A, Shvetz D, Lin KC, Lackner A, Mansfield KG. Ultrastructural morphology of Enterocytozoon bieneusi
in biliary epithelium of rhesus macaques (Macaca mulatta). Vet Pathol, 1998;35: 292-296
11 Oda D, Lee SP, Hayashi A. Long-term culture and partial characterization of dog gallbladder epithelial cells.
Lab Invest, 1991;64:682-691
12 Purdum PP, Ulissi A, Hylemon PB. Culture human gallbladder epithelia. Lab Invest, 1993;68:345-353, 百拇医药(刘 苹1 陈东风2 )
项目负责人 刘苹中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所 分子生物学中心 重庆市 400042
收稿日期 2000-09-21 接收日期 2000-09-28
主题词 胆囊；上皮细胞；胶原酶；胶原；细胞分离；狗，免疫组织化学
刘苹, 陈东风. 狗胆囊上皮细胞的分离及原代培养. 世界华人消化杂志，2001；9(1)：99-100
胆囊的主要功能是贮存、浓缩和排泄胆汁，上述功能的发挥与胆囊上皮细胞有着十分密切的联系[1-6]. 胆囊好发疾病如胆囊炎、胆石症、胆囊癌等，都是以胆囊上皮细胞为病变的靶位、损伤因素攻击的中心[7,8]. 可以认为，胆囊上皮细胞是胆囊生理功能及病理状态的中心环节[9]. 而要研究胆囊上皮细胞的粘液分泌能力、离子转运功能、对炎症递质的反应和病理状态改变等，首先需进行胆囊上皮细胞的分离和原代培养. 由于正常人胆囊标本来源困难，狗和兔被作为胆囊上皮细胞分离培养的常用动物. 我们经过反复摸索，在国内首次成功地原代分离培养了狗胆囊上皮细胞，为进一步研究胆囊的生理功能和相关疾病奠定了基础.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 成年健康2岁龄狗，雌雄不拘，本院所动物中心提供. D-Hanks，Hanks及PBS液. DMEM/HamF12培养基(Sigma)：按说明分别配制，加入青、链霉素(100kU·L-1，100kug·L-1)，过滤除菌，冻存备用，用时1∶1混合. Ⅳ型胶原酶(Sigma)：以超纯水配制2.5g·L-1溶液，过滤除菌后-20℃保存. 包被液：Ⅳ型胶原(Sigma)配成200g·L-1，4℃保存. 小牛血清(Hyclon)：加入培养基至终体积分数100mL·L-1. CK19抗体(Santa Cruze).
1.2 方法 先用小牛血清包被培养板，37℃烘干后，再用配制好的包被液进行包被. 成年健康家犬，10g·L-1戊巴比妥钠麻醉后，剪毛消毒，剖腹，无菌条件下取出胆囊，剪开胆囊翻出粘膜，弃胆汁，Hanks缓冲液冲洗，无菌纱布蘸干，修剪胆囊，仅留胆囊粘膜层，将其剪成1cm×1cm小块，置于消化液中，37℃孵育，每5min收集消化液，共4次，置于离心管中，800r·min-1 5min×2. 弃上清，加入完全培养基，台盼蓝染色活细胞计数>95%，调整细胞密度至5～10×107·L-1，接种于12孔板，置37℃，50mL·L-1 CO2培养箱培养. 4h行细胞计数，制作生长曲线，每2d～3d换液，倒置显微镜观察细胞形态及贴壁情况. 上述培养细胞用胆囊上皮细胞特异性标记物角蛋白
, 百拇医药
CK19抗体通过免疫组化方法来鉴定，观察反应情况.
2 结果
2.1 狗胆囊上皮细胞的分离与生长
图1 狗胆囊上皮细胞的生长曲线.
2.2 形态变化与鉴定 狗胆囊上皮细胞体外培养最初呈圆形或卵圆形，1d后出现典型分裂相，胞质内可见二倍体核型；进入2d细胞分裂旺盛，相互聚积有贴壁倾向；3d细胞明显贴壁，呈扁平多角形，胞质中央可见圆形细胞核，细胞间连接成片，此状态可持续到7d. 此后细胞分裂减慢，活细胞开始解离和死亡，至10d细胞明显减少，14d细胞完全死亡. 形态观察表明，原代培养的狗胆囊上皮细胞在1wk内生长、分裂能力很强，此后逐渐减退，最长可达14d. 分离培养的细胞与胆囊上皮细胞特异性标记物角蛋白CK19呈棕褐色阳性反应，证实为胆囊上皮细胞.
, 百拇医药
3 讨论
胆囊上皮细胞(gallbladder epithelial cell, GBEC)是胆囊与胆汁相互作用的临界，它有分泌和吸收功能，在胆汁浓缩、结石形成中有着重要意义，同时也是许多病原体如细菌、寄生虫等作用的部位[10]. 胆囊上皮细胞的分离培养是研究胆囊疾病的前提条件. 与其他上皮细胞一样，胆囊粘膜上皮细胞分化程度高，生长条件要求苛刻，体外培养困难. 1991年Oda Dolphine在世界上首次成功地建立了胆囊上皮细胞体外培养方法[11]，而国内一直没有成功的报道. 我们经过反复摸索并改进既往文献中的方法，在国内首次成功地建立了狗胆囊上皮细胞(DGBEC)的分离培养方法，为人体胆囊上皮细胞的分离培养奠定了基础.
将狗胆囊上皮细胞从胆囊粘膜分离下来较为困难，既往文献[12]常用胰酶-EDTA消化液分离GBEC，与我们选用的Ⅳ型胶原酶消化法相比，前者分离时间长，细胞解离不充分且损伤大，所得细胞极少，培养时细胞活性差，而Ⅳ型胶原酶消化法基本克服了上述缺点，分离效果好. 判断细胞体外培养是否成功的重要标志是培养的细胞能否贴壁并融合成单层. 培养于未包被的塑料瓶皿中的DGBEC，始终处于悬浮状态，贴壁性很差，细胞分裂缓慢. 我们将塑料瓶皿预先用Ⅳ型胶原和100mL·L-1小牛血清联合包被用于培养，培养的DGBEC在3d便可贴壁，生长旺盛，相互接触形成单层，甚至可形成腺管样结构. 提示体外培养较困难的细胞，可采用预先包被培养器皿的办法.
, 百拇医药
DGBEC对培养液要求较高，我们发现它在RPMI1640培养液中生长缓慢，细胞死亡快，即使增加接种量也不能明显延长存活时间. 可能由于RPMI1640培养液不含无机盐和次黄嘌呤等细胞代谢所需物质. 我们将DGBEC置于营养丰富的DMED/HAM F12培养基中，细胞生长旺盛，贴壁快，迅速形成单层，培养效果满意.
4 参考文献
1 Alpini G, Lenzi R, Zhai WR, Slott PA, Liu MH, Sarkozi L, Tavoloni N. Bile secretory function of intrahepatic biliary epithelium in the
rat. Am J Physiol, 1989;257:G124-133
, 百拇医药
2 LaRusso NF. Proteins in bile: how they get there and what they do. Am J Physiol, 1984;247:G199-205
3 Lee SP. The mechanism of mucus secretion by the gallbladder epithelium. Br J Exp Path, 1980;61:117-119
4 Neiderbiser DH, Harmon CK, Roth HP. Absorption of cholesterol by the gallbladder. J Lipid Res, 1976;17:117-123
5 Reuss L. Ion transport across gallbi adder epithelium. Physiol Reviews, 1989;69:503-505
, 百拇医药
6 Tavoloni N. Role of ductular bile water reabsorption in canine bile secretion. J Lab Clin Med, 1985;106:154-161
7 Lee SP, Scott AJ. The evolution of morphologic changes in the gallbladder before stone formation in mice fed a cholesterol-cholic
acid diet. Am J Pathol, 1982;108:1-8
8 Nakanuma Y, Hirai N, Kono N, Ohta G. Histological and ultrastructural examination of the mtrahepatic biliary tree in primary
, 百拇医药
sclerosing cholangitis. Liver, 1986;6:317-323
9 LaRusso NF, Hoerl BJ, Vroman BT, Scott RE. Biological characteristics of cultured human gallbladder epithelial cells
(abstr). Hepatology, 1989;10:636-645
10 Chalifoux LV, MacKey J, Carville A, Shvetz D, Lin KC, Lackner A, Mansfield KG. Ultrastructural morphology of Enterocytozoon bieneusi
in biliary epithelium of rhesus macaques (Macaca mulatta). Vet Pathol, 1998;35: 292-296
11 Oda D, Lee SP, Hayashi A. Long-term culture and partial characterization of dog gallbladder epithelial cells.
Lab Invest, 1991;64:682-691
12 Purdum PP, Ulissi A, Hylemon PB. Culture human gallbladder epithelia. Lab Invest, 1993;68:345-353, 百拇医药(刘 苹1 陈东风2 )