HCV感染者检测血清及外周血单个核细胞HCV RNA的意义
湖南医科大学附属湘雅医院 1检验科 2传染科 湖南省长沙市 410008
项目负责人 刘文恩 湖南医科大学附属湘雅医院 检验科 湖南省长沙市 410008Tel. 0086-731-4327437
Email. liuwenen@hotmail.com
收稿日期 2000-07-17 接受日期 2000-07-21
主题词 肝炎病毒，丙型；单核细胞；聚合酶链反应；核糖核酸；血清诊断；输血
刘文恩, 谭德明, 范学工, 张铮, 欧阳颗. HCV感染者检测血清及外周血单个核细胞HCV RNA的意义. 世界华人消化杂志，2001；9(2)：235
, http://www.100md.com
丙型肝炎病毒(HCV)是输血后肝炎的主要致病因素[1]. 至少50%以上的急性丙型肝炎转为慢性，其中又有10%～20%发展为肝硬变，部分病例最终发展为肝细胞肝癌[2]. HCV感染慢性化的原因一直是研究的热点. 近几年来，国外学者报道HCV可以感染外周血单个核细胞(PBMC),但国内报道甚少[5]. 作者对一批慢性HCV感染者进行血清及PBMC HCV RNA检测，旨在探讨同时检测HCV感染者血清及PBMC中HCV RNA的意义及HCV感染慢性化的原因，现报道如下.
1 材料和方法
1.1 材料 HCV感染者31例系我院传染科1998-12/1999-05门诊和住院患者. 男19例，女12例，平均年龄46岁；均有输血或血制品史，感染史至少在1a以上. HCV感染的诊断根据血清ALT、血清抗HCV和HCV RNA的测定. 20例健康献血员作为阴性对照.
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1.2 方法 根据密度梯度离心法分离收集PBMC，同时收集末次洗涤液. 按异硫氰胍一步法提取HCV RNA. 取无菌血清、PBMC、分离PBMC末次洗涤液及阴性对照标本同时进行RNA提取，将提取的RNA溶于DEPC水20μL中，贮存于-70℃低温冰箱. HCV RNA检测采用RT-PCR方法进行检测. HCV RNA RT-PCR试剂盒购于厦门长城生物工程公司，操作按说明进行.
2 结果
HCV感染者31例血清HCV RNA阳性9例，阳性率29%；PBMC中HCV RNA阳性23例，阳性率74%. 血清HCV RNA阳性9例，PBMC HCV RNA也均为阳性；23例PBMC HCV RNA阳性中13例血清HCV RNA阴性. 阴性对照及分离PBMC末次洗涤液HCV RNA均为阴性. 结果显示，HCV感染者PBMC HCV RNA阳性率显著高于血清HCV RNA阳性率(χ2=11.770,P<0.005, 表1).
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表1 HCV感染者血清及PBMC HCV RNA检测的比较
bP<0.005vs血清.
3 讨论
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新近研究表明，HCV能感染PBMC并在其中复制[3-5]. HCV感染PBMC的机制有两种可能性：①HCV基因组的突变可能使病毒对PBMC的感染. HCV基因序列各个位置的突变率高达(1.44～1.92)×10-3，这可导致在持续感染的个体中增加突变株的感染；②HCV抗体为非中和性抗体，病毒和抗体复合物可以通过Fc受体进入某些PBMC中，抗体的这种介导作用为HCV感染PBMC提供了一条特异的途径[6]. HCV感染者存在细胞免疫紊乱, HCV感染PBMC后，由于HCV对PBMC直接或间接的破坏作用，可能导致PBMC功能失常或细胞破坏，引起机体免疫功能紊乱[7,8]，导致CD4+细胞对HCV的易感性比CD8+细胞强，使CD4+细胞和CD8+细胞不能很好地协调作用，从而减低了机体的抗病毒能力;另外，由于HCV对PBMC功能的影响，可能导致PBMC表面的HLA-Ⅰa相对不足，不能引起足够的免疫反应来清除病毒[2,6,9]. 本研究结果显示，HCV感染者PBMC中HCV RNA阳性率(74%)显著高于血清HCV RNA阳性率(29%)，说明血清HCV RNA阴性并不意味着HCV的清除，而可能是原本血清浓度很低的HCV暂时消失. 单独检测血清HCV RNA作为诊断和疗效的判断指标有一定局限性[10]. PBMC中的HCV难以被清除，成为肝脏再感染病毒的来源，可能是HCV持续感染的重要原因之一[11-14]. 因此，我们认为PBMC中的HCV可能是HCV感染慢性化的重要原因之一. 通过对HCV感染者同时进行血清及PBMC中HCV RNA检测，可为丙型肝炎的诊断、治疗及预后的判断提供较为可靠的指标，对丙型肝炎慢性化机制的研究具有重要
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意义.
4 参考文献
1 赵西平, 沈汉馨, 田德英, 张东绅, 彭志海, 杨东亮, 郝连杰. 丙型肝炎肝组织中HCV RNA和HCV NS5抗原表达及意义.
世界华人消化杂志, 1999;7:516-518
2 Sansonno D, Iacobelli AR, Cornacchiulo V, Iodice G, Dammacco F. Detection of hepatitis C virus (HCV) proteins by
immunofluorescence and HCV RNA genomic sequences by non-isotopic in situ hybridization in bone marrow and
, 百拇医药
peripheral blood mononuclear cells of chronically HCV-infected patients. Clin Exp Immunol, 1996;103:414-421
3 Zignego AL, Macchia D, Monti M. Infection of peripheral mononuclear blood cells by hepatitis C Virus. J Hepatol,1992;15:382-386
4 Cribier B, Schmitt C, Bingen A, Kirn A, Keller F. In vitro infection of peripheral blood mononuclear cells by hepatitis C virus.
J Gen Virol, 1995;76:2485-2491
, 百拇医药
5 吴海滨, 李智伟, 李颖. 外周血单核细胞中丙型肝炎病毒RNA正负链检测的临床意义. 世界华人消化杂志, 1999;7:220-221
6 高勇, 贺永文. HCV感染外周血单个核细胞和丙型肝炎的关系研究. 《国外医学》流行病学传染病学分册， 1997；24：208-211
7 范学工, 唐发清, 欧志明, 章锦香, 刘国成, 胡国龄. 慢性丙型肝炎病毒感染者外周血淋巴细胞增殖反应. 世界华人消化杂志,1999;7:1038-1040
8 刘文恩, 谭德明, 范学工, 欧阳颗, 张铮. 丙型病毒性肝炎发病机制中自身免疫反应的作用. 世界华人消化杂志, 1999;7:120-121
9 Fan XG, Liu WE, Li CZ, Wang ZC, Luo LX, Tan DM, Hu GL, Zhang Z. Circulating Th1 and Th2 cytokines in patients with hepatitis
, 百拇医药
C virus infection. Med Inflammat, 1998;7:295-297
10 梁雪松, 张树林, 狄鹏超, 蔺淑梅. 慢性HCV感染者IFN治疗前后血清HCV RNA水平. 新消化病学杂志, 1997;5:311-312
11 李威，乔光彦，门永继，孟祥东，林凤双，金玉珠. 丙型肝炎患者外周血CD4+、CD8+、NK细胞分析. 中华微生物学和免疫学杂志,1992；12：363
12 Saleh MG, Tibbs CJ, Koskinas J, Pereira LMMB, Bomford AB, Portmann BC, McFarlane IG, Williams R. Hepatic and extrahepatic
, 百拇医药
hepatitis C virus replication in relation to response to interferon therapy. Hepatology, 1994;20:1399-1404
13 贺永文，刘薇，曾令兰，熊开均，罗端德. 干扰素联合病毒唑对肝炎患者正、负链丙型肝炎病毒RNA的影响. 中华内科杂志,1996；35：32-35
14 Wang JT，Sheu JC，Lin JT，Wang TH, Chen DS. Detection of replicative form of hepatitis C Virus RNA in peripheral
blood mononuclear cells. J Infect Dis, 1992;166:1167-1169, http://www.100md.com(刘文恩1 谭德明2 范学工2 张 铮2 欧阳颗2 )
项目负责人 刘文恩 湖南医科大学附属湘雅医院 检验科 湖南省长沙市 410008Tel. 0086-731-4327437
Email. liuwenen@hotmail.com
收稿日期 2000-07-17 接受日期 2000-07-21
主题词 肝炎病毒，丙型；单核细胞；聚合酶链反应；核糖核酸；血清诊断；输血
刘文恩, 谭德明, 范学工, 张铮, 欧阳颗. HCV感染者检测血清及外周血单个核细胞HCV RNA的意义. 世界华人消化杂志，2001；9(2)：235
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丙型肝炎病毒(HCV)是输血后肝炎的主要致病因素[1]. 至少50%以上的急性丙型肝炎转为慢性，其中又有10%～20%发展为肝硬变，部分病例最终发展为肝细胞肝癌[2]. HCV感染慢性化的原因一直是研究的热点. 近几年来，国外学者报道HCV可以感染外周血单个核细胞(PBMC),但国内报道甚少[5]. 作者对一批慢性HCV感染者进行血清及PBMC HCV RNA检测，旨在探讨同时检测HCV感染者血清及PBMC中HCV RNA的意义及HCV感染慢性化的原因，现报道如下.
1 材料和方法
1.1 材料 HCV感染者31例系我院传染科1998-12/1999-05门诊和住院患者. 男19例，女12例，平均年龄46岁；均有输血或血制品史，感染史至少在1a以上. HCV感染的诊断根据血清ALT、血清抗HCV和HCV RNA的测定. 20例健康献血员作为阴性对照.
, 百拇医药
1.2 方法 根据密度梯度离心法分离收集PBMC，同时收集末次洗涤液. 按异硫氰胍一步法提取HCV RNA. 取无菌血清、PBMC、分离PBMC末次洗涤液及阴性对照标本同时进行RNA提取，将提取的RNA溶于DEPC水20μL中，贮存于-70℃低温冰箱. HCV RNA检测采用RT-PCR方法进行检测. HCV RNA RT-PCR试剂盒购于厦门长城生物工程公司，操作按说明进行.
2 结果
HCV感染者31例血清HCV RNA阳性9例，阳性率29%；PBMC中HCV RNA阳性23例，阳性率74%. 血清HCV RNA阳性9例，PBMC HCV RNA也均为阳性；23例PBMC HCV RNA阳性中13例血清HCV RNA阴性. 阴性对照及分离PBMC末次洗涤液HCV RNA均为阴性. 结果显示，HCV感染者PBMC HCV RNA阳性率显著高于血清HCV RNA阳性率(χ2=11.770,P<0.005, 表1).
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表1 HCV感染者血清及PBMC HCV RNA检测的比较
| HCV RNA | n | HCV RNA | |
| 阳性数 | 阳性率/% | ||
| 血清 | 31 | 9 | 29 |
| PBMC | 31 | 23 | 74b |
bP<0.005vs血清.
3 讨论
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新近研究表明，HCV能感染PBMC并在其中复制[3-5]. HCV感染PBMC的机制有两种可能性：①HCV基因组的突变可能使病毒对PBMC的感染. HCV基因序列各个位置的突变率高达(1.44～1.92)×10-3，这可导致在持续感染的个体中增加突变株的感染；②HCV抗体为非中和性抗体，病毒和抗体复合物可以通过Fc受体进入某些PBMC中，抗体的这种介导作用为HCV感染PBMC提供了一条特异的途径[6]. HCV感染者存在细胞免疫紊乱, HCV感染PBMC后，由于HCV对PBMC直接或间接的破坏作用，可能导致PBMC功能失常或细胞破坏，引起机体免疫功能紊乱[7,8]，导致CD4+细胞对HCV的易感性比CD8+细胞强，使CD4+细胞和CD8+细胞不能很好地协调作用，从而减低了机体的抗病毒能力;另外，由于HCV对PBMC功能的影响，可能导致PBMC表面的HLA-Ⅰa相对不足，不能引起足够的免疫反应来清除病毒[2,6,9]. 本研究结果显示，HCV感染者PBMC中HCV RNA阳性率(74%)显著高于血清HCV RNA阳性率(29%)，说明血清HCV RNA阴性并不意味着HCV的清除，而可能是原本血清浓度很低的HCV暂时消失. 单独检测血清HCV RNA作为诊断和疗效的判断指标有一定局限性[10]. PBMC中的HCV难以被清除，成为肝脏再感染病毒的来源，可能是HCV持续感染的重要原因之一[11-14]. 因此，我们认为PBMC中的HCV可能是HCV感染慢性化的重要原因之一. 通过对HCV感染者同时进行血清及PBMC中HCV RNA检测，可为丙型肝炎的诊断、治疗及预后的判断提供较为可靠的指标，对丙型肝炎慢性化机制的研究具有重要
, http://www.100md.com
意义.
4 参考文献
1 赵西平, 沈汉馨, 田德英, 张东绅, 彭志海, 杨东亮, 郝连杰. 丙型肝炎肝组织中HCV RNA和HCV NS5抗原表达及意义.
世界华人消化杂志, 1999;7:516-518
2 Sansonno D, Iacobelli AR, Cornacchiulo V, Iodice G, Dammacco F. Detection of hepatitis C virus (HCV) proteins by
immunofluorescence and HCV RNA genomic sequences by non-isotopic in situ hybridization in bone marrow and
, 百拇医药
peripheral blood mononuclear cells of chronically HCV-infected patients. Clin Exp Immunol, 1996;103:414-421
3 Zignego AL, Macchia D, Monti M. Infection of peripheral mononuclear blood cells by hepatitis C Virus. J Hepatol,1992;15:382-386
4 Cribier B, Schmitt C, Bingen A, Kirn A, Keller F. In vitro infection of peripheral blood mononuclear cells by hepatitis C virus.
J Gen Virol, 1995;76:2485-2491
, 百拇医药
5 吴海滨, 李智伟, 李颖. 外周血单核细胞中丙型肝炎病毒RNA正负链检测的临床意义. 世界华人消化杂志, 1999;7:220-221
6 高勇, 贺永文. HCV感染外周血单个核细胞和丙型肝炎的关系研究. 《国外医学》流行病学传染病学分册， 1997；24：208-211
7 范学工, 唐发清, 欧志明, 章锦香, 刘国成, 胡国龄. 慢性丙型肝炎病毒感染者外周血淋巴细胞增殖反应. 世界华人消化杂志,1999;7:1038-1040
8 刘文恩, 谭德明, 范学工, 欧阳颗, 张铮. 丙型病毒性肝炎发病机制中自身免疫反应的作用. 世界华人消化杂志, 1999;7:120-121
9 Fan XG, Liu WE, Li CZ, Wang ZC, Luo LX, Tan DM, Hu GL, Zhang Z. Circulating Th1 and Th2 cytokines in patients with hepatitis
, 百拇医药
C virus infection. Med Inflammat, 1998;7:295-297
10 梁雪松, 张树林, 狄鹏超, 蔺淑梅. 慢性HCV感染者IFN治疗前后血清HCV RNA水平. 新消化病学杂志, 1997;5:311-312
11 李威，乔光彦，门永继，孟祥东，林凤双，金玉珠. 丙型肝炎患者外周血CD4+、CD8+、NK细胞分析. 中华微生物学和免疫学杂志,1992；12：363
12 Saleh MG, Tibbs CJ, Koskinas J, Pereira LMMB, Bomford AB, Portmann BC, McFarlane IG, Williams R. Hepatic and extrahepatic
, 百拇医药
hepatitis C virus replication in relation to response to interferon therapy. Hepatology, 1994;20:1399-1404
13 贺永文，刘薇，曾令兰，熊开均，罗端德. 干扰素联合病毒唑对肝炎患者正、负链丙型肝炎病毒RNA的影响. 中华内科杂志,1996；35：32-35
14 Wang JT，Sheu JC，Lin JT，Wang TH, Chen DS. Detection of replicative form of hepatitis C Virus RNA in peripheral
blood mononuclear cells. J Infect Dis, 1992;166:1167-1169, http://www.100md.com(刘文恩1 谭德明2 范学工2 张 铮2 欧阳颗2 )