血清透明质酸HA定量检测的新方法
云南大学单克隆抗体工程技术中心 云南省昆明市 650091
项目负责人 马岚 云南大学单克隆抗体工程技术中心 云南省昆明市 650091
云南省应用基础研究基金项目“血清透明质酸(HA)定量检测新技术的建立”资助，No.96C010M
Tel. 0086-871-5033160, Fax. 0086-871-5033626
Email. lisheng@public.km.yn.cnhttp://www.wd.org.cn
收稿日期 2000-05-12 接受日期 2000-05-16
, http://www.100md.com
主题词 透明质酸/血液；血清学；抗体，单克隆；肝硬化；酶联免疫吸附测定；大鼠
马岚, 赵力生, 李春华, 邓双胜, 王泽华, 袁航. 血清透明质酸HA定量检测的新方法. 世界华人消化杂志，2001；9(2)：226-227
血清HA值是反映肝纤维化的重要指标，定量测定血清HA对了解肝纤维化程度，转归均有重要价值. 目前检测HA多采用以HA结合蛋白即HABP为主要试剂的放免药盒进行测定. 但由于HABP的提取、纯化和标记等过程均很复杂，稳定性也差，使得试剂盒的稳定性差，价格也偏高. 我们利用已有的抗HA单抗和多抗建立了一种新的HA定量检测双抗体夹心法，避免了上述方法的不足，其结果如下.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 Balb/c纯系小鼠，购自中国医学科学院昆明医学生物研究所；家兔，购自云南大学动物饲养场；透明质酸(Hyaluronic acid, HA),HAT, HT, OPD, Poly-1-lysine等均购自Sigma公司；细胞培养基RPMI1640及胎牛血清等购自Gibco公司；酶标二抗羊抗兔IgG-HRP，羊抗鼠IgG-HRP等，购自Bio-Rad公司.
1.2 方法 以HA纯品按常规方法皮下免疫家兔后，静脉取血，收集抗HA多抗血清. 用蛋白A亲和柱纯化抗体，并用ELISA法确定HA多抗的效价和亲和力. 采用常规单抗杂交瘤技术免疫动物、融合细胞、筛选阳性细胞株，并进一步单克隆化，最终获取阳性HA单克隆抗体细胞株. 采用腹水法制取HA单克隆抗体，蛋白A亲和柱纯化抗体，并用ELISA法确定抗体的效价和亲和力. ELISA间接法测定HA的最适包被浓度：分别以不同浓度的HA包被不同处理的酶标板，选用同一浓度的抗HA多抗来进行测定. HA定量检测新方法-双抗体夹心法的建立：以HA单抗包被酶标板，封闭洗涤后加入HA纯品及待测样品，放置洗涤后加入HA多抗，放置洗涤后再依次加入酶标二抗羊抗兔IgG-HRP和底物OPD显色读数. HA标准曲线的建立：选用不同浓度的HA纯品，以HA多抗体夹心法测定相应的A492nm值并制作HA标准曲线. 以由四氯化碳CCl4诱发的SD大鼠肝纤维化模型为实验材料，获取不同期的血清，并用已建立的HA双抗体夹心法进行血清HA的定量测定.
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2 结果
经心脏采血和纯化后，获得80mL抗HA多抗血清，其抗体的含量为14.35g·L-1，亲和常数为1×10-7·mol-1，效价达1×10-7. 共做了三批细胞融合，三批的融合率分别为：18.5%(71/384)， 22.1%(85/384)，60.2%(231/384)，总融合率为33.6%(387/1152). 各批的阳性率分别为：21.1%(15/71), 23.5%(20/85)， 12.1%(28/231)，总阳性率为16.3%(63/387). 从这些阳性杂交瘤细胞株中共选出了6株阳性较高的，克隆了其中两株，2C3F2，2C3B8. 并制备了2C3F2的腹水. 经纯化后，其含量、效价和亲和常数分别为：7.88%，1×10-5和1.97×10-6·mol-1. 以HA(于0.05mol·L-1 Na2CO3-NaHCO3， pH 9.6包被液)直接包板，以1∶1000的抗HA多抗来测定时，其饱和曲线见图1. 以聚赖氨酸Poly-1-lysine处理酶标板后再包被HA时的饱和曲线见图2. 由图1知用HA直接包板时，所需HA浓度至少在50mg·L-1以上；而先用Poly-1-lysine处理后再包被HA，并在选用PBS pH 7.4而非0.05mol·L-1 Na2CO3-NaHCO3， pH 9.6包被液时，只需选用50mg·L-1的HA就足以饱和酶标板，且其A492nm值远比直接包被HA高得多. 因此可选用50mg·L-1的HA包被经Poly-1-lysine预处理的酶标板来检测所制取的抗HA多抗和单抗的活性.
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2.1 HA定量检测新方法-双抗体夹心法的建立 分别选用浓度在10-2和10-3的HA单抗，以及浓度在10-2和10-3的HA多抗进行组合，经多次试验，得到如图3所示的结果：曲线d的A值测得最高，且在HA浓度低于6.25mg·L-1时，曲线呈稳定的上升趋势，鉴于一般血清HA的含量都在这个浓度之下，故在此范围内以10-3 HA单抗为包被浓度，并以加入10-3 HA多抗为最适浓度来组配建立HA定量检测夹心法是最佳的.
HA标准曲线的建立：该标准曲线的线性回归是很好的(图4). 用此方法可检出的HA量已达ng级水平，其灵敏度与以往检测的方法相比相同或相近.
图1 ELISA间接法测定酶标板对HA的吸附能力.
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图2 酶标板经聚赖氨酸Poly-1-lysine (50mg·L-1，100μL/well)吸收预处理后，纯品HA的最适包被浓度及条件的测定.HA包被液A：PBS pH 7.4； B：0.05mol·L-1 Na2CO3-NaHCO3, pH 9.6
图3 不同HA单抗和多抗浓度组配后的饱和曲线.a: 以10-2 HA单抗包被板，以10-3 HA多抗进行测定；b: 以10-3 HA单抗包被板，以10-2 HA多抗进行测定；c: 以10-2 HA单抗包被板，以10-2 HA多抗进行测定；d: 以10-3 HA单抗包被板，以10-3 HA多抗进行测定；
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图4 双抗体夹心法测定HA的标准曲线.
2.2 血清HA的定量测定 取体重100g～200g雄性SD大鼠30只，随机分成5组：正常组(6只)，实验组即CCl4组(每组6只)按取材时间(wk3, wk6, wk9及wk12)共分为4组. 采用CCl4制备肝纤维化模型，即用500mL·L-1 CCl4橄榄油溶液1mL·kg-1 sc, 2次/wk，共12wk. 正常组则用50%生理盐水橄榄油溶液0.1mL/100g体重皮下注射. 各组动物在最后一次注射后48h处死，心脏取血分离血清，-20℃保存. 血清HA的测定以HA双抗体夹心法进行测定，并以上述已制成的HA标准曲线为标准进行相应浓度的换算. 各组大鼠血清HA检测结果见表1.
, 百拇医药
表1 各组大鼠血清HA检测结果(n=6, x±s)
, 百拇医药
bP<0.01 vs 对照组.
3 讨论
目前血清HA的检测多采用以透明质酸结合蛋白HABP为主要检测试剂的放免测定法[1,2]，由于HABP的活性区域极易受损，故标记时需先用HA保护，因而操作繁琐，耗时长，回收率低，且125I-HABP有效期不足45d，药盒成本高，因此该方法的建立所需工作量大，技术要求高. 针对Tengblad方法的不足，Delpech et al[3,4]首创HA的ELISA检测方法，即以HABP、标准HA和酶联抗HABP抗体为主要检测试剂的间接法酶联免疫测定法，以及以HABP、抗HABP单抗和酶联抗HABP多抗为主要检测试剂的抑制法酶联免疫测定法[5-8]，达到ng水平. 目前血清HA的定量检测已广泛用于肝纤维化、风湿性关节炎等疾病的临床检测[9-16]. 我们利用只针对HA的高特异敏感性抗HA单抗和多抗，建成了可用于定量检测HA的双抗体酶联免疫检测方法，其可检出的HA量从检测HA纯品及大鼠肝纤维化血清的检测结果来看已可达到ng级水平. 鉴于HA抗体的高特异敏感性和制取的方便性，以及据此构建双抗体酶联免疫检测方法的可行性，我们所建立的这一HA定量检测新方法从技术要求和操作程序上来看，比起现有的HA放免或酶免试剂盒是较为简便、经济、快速和灵敏准确的. 若经进一步完善并加以确证其用于临床如肝纤维化等疾病的检测的灵敏性和准确性，是有可能发展成为一种用于检测血清HA含量变化的新方法的.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Tengblad A. Affinity chromatography on immobilized hyaluronate and its application to the isolation of hyaluronate binding
properties from cartilage. Biochim Biophys Acta, 1979;578:281-289
2 Tengblad A. Quantitative analysis of hyaluronate in nanogram amounts. Biochem J, 1980;185:101-105
, 百拇医药 3 Delpech B, Bertrand P, Maingonnat C. Immunoenzymoassay of the hyaluronic acid-hyaluronectin interaction: application to
the detection of hyaluronic acid in serum of normal subjects and cancer patients. Anal Biochem, 1985;149:555-565
4 Delpech B, Bertrand P, Maingonnat C, Girard N, Chauzy C. Enzyme-linked hyaluronectin: a unique reagent for hyaluronan assay
and tissue location and for hyaluronidase activity detection. Anal Biochem, 1995;229:35-41
, http://www.100md.com
5 Kongtawelert P, Ghosh P. An enzyme-linked immunosorbent-inhibition assay for quantitation of hyaluronan (hyaluronic acid)
in biological fluids. Anal Biochem, 1989;178:367-372
6 Kongtawelert P, Ghosh P. A method for the quantitation of hyaluronan (hyaluronic acid) in biological fluids using a
labeled avidin-biotin technique. Anal Biochem, 1990;185:313-318
, 百拇医药
7 Keiser HD. A solid-phase immunoassay for the binding of cartilage proteoglycan to hyaluronic acid. Anal Biochem,
1987;160:462-467
8 Goldberg RL. Enzyme-linked immunosorbent assay for hyaluronate using cartilage proteoglycan and an antibody to keratan
sulfate. Anal Biochem, 1988;174:448-458
9 王炯, 李定国, 陆汉明, 孙志广, 蒋祖民, 徐芹芳, 顾鹤定, 陈颖伟. 脂蛋白、钙拮抗剂对大鼠贮脂细胞的影响. 世界华人消化杂志,1999;7:57-59
, 百拇医药
10 孙丹莉, 孙士其, 李庭赞, 陆雪龙. 肝硬变时细胞外基质代谢的血清学研究. 世界华人消化杂志, 1999;7:55-56
11 阳学风, 蔡卫民, 翁红雷, 刘荣华, 张明亮,曾斌. 国产PⅢP试剂盒临床应用. 世界华人消化杂志, 1999;7:181-182
12 阳学风, 曾明新, 张明亮, 刘金法. 马洛替酯抑制肝纤维化的实验与临床研究. 世界华人消化杂志, 1999;7:224-226
13 王万铁, 林丽娜, 徐正介, 王卫, 李东. 内皮细胞功能变化在肝缺血再灌注中的意义及川芎嗪干预. 世界华人消化杂志, 1999;7:548
14 刘芳, 刘金星, 曹治宸, 李兵顺, 赵彩彦, 孔丽, 甄真. 慢性肝病患者血清TGF-β1与肝纤维化指标和肝组织病理的关系.
世界华人消化杂志, 1999;7:519-521
15 高锋，孔宪涛，王笑利，谢映华. 肝病患者血清透明质酸的ELISA检测及临床意义. 上海免疫学杂志，1994；14：159-160
16 高锋，孔宪涛，王笑利，谢映华，刘焱，范列英. 细胞外间质成分与肝病关系的研究. 中华内科杂志，1994；33：109-112, 百拇医药(马 岚 赵力生 李春华 邓双胜 王泽华 袁 航)
项目负责人 马岚 云南大学单克隆抗体工程技术中心 云南省昆明市 650091
云南省应用基础研究基金项目“血清透明质酸(HA)定量检测新技术的建立”资助，No.96C010M
Tel. 0086-871-5033160, Fax. 0086-871-5033626
Email. lisheng@public.km.yn.cnhttp://www.wd.org.cn
收稿日期 2000-05-12 接受日期 2000-05-16
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主题词 透明质酸/血液；血清学；抗体，单克隆；肝硬化；酶联免疫吸附测定；大鼠
马岚, 赵力生, 李春华, 邓双胜, 王泽华, 袁航. 血清透明质酸HA定量检测的新方法. 世界华人消化杂志，2001；9(2)：226-227
血清HA值是反映肝纤维化的重要指标，定量测定血清HA对了解肝纤维化程度，转归均有重要价值. 目前检测HA多采用以HA结合蛋白即HABP为主要试剂的放免药盒进行测定. 但由于HABP的提取、纯化和标记等过程均很复杂，稳定性也差，使得试剂盒的稳定性差，价格也偏高. 我们利用已有的抗HA单抗和多抗建立了一种新的HA定量检测双抗体夹心法，避免了上述方法的不足，其结果如下.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 Balb/c纯系小鼠，购自中国医学科学院昆明医学生物研究所；家兔，购自云南大学动物饲养场；透明质酸(Hyaluronic acid, HA),HAT, HT, OPD, Poly-1-lysine等均购自Sigma公司；细胞培养基RPMI1640及胎牛血清等购自Gibco公司；酶标二抗羊抗兔IgG-HRP，羊抗鼠IgG-HRP等，购自Bio-Rad公司.
1.2 方法 以HA纯品按常规方法皮下免疫家兔后，静脉取血，收集抗HA多抗血清. 用蛋白A亲和柱纯化抗体，并用ELISA法确定HA多抗的效价和亲和力. 采用常规单抗杂交瘤技术免疫动物、融合细胞、筛选阳性细胞株，并进一步单克隆化，最终获取阳性HA单克隆抗体细胞株. 采用腹水法制取HA单克隆抗体，蛋白A亲和柱纯化抗体，并用ELISA法确定抗体的效价和亲和力. ELISA间接法测定HA的最适包被浓度：分别以不同浓度的HA包被不同处理的酶标板，选用同一浓度的抗HA多抗来进行测定. HA定量检测新方法-双抗体夹心法的建立：以HA单抗包被酶标板，封闭洗涤后加入HA纯品及待测样品，放置洗涤后加入HA多抗，放置洗涤后再依次加入酶标二抗羊抗兔IgG-HRP和底物OPD显色读数. HA标准曲线的建立：选用不同浓度的HA纯品，以HA多抗体夹心法测定相应的A492nm值并制作HA标准曲线. 以由四氯化碳CCl4诱发的SD大鼠肝纤维化模型为实验材料，获取不同期的血清，并用已建立的HA双抗体夹心法进行血清HA的定量测定.
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2 结果
经心脏采血和纯化后，获得80mL抗HA多抗血清，其抗体的含量为14.35g·L-1，亲和常数为1×10-7·mol-1，效价达1×10-7. 共做了三批细胞融合，三批的融合率分别为：18.5%(71/384)， 22.1%(85/384)，60.2%(231/384)，总融合率为33.6%(387/1152). 各批的阳性率分别为：21.1%(15/71), 23.5%(20/85)， 12.1%(28/231)，总阳性率为16.3%(63/387). 从这些阳性杂交瘤细胞株中共选出了6株阳性较高的，克隆了其中两株，2C3F2，2C3B8. 并制备了2C3F2的腹水. 经纯化后，其含量、效价和亲和常数分别为：7.88%，1×10-5和1.97×10-6·mol-1. 以HA(于0.05mol·L-1 Na2CO3-NaHCO3， pH 9.6包被液)直接包板，以1∶1000的抗HA多抗来测定时，其饱和曲线见图1. 以聚赖氨酸Poly-1-lysine处理酶标板后再包被HA时的饱和曲线见图2. 由图1知用HA直接包板时，所需HA浓度至少在50mg·L-1以上；而先用Poly-1-lysine处理后再包被HA，并在选用PBS pH 7.4而非0.05mol·L-1 Na2CO3-NaHCO3， pH 9.6包被液时，只需选用50mg·L-1的HA就足以饱和酶标板，且其A492nm值远比直接包被HA高得多. 因此可选用50mg·L-1的HA包被经Poly-1-lysine预处理的酶标板来检测所制取的抗HA多抗和单抗的活性.
, 百拇医药
2.1 HA定量检测新方法-双抗体夹心法的建立 分别选用浓度在10-2和10-3的HA单抗，以及浓度在10-2和10-3的HA多抗进行组合，经多次试验，得到如图3所示的结果：曲线d的A值测得最高，且在HA浓度低于6.25mg·L-1时，曲线呈稳定的上升趋势，鉴于一般血清HA的含量都在这个浓度之下，故在此范围内以10-3 HA单抗为包被浓度，并以加入10-3 HA多抗为最适浓度来组配建立HA定量检测夹心法是最佳的.
HA标准曲线的建立：该标准曲线的线性回归是很好的(图4). 用此方法可检出的HA量已达ng级水平，其灵敏度与以往检测的方法相比相同或相近.
图1 ELISA间接法测定酶标板对HA的吸附能力.
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图2 酶标板经聚赖氨酸Poly-1-lysine (50mg·L-1，100μL/well)吸收预处理后，纯品HA的最适包被浓度及条件的测定.HA包被液A：PBS pH 7.4； B：0.05mol·L-1 Na2CO3-NaHCO3, pH 9.6
图3 不同HA单抗和多抗浓度组配后的饱和曲线.a: 以10-2 HA单抗包被板，以10-3 HA多抗进行测定；b: 以10-3 HA单抗包被板，以10-2 HA多抗进行测定；c: 以10-2 HA单抗包被板，以10-2 HA多抗进行测定；d: 以10-3 HA单抗包被板，以10-3 HA多抗进行测定；
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图4 双抗体夹心法测定HA的标准曲线.
2.2 血清HA的定量测定 取体重100g～200g雄性SD大鼠30只，随机分成5组：正常组(6只)，实验组即CCl4组(每组6只)按取材时间(wk3, wk6, wk9及wk12)共分为4组. 采用CCl4制备肝纤维化模型，即用500mL·L-1 CCl4橄榄油溶液1mL·kg-1 sc, 2次/wk，共12wk. 正常组则用50%生理盐水橄榄油溶液0.1mL/100g体重皮下注射. 各组动物在最后一次注射后48h处死，心脏取血分离血清，-20℃保存. 血清HA的测定以HA双抗体夹心法进行测定，并以上述已制成的HA标准曲线为标准进行相应浓度的换算. 各组大鼠血清HA检测结果见表1.
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表1 各组大鼠血清HA检测结果(n=6, x±s)
| 组别 | P(HA)/(μg·L-1) | 实验组与对照组的差别 | 相邻组之间的差别 |
| 对照组 | 0.21±0.026 | 1 | 1.0 |
| 3wk | 7.98±3.420b | 38 | 38.0(2-1) |
| 6wk | 20.10±4.816b | 96 | 2.5(3-2) |
| 9wk | 229.73±17.455b | 1094 | 11.4(4-3) |
| 12wk | 324.74±29.806b | 1546 | 1.4(5-4) |
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bP<0.01 vs 对照组.
3 讨论
目前血清HA的检测多采用以透明质酸结合蛋白HABP为主要检测试剂的放免测定法[1,2]，由于HABP的活性区域极易受损，故标记时需先用HA保护，因而操作繁琐，耗时长，回收率低，且125I-HABP有效期不足45d，药盒成本高，因此该方法的建立所需工作量大，技术要求高. 针对Tengblad方法的不足，Delpech et al[3,4]首创HA的ELISA检测方法，即以HABP、标准HA和酶联抗HABP抗体为主要检测试剂的间接法酶联免疫测定法，以及以HABP、抗HABP单抗和酶联抗HABP多抗为主要检测试剂的抑制法酶联免疫测定法[5-8]，达到ng水平. 目前血清HA的定量检测已广泛用于肝纤维化、风湿性关节炎等疾病的临床检测[9-16]. 我们利用只针对HA的高特异敏感性抗HA单抗和多抗，建成了可用于定量检测HA的双抗体酶联免疫检测方法，其可检出的HA量从检测HA纯品及大鼠肝纤维化血清的检测结果来看已可达到ng级水平. 鉴于HA抗体的高特异敏感性和制取的方便性，以及据此构建双抗体酶联免疫检测方法的可行性，我们所建立的这一HA定量检测新方法从技术要求和操作程序上来看，比起现有的HA放免或酶免试剂盒是较为简便、经济、快速和灵敏准确的. 若经进一步完善并加以确证其用于临床如肝纤维化等疾病的检测的灵敏性和准确性，是有可能发展成为一种用于检测血清HA含量变化的新方法的.
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4 参考文献
1 Tengblad A. Affinity chromatography on immobilized hyaluronate and its application to the isolation of hyaluronate binding
properties from cartilage. Biochim Biophys Acta, 1979;578:281-289
2 Tengblad A. Quantitative analysis of hyaluronate in nanogram amounts. Biochem J, 1980;185:101-105
, 百拇医药 3 Delpech B, Bertrand P, Maingonnat C. Immunoenzymoassay of the hyaluronic acid-hyaluronectin interaction: application to
the detection of hyaluronic acid in serum of normal subjects and cancer patients. Anal Biochem, 1985;149:555-565
4 Delpech B, Bertrand P, Maingonnat C, Girard N, Chauzy C. Enzyme-linked hyaluronectin: a unique reagent for hyaluronan assay
and tissue location and for hyaluronidase activity detection. Anal Biochem, 1995;229:35-41
, http://www.100md.com
5 Kongtawelert P, Ghosh P. An enzyme-linked immunosorbent-inhibition assay for quantitation of hyaluronan (hyaluronic acid)
in biological fluids. Anal Biochem, 1989;178:367-372
6 Kongtawelert P, Ghosh P. A method for the quantitation of hyaluronan (hyaluronic acid) in biological fluids using a
labeled avidin-biotin technique. Anal Biochem, 1990;185:313-318
, 百拇医药
7 Keiser HD. A solid-phase immunoassay for the binding of cartilage proteoglycan to hyaluronic acid. Anal Biochem,
1987;160:462-467
8 Goldberg RL. Enzyme-linked immunosorbent assay for hyaluronate using cartilage proteoglycan and an antibody to keratan
sulfate. Anal Biochem, 1988;174:448-458
9 王炯, 李定国, 陆汉明, 孙志广, 蒋祖民, 徐芹芳, 顾鹤定, 陈颖伟. 脂蛋白、钙拮抗剂对大鼠贮脂细胞的影响. 世界华人消化杂志,1999;7:57-59
, 百拇医药
10 孙丹莉, 孙士其, 李庭赞, 陆雪龙. 肝硬变时细胞外基质代谢的血清学研究. 世界华人消化杂志, 1999;7:55-56
11 阳学风, 蔡卫民, 翁红雷, 刘荣华, 张明亮,曾斌. 国产PⅢP试剂盒临床应用. 世界华人消化杂志, 1999;7:181-182
12 阳学风, 曾明新, 张明亮, 刘金法. 马洛替酯抑制肝纤维化的实验与临床研究. 世界华人消化杂志, 1999;7:224-226
13 王万铁, 林丽娜, 徐正介, 王卫, 李东. 内皮细胞功能变化在肝缺血再灌注中的意义及川芎嗪干预. 世界华人消化杂志, 1999;7:548
14 刘芳, 刘金星, 曹治宸, 李兵顺, 赵彩彦, 孔丽, 甄真. 慢性肝病患者血清TGF-β1与肝纤维化指标和肝组织病理的关系.
世界华人消化杂志, 1999;7:519-521
15 高锋，孔宪涛，王笑利，谢映华. 肝病患者血清透明质酸的ELISA检测及临床意义. 上海免疫学杂志，1994；14：159-160
16 高锋，孔宪涛，王笑利，谢映华，刘焱，范列英. 细胞外间质成分与肝病关系的研究. 中华内科杂志，1994；33：109-112, 百拇医药(马 岚 赵力生 李春华 邓双胜 王泽华 袁 航)