三氧化二砷诱导大肠癌细胞株SW620凋亡
中山医科大学孙逸仙纪念医院 1内科 2肿瘤科 广东省广州市 510120
项目负责人 詹俊中山医科大学孙逸仙纪念医院 1内科 2肿瘤科 广东省广州市 510120
收稿日期 2000-10-10 接受日期 2000-10-12
主题词 三氧化二砷；结肠直肠肿瘤；细胞凋亡；流式细胞术；印迹法，蛋白质；抗肿瘤药
詹俊, 谢德荣, 姚和瑞, 林显敢, 梁新文, 向燕群. 三氧化二砷诱导大肠癌细胞株SW620凋亡. 世界华人消化杂志，2001；9(2)：228-229
, 百拇医药
大肠癌的发病率与死亡率逐年上升[1,2]，严重威胁人们的身心健康，平均5年生存率低于40%. 积极探讨大肠癌综合治疗的新手段有重要的临床和社会经济意义. 研究表明，多种肿瘤的发生与细胞凋亡障碍有关[3-6]，诱导肿瘤细胞凋亡可能成为肿瘤治疗中有前景的手段之一. 三氧化二砷(As2O3)是近年来新认识的对多种肿瘤有良好效果的药物，能诱导多种肿瘤细胞凋亡[7-9]，但对大肠癌的作用未见报道，我们对此进行初步探讨.
1 材料和方法
1.1 材料 大肠癌细胞株SW620由本院宋尔卫博士惠赠，传代培养于含100mL·L-1小牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37℃， 50mL·L-1 CO2. 1g·L-1 As2O3购自哈尔滨医科大学附属第一医院，临用时用PBS稀释至所需浓度.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 细胞凋亡检测 采用FITC-TUNEL染色流式细胞仪检测. SW620细胞接种于96孔板，100μL完全培养基中，每孔细胞数为7×103. 参照文献[10]所采用的浓度分别加1.25，2.5，5，10mg·L-1 As2O3. 对照组和不同浓度组各设5个实验孔. 培养3d后倾去培养基， PBS洗2次. 加入细胞穿孔剂(1g·L-1 TritonX-100 + 1g·L-1柠檬酸钠)于冰上孵育2min. PBS洗2次，加入TUNEL反应液(Boehringer Mannheim产品：含10.0μL TdT反应缓冲液，8.0μL荧光标记dUTP，32.25μL蒸馏水和0.75μL TdT)，37℃下孵育60min. 终止反应后PBS洗2次，重悬于PBS中，流式细胞仪检测，并用LYSIS Ⅱ软件进行分析.
, 百拇医药
1.2.2 Western印迹法检测多聚ADP核糖聚合酶(PARP)片段 SW620细胞培养如前，加入1.25，5mg·L-1 As2O3. 培养3d后倾去培养基. 裂解大肠癌细胞株SW620细胞，提取细胞溶解液的蛋白质(参照《分子克隆指南》)，经120g·L-1 SDS-PAGE电泳，然后电转移至NC膜上，用兔抗人抗PARP多克隆抗体(Boehringer Mannheim公司)作Ⅰ抗体，HRP标记的羊抗兔IgG(Boehringer Mannheim公司产品)作Ⅱ抗体，ECL(Santa公司产品)荧光显色. 设阳性及阴性对照.
2 结果
2.1 大肠癌细胞的凋亡指数 随三氧化二砷浓度增加，大肠癌细胞株SW620的凋亡指数(AI%)逐渐上升(图1，2).
, http://www.100md.com
图1 SW620细胞的凋亡指数. (n=5)
图2 FITC-TUNEL染色流式细胞仪检测.A：1.25mg·L-1 B：10mg·L-1
2.2 多聚ADP核糖聚合酶(PARP)片段检测 1.25mg·L-1的As2O3处理3d后PARP的Mr89000片段呈阴性； 5mg·L-1的As2O3处理3d后PARP的Mr89000片段呈阳性(图3).
, 百拇医药
图3 SW620细胞PARP片段.A：阴性对照; B：阳性对照; C：1.25mg·L-1; D：5mg·L-1
3 讨论
大肠癌化学治疗的效果不甚理想，目前除氟尿嘧啶(5-FU)外对其有效的药物不多[11,12]. 三氧化二砷(As2O3)的抗肿瘤作用首先由我国学者发现并对其进行了深入的研究. 现已证实其对多种肿瘤包括急性早幼粒细胞白血病、胃癌、食管癌等有良好效果并已被应用于临床[7-9,13]其抗肿瘤作用越来越受到人们的关注. 能否用于大肠癌的治疗值得研究. 近年的研究发现，肿瘤的发生、发展不仅与细胞的异常增殖有关，还与细胞的分化、凋亡障碍有关，在大肠癌的发生、发展中亦存在细胞凋亡障碍[14-16]，针对凋亡障碍的肿瘤治疗是目前研究的热点之一，在食管癌、肝癌等恶性肿瘤中，三氧化二砷的作用主要是通过诱导凋亡实现的[8,9].
, 百拇医药
与在其他肿瘤中的研究结果相似，我们的初步研究发现，三氧化二砷能诱导大肠癌细胞株SW620发生细胞凋亡，随浓度升高，凋亡指数逐渐上升，提示其作用呈剂量依赖性. 多聚ADP核糖聚合酶(PARP)是一种Mr为113000的蛋白酶，当DNA损伤时，PARP可识别结合到DNA断裂处并被激活而参与DNA的修复. 它是细胞凋亡中第一个被鉴定由caspase-3降解的DNA修复酶[17]. 细胞凋亡早期， PARP被切割为约Mr24000 和Mr 89000大小的片段，使其降解而丧失其DNA修复功能，促进细胞凋亡的发生. 因此Mr 89000大小PARP酶切片段的检测也常用于早期细胞凋亡的鉴定. 本研究发现As2O3诱导SW620大肠癌细胞凋亡过程中PARP被切割. 可以推测，As2O3作用下，PARP被切割降解，失去DNA修复功能，促进凋亡的发生. Western-blot检测时1.25mg·L-1 As2O3作用时PARP片段检测呈阴性，而5mg·L-1 As2O3作用时PARP片段检测呈阳性，这亦支持As2O3诱导SW620细胞凋亡呈浓度依赖性. 总之，As2O3能诱导大肠癌细胞株SW620细胞凋亡，参与DNA修复功能的PARP被降解而失去DNA修复功能可能是As2O3诱导凋亡的机制之一.
, 百拇医药
4 参考文献
1 于皆平, 董卫国. 大肠癌早期诊断的现状. 世界华人消化杂志, 1999;7:553-554
2 崔龙, 曹广文, 王元和, 屠岳, 孟荣贵, 高军, 仇小芳, 吴宗娣. 含HSV-tk基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建.
华人消化杂志, 1998;6:647-649
3 沈云芳, 庄蕙, 沈健伟, 陈士葆. 细胞凋亡与肿瘤. 世界华人消化杂志, 1999;7:267-268
4 薛绪潮, 方国恩, 华积德. 胃癌与细胞凋亡. 世界华人消化杂志, 1999;7:359-361
, http://www.100md.com
5 乔庆, 吴金生, 张静, 马庆久, 赖大年. 凋亡相关基因bcl-2, bax在人类大肠腺癌中的表达意义. 世界华人消化杂志,1999;7:936-938
6 石景森. 癌基因、抑癌基因、细胞凋亡与原发性胆囊癌. 华人消化杂志, 1998;6:430-431
7 涂水平, 江石湖, 谭继宏, 蒋晓华, 乔敏敏, 章永平, 吴云林, 吴裕忻. 氧化砷抑制胃癌SGC-7901细胞增殖和诱导凋亡作用.
世界华人消化杂志, 1999;7:18-21
8 陈惠英, 刘文虎, 秦叔逵. 三氧化二砷对肝癌细胞株凋亡的诱导作用. 世界华人消化杂志，2000;8:532-535
9 沈忠英, 沈文英, 陈铭华, 洪超群, 沈健. 氧化砷诱导食管癌细胞凋亡中一氧化氮的变化. 世界华人消化杂志，2000;8:1001-1104
, http://www.100md.com
10 陈其奎, 袁世珍, 黄志清. 三氧化二砷诱导胰腺癌细胞周期阻滞与凋亡作用. 中华医学杂志, 1998;78:578-579
11 许健, 陈君坤, 刘福坤, 吴波, 黄伟, 曹建民, 李成郎. 大肠癌术前化疗疗效的病理组织学对照研究. 华人消化杂志, 1998;6:891-893
12 崔龙, 曹广文, 王元和, 屠岳, 孟荣贵, 高军, 仇小芳, 吴宗娣, 谢苏庆. 含CD基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建.
华人消化杂志, 1998;6:650-652
13 Chen GQ, Zhu J, Shi XG, Ni JH, Zhong HJ, Si GY, Jin XL, Tang W, Li XS, Xong SM, Shen ZX, Sun GL, Ma J, Zhang P, Zhang TD,Gazin C, Naoe T, Chen SJ, Wang ZY, Chen Z. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3)
, 百拇医药
in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of bcl-2
expression and modulation of PML-RARα/PML proteins. Blood, 1996;88:1052-1061
14 孙燕翔, 周汉高, 谢大业, 师英强. 大肠肿瘤与细胞凋亡. 新消化病学杂志, 1997;5:791-792
15 陈崇稼, 孙燕翔, 周汉高, 潘伯荣, 郑颂国, 洪兴中, 刘家华, 冯蔚鹰. bcl-2与p53在大肠腺瘤和大肠癌中的表达.
华人消化杂志, 1998;6:683-685
16 操寄望, 罗和生. Bcl-2基因家族与消化道肿瘤. 新消化病学杂志, 1997;5:734-735
17 Kaufmann SH, Desnoyers S, Ottaviano Y, Davidson NE, Poirier GG. Specific proteolytic cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase:
an early marker of chemotherapy-induced apoptosis. Cancer Res, 1993;53:3976-3985, 百拇医药(詹 俊1 谢德荣2 姚和瑞2 林显敢2 梁新文2 向燕群2 )
项目负责人 詹俊中山医科大学孙逸仙纪念医院 1内科 2肿瘤科 广东省广州市 510120
收稿日期 2000-10-10 接受日期 2000-10-12
主题词 三氧化二砷；结肠直肠肿瘤；细胞凋亡；流式细胞术；印迹法，蛋白质；抗肿瘤药
詹俊, 谢德荣, 姚和瑞, 林显敢, 梁新文, 向燕群. 三氧化二砷诱导大肠癌细胞株SW620凋亡. 世界华人消化杂志，2001；9(2)：228-229
, 百拇医药
大肠癌的发病率与死亡率逐年上升[1,2]，严重威胁人们的身心健康，平均5年生存率低于40%. 积极探讨大肠癌综合治疗的新手段有重要的临床和社会经济意义. 研究表明，多种肿瘤的发生与细胞凋亡障碍有关[3-6]，诱导肿瘤细胞凋亡可能成为肿瘤治疗中有前景的手段之一. 三氧化二砷(As2O3)是近年来新认识的对多种肿瘤有良好效果的药物，能诱导多种肿瘤细胞凋亡[7-9]，但对大肠癌的作用未见报道，我们对此进行初步探讨.
1 材料和方法
1.1 材料 大肠癌细胞株SW620由本院宋尔卫博士惠赠，传代培养于含100mL·L-1小牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37℃， 50mL·L-1 CO2. 1g·L-1 As2O3购自哈尔滨医科大学附属第一医院，临用时用PBS稀释至所需浓度.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 细胞凋亡检测 采用FITC-TUNEL染色流式细胞仪检测. SW620细胞接种于96孔板，100μL完全培养基中，每孔细胞数为7×103. 参照文献[10]所采用的浓度分别加1.25，2.5，5，10mg·L-1 As2O3. 对照组和不同浓度组各设5个实验孔. 培养3d后倾去培养基， PBS洗2次. 加入细胞穿孔剂(1g·L-1 TritonX-100 + 1g·L-1柠檬酸钠)于冰上孵育2min. PBS洗2次，加入TUNEL反应液(Boehringer Mannheim产品：含10.0μL TdT反应缓冲液，8.0μL荧光标记dUTP，32.25μL蒸馏水和0.75μL TdT)，37℃下孵育60min. 终止反应后PBS洗2次，重悬于PBS中，流式细胞仪检测，并用LYSIS Ⅱ软件进行分析.
, 百拇医药
1.2.2 Western印迹法检测多聚ADP核糖聚合酶(PARP)片段 SW620细胞培养如前，加入1.25，5mg·L-1 As2O3. 培养3d后倾去培养基. 裂解大肠癌细胞株SW620细胞，提取细胞溶解液的蛋白质(参照《分子克隆指南》)，经120g·L-1 SDS-PAGE电泳，然后电转移至NC膜上，用兔抗人抗PARP多克隆抗体(Boehringer Mannheim公司)作Ⅰ抗体，HRP标记的羊抗兔IgG(Boehringer Mannheim公司产品)作Ⅱ抗体，ECL(Santa公司产品)荧光显色. 设阳性及阴性对照.
2 结果
2.1 大肠癌细胞的凋亡指数 随三氧化二砷浓度增加，大肠癌细胞株SW620的凋亡指数(AI%)逐渐上升(图1，2).
, http://www.100md.com
图1 SW620细胞的凋亡指数. (n=5)
图2 FITC-TUNEL染色流式细胞仪检测.A：1.25mg·L-1 B：10mg·L-1
2.2 多聚ADP核糖聚合酶(PARP)片段检测 1.25mg·L-1的As2O3处理3d后PARP的Mr89000片段呈阴性； 5mg·L-1的As2O3处理3d后PARP的Mr89000片段呈阳性(图3).
, 百拇医药
图3 SW620细胞PARP片段.A：阴性对照; B：阳性对照; C：1.25mg·L-1; D：5mg·L-1
3 讨论
大肠癌化学治疗的效果不甚理想，目前除氟尿嘧啶(5-FU)外对其有效的药物不多[11,12]. 三氧化二砷(As2O3)的抗肿瘤作用首先由我国学者发现并对其进行了深入的研究. 现已证实其对多种肿瘤包括急性早幼粒细胞白血病、胃癌、食管癌等有良好效果并已被应用于临床[7-9,13]其抗肿瘤作用越来越受到人们的关注. 能否用于大肠癌的治疗值得研究. 近年的研究发现，肿瘤的发生、发展不仅与细胞的异常增殖有关，还与细胞的分化、凋亡障碍有关，在大肠癌的发生、发展中亦存在细胞凋亡障碍[14-16]，针对凋亡障碍的肿瘤治疗是目前研究的热点之一，在食管癌、肝癌等恶性肿瘤中，三氧化二砷的作用主要是通过诱导凋亡实现的[8,9].
, 百拇医药
与在其他肿瘤中的研究结果相似，我们的初步研究发现，三氧化二砷能诱导大肠癌细胞株SW620发生细胞凋亡，随浓度升高，凋亡指数逐渐上升，提示其作用呈剂量依赖性. 多聚ADP核糖聚合酶(PARP)是一种Mr为113000的蛋白酶，当DNA损伤时，PARP可识别结合到DNA断裂处并被激活而参与DNA的修复. 它是细胞凋亡中第一个被鉴定由caspase-3降解的DNA修复酶[17]. 细胞凋亡早期， PARP被切割为约Mr24000 和Mr 89000大小的片段，使其降解而丧失其DNA修复功能，促进细胞凋亡的发生. 因此Mr 89000大小PARP酶切片段的检测也常用于早期细胞凋亡的鉴定. 本研究发现As2O3诱导SW620大肠癌细胞凋亡过程中PARP被切割. 可以推测，As2O3作用下，PARP被切割降解，失去DNA修复功能，促进凋亡的发生. Western-blot检测时1.25mg·L-1 As2O3作用时PARP片段检测呈阴性，而5mg·L-1 As2O3作用时PARP片段检测呈阳性，这亦支持As2O3诱导SW620细胞凋亡呈浓度依赖性. 总之，As2O3能诱导大肠癌细胞株SW620细胞凋亡，参与DNA修复功能的PARP被降解而失去DNA修复功能可能是As2O3诱导凋亡的机制之一.
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4 参考文献
1 于皆平, 董卫国. 大肠癌早期诊断的现状. 世界华人消化杂志, 1999;7:553-554
2 崔龙, 曹广文, 王元和, 屠岳, 孟荣贵, 高军, 仇小芳, 吴宗娣. 含HSV-tk基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建.
华人消化杂志, 1998;6:647-649
3 沈云芳, 庄蕙, 沈健伟, 陈士葆. 细胞凋亡与肿瘤. 世界华人消化杂志, 1999;7:267-268
4 薛绪潮, 方国恩, 华积德. 胃癌与细胞凋亡. 世界华人消化杂志, 1999;7:359-361
, http://www.100md.com
5 乔庆, 吴金生, 张静, 马庆久, 赖大年. 凋亡相关基因bcl-2, bax在人类大肠腺癌中的表达意义. 世界华人消化杂志,1999;7:936-938
6 石景森. 癌基因、抑癌基因、细胞凋亡与原发性胆囊癌. 华人消化杂志, 1998;6:430-431
7 涂水平, 江石湖, 谭继宏, 蒋晓华, 乔敏敏, 章永平, 吴云林, 吴裕忻. 氧化砷抑制胃癌SGC-7901细胞增殖和诱导凋亡作用.
世界华人消化杂志, 1999;7:18-21
8 陈惠英, 刘文虎, 秦叔逵. 三氧化二砷对肝癌细胞株凋亡的诱导作用. 世界华人消化杂志，2000;8:532-535
9 沈忠英, 沈文英, 陈铭华, 洪超群, 沈健. 氧化砷诱导食管癌细胞凋亡中一氧化氮的变化. 世界华人消化杂志，2000;8:1001-1104
, http://www.100md.com
10 陈其奎, 袁世珍, 黄志清. 三氧化二砷诱导胰腺癌细胞周期阻滞与凋亡作用. 中华医学杂志, 1998;78:578-579
11 许健, 陈君坤, 刘福坤, 吴波, 黄伟, 曹建民, 李成郎. 大肠癌术前化疗疗效的病理组织学对照研究. 华人消化杂志, 1998;6:891-893
12 崔龙, 曹广文, 王元和, 屠岳, 孟荣贵, 高军, 仇小芳, 吴宗娣, 谢苏庆. 含CD基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建.
华人消化杂志, 1998;6:650-652
13 Chen GQ, Zhu J, Shi XG, Ni JH, Zhong HJ, Si GY, Jin XL, Tang W, Li XS, Xong SM, Shen ZX, Sun GL, Ma J, Zhang P, Zhang TD,Gazin C, Naoe T, Chen SJ, Wang ZY, Chen Z. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3)
, 百拇医药
in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of bcl-2
expression and modulation of PML-RARα/PML proteins. Blood, 1996;88:1052-1061
14 孙燕翔, 周汉高, 谢大业, 师英强. 大肠肿瘤与细胞凋亡. 新消化病学杂志, 1997;5:791-792
15 陈崇稼, 孙燕翔, 周汉高, 潘伯荣, 郑颂国, 洪兴中, 刘家华, 冯蔚鹰. bcl-2与p53在大肠腺瘤和大肠癌中的表达.
华人消化杂志, 1998;6:683-685
16 操寄望, 罗和生. Bcl-2基因家族与消化道肿瘤. 新消化病学杂志, 1997;5:734-735
17 Kaufmann SH, Desnoyers S, Ottaviano Y, Davidson NE, Poirier GG. Specific proteolytic cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase:
an early marker of chemotherapy-induced apoptosis. Cancer Res, 1993;53:3976-3985, 百拇医药(詹 俊1 谢德荣2 姚和瑞2 林显敢2 梁新文2 向燕群2 )