IS606在中国人群感染幽门螺杆菌中的分布意义
中国人民解放军第二军医大学长海医院消化内科 上海市 200433
本课题受国家自然科学基金(No.39670648)及欧共体委员会科学基金 (No.IC18CT9 5-0024)资助.
项目负责人 江华，200433，上海市长海路174号长海医院消化内科. jhghjl@163.com
Telephone: 021-25070556
收稿日期 2001-08-09 接受日期 2001-09-04
摘 要目的 探讨转座子插入元件IS606在中国人群感染幽门螺杆菌(Hp )中的分布特征及其与Hp致病的相关性.
, 百拇医药
方法 采用PCR方法，将82例临床分离培养的Hp菌株，分成IS605阳 性(32株)和IS605阴性(50株)两组，扩增IS606中的1000bp片段，同时设立阳性对照及阴 性对照.
结果 IS606在中国人群感染Hp的82例中全部为阴性.
结论 作为转座子插入元件的IS606在中国人慢性胃炎、消化性溃疡及 胃癌等不同疾病来源的Hp中均不存在.提示中国人群感染的Hp几乎无IS606插入，IS 606与中国人群感染Hp的致病性似乎关系不大，且不存在IS605与IS606的双插入.
主题词 螺杆菌感染/流行病学；螺杆菌，幽门/遗传学；DNA可 移植因子；基因扩增
, 百拇医药
江华，李兆申，屠振兴，龚燕芳，许国铭.IS606在中国人群感染幽门螺杆菌中的 分布意义.世界华人消化杂志，2001；9(11)：1312-1313
0 引言幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)感染已被确认是慢性活动性胃炎和消 化性溃疡的重要病因，与胃癌和胃MALT淋巴瘤的发病也有密切关系.世界卫生组织(WHO)已 把H.pylori列为与胃癌有关的病原菌(grade I carcinogen).H.pylori的致病机 制是目前的研究热点[1-5].IS606与IS605均是H.pylori基因的插入序列，其 功能是参与cag致病岛基因群的分割与重排，而且与H.pylori的毒力改变及进化有关 [6].已有研究报道，IS605在慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌的中国人群感染H.pylor i中均存在不同程度的分布，且与H.pylori的毒力梯度降低有关[7].我们探 讨IS606在上述中国人群感染H.pylori中的分布特征及致病性.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 胃镜下取患者胃窦粘膜活检组织，涂布于含100mL.L -1脱纤维羊血及Skirrow’s抗生素添加剂的弯曲菌选择培养基上培养，培养条件为 37℃,微需氧(体积分数：5%O2，10%CO2，85%N2)、72h，获取菌株后，经尿素酶、 过氧化氢酶活性检测及组织染色证实.经上述方法临床分离的82株H.pylori菌株均取自 第二军医大学长海医院消化内科内镜中心，包括慢性胃炎50株，胃溃疡7株，十二指肠球部 溃疡17株，复合性溃疡3株，胃癌5株.H.pylori基因组DNA在PCR扩增IS605的研究中分为 IS605阳性32株，阴性50株.阳性对照即含有IS606片段的H.pylori DNA(来自菌株26695 )由美国华盛顿大学医学院分子微生物实验室，Douglas E.Berg教授惠赠.
, http://www.100md.com
1.2 方法 1.2.1 模板DNA的分离 采用CTAB法抽提H.pylori 基因组DNA.从固体培养基上收取H.pylori菌落重悬于TE缓冲液1ml中，加100g.L-1 SDS60μL，蛋白酶K(20 g.L-1)6μL，55℃水浴10h，加NaCl(5mol.L-1 )200μL、100g.L-1CTAB/lNaCl160μL混匀，置65℃水浴15min，然后等体积氯仿 /异戊醇(体积比：24∶1)、酚/氯仿/异戊醇(体积比：25∶24∶1)、氯仿/异戊 醇(体积比：24∶1)抽提，0.6倍体积的异丙醇沉淀，700 mL.L-1乙醇洗涤，抽提 出的DNA重溶于50μL去离子双蒸水中.
1.2.2 聚合酶链反应(PCR) 针对IS606中保守序列的 PCR引物参照文献[3]，由上海生工生物工程公司合成，扩增IS606中的1000bp片段 (引物序列、扩增片段的大小及在cag致病岛基因序列中的位置见表1)，依据PCR试剂盒(Q IAGEN)说明书进行操作，反应体系为：50μL总体积中，HotStarTaq Master Mix 25μL(2.5U HotStarTaqDNA聚合酶、含1.5mM MgCL2的1×PCR buffer、dNTP个各200μmol.L -1)引物A O.5μL(0.2 μmol.L-1)、引物B O.5μL (0.2μmol.L-1)、 模板DNA 2μL、无菌双蒸水22μL，反应在德国生产的eppendorf PCR仪中进行，反应条件为 ：95℃激活15min，经94℃，45s；61℃，45s；72℃，2min；30个循环，72℃延伸10min；同 时设立阴性对照(模板为无菌双蒸水)及阳性对照(PCR反应体系及条件同上).
, http://www.100md.com
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳PCR产物 (含阴性和阳性对照 )及临床分离株3295DNA在7g.L-1的琼脂糖凝胶(含0.5 mg.L-1溴化乙锭) 中电泳，紫外反射透射分析仪上观察结果并照相.
2 结果在凝胶图象上82株(IS605阳性32株，IS605阴性50株，图1)H.pylori DNA的PC R产物均无条带出现；阳性对照的PCR产物可显示清晰的条带，其位置对应于Mark的1000bp处 ；H.pylori基因组DNA显示出长片状条带；阴性对照的PCR产物无条带显示.提示中国人 群感染H.pylori基因组DNA中并无IS606插入，亦无IS605和IS606的双插入.IS606元件的 结构(包含ORFA，ORFB的位置和方向以及PCR引物的结合位点，图2).
表1 所用引物的序列、位置及扩增片段大小
, 百拇医药
图1 1，2，3：IS605阳性临床分离株DNA的IS606 PCR扩增产物
5，7，9：IS605阴性临床分离株DNA的IS606 PCR扩增产物
10：PCR阴性对照
4：阳性对照菌株26695DNA IS606PCR扩增产物(1000bp)
6： DNA分子参照物(bp)：3000 2000 1500 1200 1031 900 800
8：临床分离的3295菌株基因组DNA
图2 IS606元件的结构，包括ORFA、ORFB的位置、方向以及PC R引物的结合位点.
, 百拇医药
3 讨论作为H.pylori中新发现的插入序列，I S606是IS605家族的一个有分歧的成员，与IS605相似，IS606也十分古老，含有IS200和IS13 41同源基因，由tnpA和tnpB两个编码产物为转座酶的基因组成，所编码的转座酶蛋白为其移 动所必需，也可能在转录过程中作为异源二聚体共同起作用[8].其两端的序列均各 不相同，没有颠倒重复序列，表明两个不同的tnp在转录过程中的特异性，分别在其相关的 末端进行，但IS606的插入位点通常是5ˊ-TTTAT，而IS605的插入位点则是5ˊ-TTTAA；其 两个开放阅读框编码的产物氨基酸仅有25%和28%与IS605相同，表明IS606与IS605并没有密 切的亲缘关系[8].IS605的功能被认为是在H.pylori进化的不同时期进入H.p ylori基因组中，参与一毒力相关因子基因群(cag致病岛)及H.pylori中其他基因的 分割、重排、缺失[8].Akopyants et al[9]提出，cag致病岛中DNA被 分割性重排对于减少cag致病岛的丢失及再获取有很重要的进化意义，因此与H.pylori 的进化及cag致病岛相关的H.pylori毒力改变有关.IS606的功能尚不清楚.Kersulyte et al[8]用PCR方法，检测了38株不相关的菌株，发现IS606的阳性率为34%(13/ 38)，其片段长度约1kb，且IS606的插入与cag及IS605的存在状态无关.在 26695菌株中，发现有两处IS606插入[8].Chalkauskas et al[10]应用PCR和杂交 方法检测立陶宛人群感染的H.pylori基因型，发现cag致病岛中IS606的阳性率为18.2( 2/11)，并认为IS606与H.pylori毒力无关. 本研究中检测了中国人群感染的82株(慢性胃炎50株、胃溃疡7株、十二指肠球部溃疡17株 、复合性溃疡3株、胃癌5株)H.pylori，其中50株为IS605阴性，另外32株已被检测证 明有IS605的插入.发现82株中IS606均为阴性，亦无IS605、IS606双插入.显示IS606在中国 人群感染的H.pylori中的分布与国外相比，有明显地域上的差异.亦表明IS606与中国人 群感染的H.pylori毒力无关.其原因有待进一步研究.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 仇军文，胡家露，吴开春，乔文，季万胜，施丙龙，彭道荣，樊代明. 多重聚合酶链反应鉴定幽门螺杆菌基因型.
世界华人消化杂志,2001;9:34-38
2 陆和平,郑银宝.肠化生、胃癌组织中幽门螺杆菌感染与ras基因表达. 世界华人消化杂志， 2001;9:218-219
3 She FF, Su DH, Lin JY, Zhou LY. Virulence and potential pathogenicity of coccoid Helicobacter pylori induced by antibiotics.
World J Gastroenterol,2001;7:254-258
, 百拇医药
4 Manos J, Kolesnikow T and Hazell SL. An investigation of the molecular basis of the spontaneous occurrence of a catalase-negative
phenotype in Helicobacte r pylori. Helicobacter pylori, 1998; 3:28-38
5 Jenks PJ, Megraud F, Labigne A. Clinical outcome after infection with Helic obacter pylori does not appear to be reliably predicted by
the presence of any of the genes of the cag pathogenicity island. Gut,1998;43:752-758
, 百拇医药
6 Nikanne JH,Berg DE,Peek RM, Jr.Kersulyte D, Tummuru MKR and Blaser MJ. DNA sequence conservation and diversity in transposable
element IS605 of Helicobacter pylori. Helicobacter pylori, 1998;3:79-85
7 刘炯,许国铭,屠振兴,李兆申,龚燕芳. IS605在中国人感染幽门螺杆菌中的检出特征. 解 放军医学杂志,2001;26:67-68
8 Kersulyte D, Akopyants NS, Clifton SW, Roe BA, Berg DE. Novel sequence organi zation and insertion specificity of IS605 and IS606:
, 百拇医药
chimaeric transposable elem ent of Helicobacter pylori. Gene, 1998,223:175-186
9 Akopyants NS, Clifton SW, Kersulyte D, Crabtree JE, Youree BE,Reece CA,Bukano v NO, Drazek, ES, Roe BA and Berg DE. Analyses
of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Mol Microbiol,1998,28:37-53
10 Chalkauskas H,Kersulyte D,Cepuliene I,Urbonas V,Ruzeviciene D,Barakaus kiene A,Raudonikiene A and Berg DE.Genotypes of
Helicobacter pylori in Lithu anian Families.Helicobacter pylori,1998,3:296-302, http://www.100md.com(江 华 李兆申 屠振兴 龚燕芳 许国铭)
本课题受国家自然科学基金(No.39670648)及欧共体委员会科学基金 (No.IC18CT9 5-0024)资助.
项目负责人 江华，200433，上海市长海路174号长海医院消化内科. jhghjl@163.com
Telephone: 021-25070556
收稿日期 2001-08-09 接受日期 2001-09-04
摘 要目的 探讨转座子插入元件IS606在中国人群感染幽门螺杆菌(Hp )中的分布特征及其与Hp致病的相关性.
, 百拇医药
方法 采用PCR方法，将82例临床分离培养的Hp菌株，分成IS605阳 性(32株)和IS605阴性(50株)两组，扩增IS606中的1000bp片段，同时设立阳性对照及阴 性对照.
结果 IS606在中国人群感染Hp的82例中全部为阴性.
结论 作为转座子插入元件的IS606在中国人慢性胃炎、消化性溃疡及 胃癌等不同疾病来源的Hp中均不存在.提示中国人群感染的Hp几乎无IS606插入，IS 606与中国人群感染Hp的致病性似乎关系不大，且不存在IS605与IS606的双插入.
主题词 螺杆菌感染/流行病学；螺杆菌，幽门/遗传学；DNA可 移植因子；基因扩增
, 百拇医药
江华，李兆申，屠振兴，龚燕芳，许国铭.IS606在中国人群感染幽门螺杆菌中的 分布意义.世界华人消化杂志，2001；9(11)：1312-1313
0 引言幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)感染已被确认是慢性活动性胃炎和消 化性溃疡的重要病因，与胃癌和胃MALT淋巴瘤的发病也有密切关系.世界卫生组织(WHO)已 把H.pylori列为与胃癌有关的病原菌(grade I carcinogen).H.pylori的致病机 制是目前的研究热点[1-5].IS606与IS605均是H.pylori基因的插入序列，其 功能是参与cag致病岛基因群的分割与重排，而且与H.pylori的毒力改变及进化有关 [6].已有研究报道，IS605在慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌的中国人群感染H.pylor i中均存在不同程度的分布，且与H.pylori的毒力梯度降低有关[7].我们探 讨IS606在上述中国人群感染H.pylori中的分布特征及致病性.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 胃镜下取患者胃窦粘膜活检组织，涂布于含100mL.L -1脱纤维羊血及Skirrow’s抗生素添加剂的弯曲菌选择培养基上培养，培养条件为 37℃,微需氧(体积分数：5%O2，10%CO2，85%N2)、72h，获取菌株后，经尿素酶、 过氧化氢酶活性检测及组织染色证实.经上述方法临床分离的82株H.pylori菌株均取自 第二军医大学长海医院消化内科内镜中心，包括慢性胃炎50株，胃溃疡7株，十二指肠球部 溃疡17株，复合性溃疡3株，胃癌5株.H.pylori基因组DNA在PCR扩增IS605的研究中分为 IS605阳性32株，阴性50株.阳性对照即含有IS606片段的H.pylori DNA(来自菌株26695 )由美国华盛顿大学医学院分子微生物实验室，Douglas E.Berg教授惠赠.
, http://www.100md.com
1.2 方法 1.2.1 模板DNA的分离 采用CTAB法抽提H.pylori 基因组DNA.从固体培养基上收取H.pylori菌落重悬于TE缓冲液1ml中，加100g.L-1 SDS60μL，蛋白酶K(20 g.L-1)6μL，55℃水浴10h，加NaCl(5mol.L-1 )200μL、100g.L-1CTAB/lNaCl160μL混匀，置65℃水浴15min，然后等体积氯仿 /异戊醇(体积比：24∶1)、酚/氯仿/异戊醇(体积比：25∶24∶1)、氯仿/异戊 醇(体积比：24∶1)抽提，0.6倍体积的异丙醇沉淀，700 mL.L-1乙醇洗涤，抽提 出的DNA重溶于50μL去离子双蒸水中.
1.2.2 聚合酶链反应(PCR) 针对IS606中保守序列的 PCR引物参照文献[3]，由上海生工生物工程公司合成，扩增IS606中的1000bp片段 (引物序列、扩增片段的大小及在cag致病岛基因序列中的位置见表1)，依据PCR试剂盒(Q IAGEN)说明书进行操作，反应体系为：50μL总体积中，HotStarTaq Master Mix 25μL(2.5U HotStarTaqDNA聚合酶、含1.5mM MgCL2的1×PCR buffer、dNTP个各200μmol.L -1)引物A O.5μL(0.2 μmol.L-1)、引物B O.5μL (0.2μmol.L-1)、 模板DNA 2μL、无菌双蒸水22μL，反应在德国生产的eppendorf PCR仪中进行，反应条件为 ：95℃激活15min，经94℃，45s；61℃，45s；72℃，2min；30个循环，72℃延伸10min；同 时设立阴性对照(模板为无菌双蒸水)及阳性对照(PCR反应体系及条件同上).
, http://www.100md.com
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳PCR产物 (含阴性和阳性对照 )及临床分离株3295DNA在7g.L-1的琼脂糖凝胶(含0.5 mg.L-1溴化乙锭) 中电泳，紫外反射透射分析仪上观察结果并照相.
2 结果在凝胶图象上82株(IS605阳性32株，IS605阴性50株，图1)H.pylori DNA的PC R产物均无条带出现；阳性对照的PCR产物可显示清晰的条带，其位置对应于Mark的1000bp处 ；H.pylori基因组DNA显示出长片状条带；阴性对照的PCR产物无条带显示.提示中国人 群感染H.pylori基因组DNA中并无IS606插入，亦无IS605和IS606的双插入.IS606元件的 结构(包含ORFA，ORFB的位置和方向以及PCR引物的结合位点，图2).
表1 所用引物的序列、位置及扩增片段大小
| 基因 | 寡核苷酸位置 | 引物序列 | 扩增片段大小 |
| IS606 | ORFA 328F | 5’-GGAGGGTAGTTGATAAGCAAATC | 10 00bp |
| ORFB 1398R | 5’-GTTTAGACTTTAACACCCTACGG |
, 百拇医药
图1 1，2，3：IS605阳性临床分离株DNA的IS606 PCR扩增产物
5，7，9：IS605阴性临床分离株DNA的IS606 PCR扩增产物
10：PCR阴性对照
4：阳性对照菌株26695DNA IS606PCR扩增产物(1000bp)
6： DNA分子参照物(bp)：3000 2000 1500 1200 1031 900 800
8：临床分离的3295菌株基因组DNA
图2 IS606元件的结构，包括ORFA、ORFB的位置、方向以及PC R引物的结合位点.
, 百拇医药
3 讨论作为H.pylori中新发现的插入序列，I S606是IS605家族的一个有分歧的成员，与IS605相似，IS606也十分古老，含有IS200和IS13 41同源基因，由tnpA和tnpB两个编码产物为转座酶的基因组成，所编码的转座酶蛋白为其移 动所必需，也可能在转录过程中作为异源二聚体共同起作用[8].其两端的序列均各 不相同，没有颠倒重复序列，表明两个不同的tnp在转录过程中的特异性，分别在其相关的 末端进行，但IS606的插入位点通常是5ˊ-TTTAT，而IS605的插入位点则是5ˊ-TTTAA；其 两个开放阅读框编码的产物氨基酸仅有25%和28%与IS605相同，表明IS606与IS605并没有密 切的亲缘关系[8].IS605的功能被认为是在H.pylori进化的不同时期进入H.p ylori基因组中，参与一毒力相关因子基因群(cag致病岛)及H.pylori中其他基因的 分割、重排、缺失[8].Akopyants et al[9]提出，cag致病岛中DNA被 分割性重排对于减少cag致病岛的丢失及再获取有很重要的进化意义，因此与H.pylori 的进化及cag致病岛相关的H.pylori毒力改变有关.IS606的功能尚不清楚.Kersulyte et al[8]用PCR方法，检测了38株不相关的菌株，发现IS606的阳性率为34%(13/ 38)，其片段长度约1kb，且IS606的插入与cag及IS605的存在状态无关.在 26695菌株中，发现有两处IS606插入[8].Chalkauskas et al[10]应用PCR和杂交 方法检测立陶宛人群感染的H.pylori基因型，发现cag致病岛中IS606的阳性率为18.2( 2/11)，并认为IS606与H.pylori毒力无关. 本研究中检测了中国人群感染的82株(慢性胃炎50株、胃溃疡7株、十二指肠球部溃疡17株 、复合性溃疡3株、胃癌5株)H.pylori，其中50株为IS605阴性，另外32株已被检测证 明有IS605的插入.发现82株中IS606均为阴性，亦无IS605、IS606双插入.显示IS606在中国 人群感染的H.pylori中的分布与国外相比，有明显地域上的差异.亦表明IS606与中国人 群感染的H.pylori毒力无关.其原因有待进一步研究.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 仇军文，胡家露，吴开春，乔文，季万胜，施丙龙，彭道荣，樊代明. 多重聚合酶链反应鉴定幽门螺杆菌基因型.
世界华人消化杂志,2001;9:34-38
2 陆和平,郑银宝.肠化生、胃癌组织中幽门螺杆菌感染与ras基因表达. 世界华人消化杂志， 2001;9:218-219
3 She FF, Su DH, Lin JY, Zhou LY. Virulence and potential pathogenicity of coccoid Helicobacter pylori induced by antibiotics.
World J Gastroenterol,2001;7:254-258
, 百拇医药
4 Manos J, Kolesnikow T and Hazell SL. An investigation of the molecular basis of the spontaneous occurrence of a catalase-negative
phenotype in Helicobacte r pylori. Helicobacter pylori, 1998; 3:28-38
5 Jenks PJ, Megraud F, Labigne A. Clinical outcome after infection with Helic obacter pylori does not appear to be reliably predicted by
the presence of any of the genes of the cag pathogenicity island. Gut,1998;43:752-758
, 百拇医药
6 Nikanne JH,Berg DE,Peek RM, Jr.Kersulyte D, Tummuru MKR and Blaser MJ. DNA sequence conservation and diversity in transposable
element IS605 of Helicobacter pylori. Helicobacter pylori, 1998;3:79-85
7 刘炯,许国铭,屠振兴,李兆申,龚燕芳. IS605在中国人感染幽门螺杆菌中的检出特征. 解 放军医学杂志,2001;26:67-68
8 Kersulyte D, Akopyants NS, Clifton SW, Roe BA, Berg DE. Novel sequence organi zation and insertion specificity of IS605 and IS606:
, 百拇医药
chimaeric transposable elem ent of Helicobacter pylori. Gene, 1998,223:175-186
9 Akopyants NS, Clifton SW, Kersulyte D, Crabtree JE, Youree BE,Reece CA,Bukano v NO, Drazek, ES, Roe BA and Berg DE. Analyses
of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Mol Microbiol,1998,28:37-53
10 Chalkauskas H,Kersulyte D,Cepuliene I,Urbonas V,Ruzeviciene D,Barakaus kiene A,Raudonikiene A and Berg DE.Genotypes of
Helicobacter pylori in Lithu anian Families.Helicobacter pylori,1998,3:296-302, http://www.100md.com(江 华 李兆申 屠振兴 龚燕芳 许国铭)