胰腺癌组织中P16基因的缺失突变
尚瑞莲，赵晓晏，郭萍，中国人民解放军第三军医大学附属新桥医院消化内科 重庆市 400037
项目负责人 尚瑞莲，250031，重庆市，中国人民解放军第三军医大学附属新桥医院消化内科
收稿日期 2001-10-12 接受日期 2001-10-29
摘要
目的:探讨P16基因与胰腺癌发生、发展的关系.
方法:采用PCR基础缺失分析及PCR-SSCP方法检测P16基因在28例胰腺 癌组织及相应癌旁组织中的纯合缺失及突变状况，并结合临床病理资料进行分析.
, http://www.100md.com
结果:胰腺癌组织中28例有4例出现P16基因纯合缺失，5例发生P1 6基因突变，P16基因变异频率为32.1%，28例癌旁组织中无一例发现纯合缺失及突变. p16基因变异频率与淋巴结转移(P<0.05)、转移淋巴结个数(P<0.01)及临床分期( P<0.05)密切相关.
结论:P16基因变异在胰腺癌的发生中发挥重要作用，是胰腺癌的发展 密切相关，存在P16基因变异的原发性胰腺癌具有更强的恶性潜能，预后更差.
尚瑞莲，赵晓晏，郭萍. 胰腺癌组织中P16基因的缺失突变. 世界华人消化杂 志 2002;10(1):100-102
, 百拇医药
0 引言P16基因是近年发现的一种肿瘤抑制基因，其编码的P16蛋白能与细胞周期依赖性激 酶4(CDK4)高度特异性结合，从而使细胞周期蛋白cyclinD1与CDK4的结合受到竞争性抑制， 影响CDK4/CyclinD1复合物的激酶活性，阻止细胞从G1→S期的演进，而G1→S期是细 胞分化的关键转折点[1].P16基因与胰腺癌的相关深入研究还比较少. 我们采用28例原发性胰腺癌组织及相应癌旁组织进行对比研究，应用PCR基础缺失分析及PCR -SSCP方法检测P16基因缺失及突变状况，并结合临床资料进行综合分析，旨在探讨p 16基因与胰腺癌发生，发展的作用，为胰腺癌的诊断、预后判断及防治策略的开发提供实 验依据.
1 材料和方法
1.1 材料 28例原发性胰腺癌组织及癌旁组织(距肿瘤组织边缘2 cm以内)新鲜标本来源于重庆市八所医院1998-9～1999-12的手术切除组织.每份癌组织及 癌旁组织均于液氮中冻存48h后置于-70℃冰箱中保存，供缺失及突变分析用，正常胰腺组 织4例作为正常对照.28例癌组织中：胰腺导管上皮癌26例，腺泡癌2例；高分化12例，中分 化9例，低分化7例；11例伴有淋巴结转移，其中5例转移淋巴结个数>2个，6例转移淋巴结个 数1-2个，17例无淋巴结转移；5例有肝脏等远处器官转移.根据美国癌症联合委员会1992年 制定的胰腺癌临床分期标准，28例胰腺癌中17例属Ⅰ，Ⅱ期，11例属Ⅲ，Ⅳ期.患者年龄45 岁～69岁，平均年龄54.5岁，男女比例4∶1.
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1.2 方法 设计P16基因exon1及exon2引物[2 ]，(exon3仅11个碱基，未予检测).将exon2分为exon2a(上游片段)及exon2b(下游片段) 两个片段合成引物.引物序列如下：
exon1 (280bp) 上游链：TCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCA
exon1 (280bp) 下游链：GCGCTACCTGATTCCAATTC
exon2a(244bp)上游链：ACAAGCTTCCTTTCCGTCATGCCG
exon2a(244bp)下游链：CCAGGCATCGCGCACGTCCA
, 百拇医药
exon2b(242bp)上游链：TTCCTGGACACGCTGGTGGT
exon2b(242bp)下游链：TCTGAGCTTTGGAAGCTCTCAG
GAPDH内对照基因(474bp)上游链：AGTACGCTGCAGGGCCTCACTCCTT
GAPDH内对照基因(474bp)下游链：AAGAGCCAGTCTCTGGCCCCAGCCA
以上引物由香港Life Teconolgy公司合成. 组织DNA的提取：酚-氯仿法，测定DNA纯度及含 量，A260/A280≥1.7为DNA纯化成功.多聚酶链式反应及纯合缺失分析[2，3]p 16基因目的片段及GAPDH基因同时扩增.扩增总体系为50μL.其中包括1×Taq酶缓冲液， 4×dNTPs 0.2mmoL-1， P16基因片段引物上、下游链0.8mmoL-1，GAPDH基因引物上、下游链0.8mmoL-1，模板2100mgL-1 l00μl，Taq酶(Sagon公司 ) 0.5μL(2.5U)，DMSO2.5μL，dddH2O31μL.反应条件：94℃变性50s，62℃退火50s，72 ℃延伸50s，共35个循环.PCR在Gene cycler 10210(美国PE公司)中进行，用消毒dddH2O代 替模板DNA作为阴性对照，取上述PCR产物于18gL-1的琼脂糖凝胶中电泳，以出现内 对照基因产物同时无P16基因目的片段产物出现者为纯合缺失判断标准.PCR-SSCP(聚合 酶链反应-单链构象多态性分析)[4,5]：未检测出纯合缺失的癌组织及癌旁组织DN A进行聚合酶链反应，反应体系、Taq酶、10×Taq酶缓冲液、4×dNTPs、模板入量、P16 基因片段引物均同前，但不加内对照基因引物，exon2a、exon2b的扩增体系中加入DMSO 2.5 μL，exon1的扩增体系中加入去离子甲酰胺1.8μL. PCR产物95℃变性后在60gL-1非 变性聚丙烯酰胺(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺为49∶1)中电泳.以正常胰腺组织PCR产物作为 正常对照.电泳结束后，凝胶银染.与正常对照相比，出现泳动变位带者为突变阳性. 统计学处理 采用两样本及多个样本的χ2检验进行数据处 理.
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2 结果在28例癌组织中4例出现P16基因目的条带缺失，其中3例分别发生在exon1区、exon2a区 、exon2b区，另有一例发生整个P16基因纯合缺失.28例癌旁组织无一例发现纯合缺失. 在28例癌组织中5例发生P16基因突变，2例在exon2a区，3例在exon2b区.28例癌旁组织 无一例发生P16基因突变. 1.3 P16基因与原发性胰腺癌发生的关系.28例原发性胰 腺癌组织有9例出现P16基因变异(32.1%)，28例癌旁组织中无一例发现纯合缺失及突变. 二者相差显著(P<0.01).P16基因变异与胰腺癌临床病理学特征的关系如下表所示 .
表1 P16基因变异与胰腺癌临床病理学特征的关系
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aP<0.05，bP<0.01.
3 讨论在我们研究的28例胰腺癌组织中，共有9例发生了P16基因变异，其中纯合缺失4例，其 中3例分别发生在exon1区、exon2a区、exon2b区，另有一例发生整个P16基因纯合缺失 ；突变5例，均发生在外显子2区，这与文献报道的外显子2区是P16基因易突变区的结论相符.在28例癌旁组织中无一例检测到P16基因变异.癌组织中P16基因变异频率(32.1%)与癌旁组织(0%)相差非常显著(P<0.005)；并且癌组织中的P16基因变异与临床分期密切相关，提示P16基因在原发性胰腺癌的发生、发展过程中发挥非常重要的作用[6].我们对28例胰腺癌中P16基因变异状况结合临床资料分析表明P16基因变异与胰腺癌进展密切相关.其变异率与淋巴结转移及转移个数密切相关，与组织学分化、器官转移无明显相关关系.来自Johns Hopkins医院的201例胰腺癌的统计分析表明，肿瘤直径及有无淋巴结转移是影响胰腺癌预后的重要因素.我们的统计分析显示无淋巴结转移组中 P16基因变异频率为11.7%，明显低于有淋巴结转移组(54.5%)，统计学分析二者相差显 著(P<0.05)，淋巴结转移个数不同组别间的P16基因变异频率存在显著差别(P< 0.01)，提示发生了P16基因变异的胰腺癌具有更强的恶性侵袭能力，P16基因可作 为评估胰腺癌预后的一个有价值的指标，P16基因变异的存在更有可能预示预后不良[7].
, http://www.100md.com
在目前治疗胰腺癌的措施中，除手术切除癌肿被确认为有效外，胰腺癌对其他治疗方法如放 疗、化疗均不敏感.因缺乏早期诊断的特异手段，能够采取手术治疗的患者只占总数的15%. 我们对28例胰腺癌与P16基因及其产物关系的研究提示，P16基因变异及其蛋白失表 达在胰腺癌中发生率较高，在胰腺癌的发生、发展中发挥重要作用.借助于P16基因及其 产物的检测，可判断胰腺癌发展及评估其预后.P16靶基因治疗可能是治疗原发性胰腺癌 的一条有效途径[8-10].
4 参考文献1 Serrano M, Gregory J. A new regulatory motiff in cell cycle control causing specific inhibition of cyclinD/CDK4.
Nature 1993;366:704-709
, http://www.100md.com
2 Huang LY, Tamral L， Goodrow T. Deletion and mutation analyses of p16/MTS -1 tumor suppressor gene in human ductal
pancreatic cancer reveals a higher fre quency in abnormalities in tumor-derived cell lines than in primary ductal adenocarcinomas.
Cancer Res 1996;56:1137-1141
3 姜海行, 刘志明, 庄亚强, 杨定华, 蒋一强, 李佳荃. 人胃癌P16基因纯合子缺失研 究.华人消化杂志 1998;6:934-935
4 崔建涛，吕有勇.改良PCR/SSCP和PCR直接测序在基因突变检测中的应用.新消化病杂志 1 997；5：593-594
, 百拇医药
5 杜铭, 曾昭淳, 李静, 李良彬. 食管鳞癌组织P16基因缺失及突变的研究. 世界华人 消化杂志 2000；8：574-57
6 陈建锋, 俞金龙, 汪爽, 高毅. 胰腺癌组织P16蛋白表达的意义. 世界华人消化杂志 200 1；9：237
7 卜献民, 戴显伟, 马凯, 王之章, 姜维国. 胰腺癌和壶腹癌中P16蛋白及Ki-67的表达. 华人消化杂志 1998;6:415-417
8 王青, 吴金生, 赖大年, 马庆久, 要秀, 潘伯荣. 人直肠癌细胞HR8348导入P16基因 对细胞周期的影响及其意义.
世界华人消化杂志 1999;7:1084
9 郑世曦, 李孝圭, 周利军, 朱兴族. P16真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的 抑制作用. 世界华人消化杂志 2000;8:49-51
10 鲁建国，林晨，黄志强，吴金生，付朋，张雪艳，梁萧，要秀，吴日文.腺病毒介导的P16和顺铂的联合应用对胆管癌细胞系
QBC939的生长抑制作用. 世界华人消化杂 志 2000；8：641-645, http://www.100md.com(尚瑞莲，赵晓晏，郭 萍)
项目负责人 尚瑞莲，250031，重庆市，中国人民解放军第三军医大学附属新桥医院消化内科
收稿日期 2001-10-12 接受日期 2001-10-29
摘要
目的:探讨P16基因与胰腺癌发生、发展的关系.
方法:采用PCR基础缺失分析及PCR-SSCP方法检测P16基因在28例胰腺 癌组织及相应癌旁组织中的纯合缺失及突变状况，并结合临床病理资料进行分析.
, http://www.100md.com
结果:胰腺癌组织中28例有4例出现P16基因纯合缺失，5例发生P1 6基因突变，P16基因变异频率为32.1%，28例癌旁组织中无一例发现纯合缺失及突变. p16基因变异频率与淋巴结转移(P<0.05)、转移淋巴结个数(P<0.01)及临床分期( P<0.05)密切相关.
结论:P16基因变异在胰腺癌的发生中发挥重要作用，是胰腺癌的发展 密切相关，存在P16基因变异的原发性胰腺癌具有更强的恶性潜能，预后更差.
尚瑞莲，赵晓晏，郭萍. 胰腺癌组织中P16基因的缺失突变. 世界华人消化杂 志 2002;10(1):100-102
, 百拇医药
0 引言P16基因是近年发现的一种肿瘤抑制基因，其编码的P16蛋白能与细胞周期依赖性激 酶4(CDK4)高度特异性结合，从而使细胞周期蛋白cyclinD1与CDK4的结合受到竞争性抑制， 影响CDK4/CyclinD1复合物的激酶活性，阻止细胞从G1→S期的演进，而G1→S期是细 胞分化的关键转折点[1].P16基因与胰腺癌的相关深入研究还比较少. 我们采用28例原发性胰腺癌组织及相应癌旁组织进行对比研究，应用PCR基础缺失分析及PCR -SSCP方法检测P16基因缺失及突变状况，并结合临床资料进行综合分析，旨在探讨p 16基因与胰腺癌发生，发展的作用，为胰腺癌的诊断、预后判断及防治策略的开发提供实 验依据.
1 材料和方法
1.1 材料 28例原发性胰腺癌组织及癌旁组织(距肿瘤组织边缘2 cm以内)新鲜标本来源于重庆市八所医院1998-9～1999-12的手术切除组织.每份癌组织及 癌旁组织均于液氮中冻存48h后置于-70℃冰箱中保存，供缺失及突变分析用，正常胰腺组 织4例作为正常对照.28例癌组织中：胰腺导管上皮癌26例，腺泡癌2例；高分化12例，中分 化9例，低分化7例；11例伴有淋巴结转移，其中5例转移淋巴结个数>2个，6例转移淋巴结个 数1-2个，17例无淋巴结转移；5例有肝脏等远处器官转移.根据美国癌症联合委员会1992年 制定的胰腺癌临床分期标准，28例胰腺癌中17例属Ⅰ，Ⅱ期，11例属Ⅲ，Ⅳ期.患者年龄45 岁～69岁，平均年龄54.5岁，男女比例4∶1.
, http://www.100md.com
1.2 方法 设计P16基因exon1及exon2引物[2 ]，(exon3仅11个碱基，未予检测).将exon2分为exon2a(上游片段)及exon2b(下游片段) 两个片段合成引物.引物序列如下：
exon1 (280bp) 上游链：TCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCA
exon1 (280bp) 下游链：GCGCTACCTGATTCCAATTC
exon2a(244bp)上游链：ACAAGCTTCCTTTCCGTCATGCCG
exon2a(244bp)下游链：CCAGGCATCGCGCACGTCCA
, 百拇医药
exon2b(242bp)上游链：TTCCTGGACACGCTGGTGGT
exon2b(242bp)下游链：TCTGAGCTTTGGAAGCTCTCAG
GAPDH内对照基因(474bp)上游链：AGTACGCTGCAGGGCCTCACTCCTT
GAPDH内对照基因(474bp)下游链：AAGAGCCAGTCTCTGGCCCCAGCCA
以上引物由香港Life Teconolgy公司合成. 组织DNA的提取：酚-氯仿法，测定DNA纯度及含 量，A260/A280≥1.7为DNA纯化成功.多聚酶链式反应及纯合缺失分析[2，3]p 16基因目的片段及GAPDH基因同时扩增.扩增总体系为50μL.其中包括1×Taq酶缓冲液， 4×dNTPs 0.2mmoL-1， P16基因片段引物上、下游链0.8mmoL-1，GAPDH基因引物上、下游链0.8mmoL-1，模板2100mgL-1 l00μl，Taq酶(Sagon公司 ) 0.5μL(2.5U)，DMSO2.5μL，dddH2O31μL.反应条件：94℃变性50s，62℃退火50s，72 ℃延伸50s，共35个循环.PCR在Gene cycler 10210(美国PE公司)中进行，用消毒dddH2O代 替模板DNA作为阴性对照，取上述PCR产物于18gL-1的琼脂糖凝胶中电泳，以出现内 对照基因产物同时无P16基因目的片段产物出现者为纯合缺失判断标准.PCR-SSCP(聚合 酶链反应-单链构象多态性分析)[4,5]：未检测出纯合缺失的癌组织及癌旁组织DN A进行聚合酶链反应，反应体系、Taq酶、10×Taq酶缓冲液、4×dNTPs、模板入量、P16 基因片段引物均同前，但不加内对照基因引物，exon2a、exon2b的扩增体系中加入DMSO 2.5 μL，exon1的扩增体系中加入去离子甲酰胺1.8μL. PCR产物95℃变性后在60gL-1非 变性聚丙烯酰胺(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺为49∶1)中电泳.以正常胰腺组织PCR产物作为 正常对照.电泳结束后，凝胶银染.与正常对照相比，出现泳动变位带者为突变阳性. 统计学处理 采用两样本及多个样本的χ2检验进行数据处 理.
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2 结果在28例癌组织中4例出现P16基因目的条带缺失，其中3例分别发生在exon1区、exon2a区 、exon2b区，另有一例发生整个P16基因纯合缺失.28例癌旁组织无一例发现纯合缺失. 在28例癌组织中5例发生P16基因突变，2例在exon2a区，3例在exon2b区.28例癌旁组织 无一例发生P16基因突变. 1.3 P16基因与原发性胰腺癌发生的关系.28例原发性胰 腺癌组织有9例出现P16基因变异(32.1%)，28例癌旁组织中无一例发现纯合缺失及突变. 二者相差显著(P<0.01).P16基因变异与胰腺癌临床病理学特征的关系如下表所示 .
表1 P16基因变异与胰腺癌临床病理学特征的关系
| 临床特征 | P16基因变异 | 变异频率(%) | ||
| 纯合缺失 | 突变 | 无变异 | ||
| 组织学分化 | ||||
| 高 | 1 | 2 | 9 | 25.0 |
| 中、低分化 | 3 | 3 | 10 | 37.5 |
| 淋巴结转移 | ||||
| >2个 | 3 | 1 | 1 | 80.0 |
| 1-2个 | 1 | 2 | 3 | 50.0b |
| 无 | 0 | 2 | 15 | 11.7a |
| 远处器官转移 | ||||
| 有 | 2 | 1 | 2 | 60.0 |
| 无 | 2 | 4 | 17 | 26.1 |
| 临床分期 | ||||
| Ⅰ、Ⅱ期 | 1 | 1 | 15 | 5.8 |
| Ⅲ、Ⅳ期 | 3 | 4 | 4 | 72.7a |
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aP<0.05，bP<0.01.
3 讨论在我们研究的28例胰腺癌组织中，共有9例发生了P16基因变异，其中纯合缺失4例，其 中3例分别发生在exon1区、exon2a区、exon2b区，另有一例发生整个P16基因纯合缺失 ；突变5例，均发生在外显子2区，这与文献报道的外显子2区是P16基因易突变区的结论相符.在28例癌旁组织中无一例检测到P16基因变异.癌组织中P16基因变异频率(32.1%)与癌旁组织(0%)相差非常显著(P<0.005)；并且癌组织中的P16基因变异与临床分期密切相关，提示P16基因在原发性胰腺癌的发生、发展过程中发挥非常重要的作用[6].我们对28例胰腺癌中P16基因变异状况结合临床资料分析表明P16基因变异与胰腺癌进展密切相关.其变异率与淋巴结转移及转移个数密切相关，与组织学分化、器官转移无明显相关关系.来自Johns Hopkins医院的201例胰腺癌的统计分析表明，肿瘤直径及有无淋巴结转移是影响胰腺癌预后的重要因素.我们的统计分析显示无淋巴结转移组中 P16基因变异频率为11.7%，明显低于有淋巴结转移组(54.5%)，统计学分析二者相差显 著(P<0.05)，淋巴结转移个数不同组别间的P16基因变异频率存在显著差别(P< 0.01)，提示发生了P16基因变异的胰腺癌具有更强的恶性侵袭能力，P16基因可作 为评估胰腺癌预后的一个有价值的指标，P16基因变异的存在更有可能预示预后不良[7].
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在目前治疗胰腺癌的措施中，除手术切除癌肿被确认为有效外，胰腺癌对其他治疗方法如放 疗、化疗均不敏感.因缺乏早期诊断的特异手段，能够采取手术治疗的患者只占总数的15%. 我们对28例胰腺癌与P16基因及其产物关系的研究提示，P16基因变异及其蛋白失表 达在胰腺癌中发生率较高，在胰腺癌的发生、发展中发挥重要作用.借助于P16基因及其 产物的检测，可判断胰腺癌发展及评估其预后.P16靶基因治疗可能是治疗原发性胰腺癌 的一条有效途径[8-10].
4 参考文献1 Serrano M, Gregory J. A new regulatory motiff in cell cycle control causing specific inhibition of cyclinD/CDK4.
Nature 1993;366:704-709
, http://www.100md.com
2 Huang LY, Tamral L， Goodrow T. Deletion and mutation analyses of p16/MTS -1 tumor suppressor gene in human ductal
pancreatic cancer reveals a higher fre quency in abnormalities in tumor-derived cell lines than in primary ductal adenocarcinomas.
Cancer Res 1996;56:1137-1141
3 姜海行, 刘志明, 庄亚强, 杨定华, 蒋一强, 李佳荃. 人胃癌P16基因纯合子缺失研 究.华人消化杂志 1998;6:934-935
4 崔建涛，吕有勇.改良PCR/SSCP和PCR直接测序在基因突变检测中的应用.新消化病杂志 1 997；5：593-594
, 百拇医药
5 杜铭, 曾昭淳, 李静, 李良彬. 食管鳞癌组织P16基因缺失及突变的研究. 世界华人 消化杂志 2000；8：574-57
6 陈建锋, 俞金龙, 汪爽, 高毅. 胰腺癌组织P16蛋白表达的意义. 世界华人消化杂志 200 1；9：237
7 卜献民, 戴显伟, 马凯, 王之章, 姜维国. 胰腺癌和壶腹癌中P16蛋白及Ki-67的表达. 华人消化杂志 1998;6:415-417
8 王青, 吴金生, 赖大年, 马庆久, 要秀, 潘伯荣. 人直肠癌细胞HR8348导入P16基因 对细胞周期的影响及其意义.
世界华人消化杂志 1999;7:1084
9 郑世曦, 李孝圭, 周利军, 朱兴族. P16真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的 抑制作用. 世界华人消化杂志 2000;8:49-51
10 鲁建国，林晨，黄志强，吴金生，付朋，张雪艳，梁萧，要秀，吴日文.腺病毒介导的P16和顺铂的联合应用对胆管癌细胞系
QBC939的生长抑制作用. 世界华人消化杂 志 2000；8：641-645, http://www.100md.com(尚瑞莲，赵晓晏，郭 萍)