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编号:10693485
结石性胆囊炎及胆囊腺瘤性息肉黏膜组织MUC1粘蛋白的检测 郑 伟, 陈东风,冷恩仁, 马红军,杜宏伟
http://www.100md.com 2002年9月15日 《世界华人消化杂志》 2002年第9期
     郑伟,马红军,中国人民解放军271医院消化科 天津市 300191

    陈东风,冷恩仁,中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化科 重庆市大坪 400042

    杜宏伟,中国人民解放军464医院普外科 天津市 300381

    国家自然科学基金资助,No.39970039

    项目负责人 陈东风,400042, 重庆市大坪长江支路10号,中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化科.

    电话:023-68757342

    收稿日期 2002-06-01 接受日期 2002-07-03
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    摘要

    目的
:检测胆囊息肉、胆固醇结石、胆红素结石时胆囊黏膜MUC1粘蛋白的(半)定量表达及规律.

    方法:采用Western-blot法:称取液氮保存胆囊黏膜组织100-200mg加入组织裂解液1ml匀浆、离心、去上清、分装、测蛋白含量、电泳、电转移、杂交、化学发光试剂检测.

    结果:ODu结果分别为34.29±6.06(对照组),142.11±38.49(胆红素结石组),39.72±11.46(胆固醇结石组),174.59±41.6(胆囊息肉组).

    结论:对照组胆囊、结石性胆囊及腺瘤性息肉胆囊有MUC1粘蛋白的表达,且表达量逐渐增高.正常胆囊-结石性胆囊炎-胆囊息肉MUC1粘蛋白的表达是上调表达;用Western-Blot可以较好地检测各种胆囊组织黏膜MUC1粘蛋白的对比含量和带形分布,不同疾病粘蛋白含量不同,带形分布不一样,相同疾病标本粘蛋白含量也不尽相同.
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    郑伟, 陈东风, 冷恩仁, 马红军, 杜宏伟 结石性胆囊炎及胆囊腺瘤性息肉黏膜组织MUC1粘蛋白的检测.世界华人消化杂志

    2002; 10(9):1059-1061

    0 引言蛋白免疫印迹法(western-blotting)是一项综合凝胶电泳,具有高分辨率的生物分子亲和技术,特异性高,敏感性高,国外已广泛用于蛋白质分析与检测,包括存在部位、分子量、含量等;我们用此项技术进行了胆囊MUC1 粘蛋白在胆囊不同疾病时的含量检测,配合免疫组化,取得了满意的效果,现报告如下:

    1 材料和方法

    1.1
材料 主要仪器和试剂:电泳槽(BIORAD 美国),转移槽(BIORAD 美国),低温高速离心机(beckman公司)、蛋白分析仪(beckman 美国)、恒温脱色摇床(江苏海门市麒麟医用仪器厂),电子微量天平(上海天平仪器厂),DAB(北京中山),抑蛋白酶肽(aprotirin,sigma),PMSF(merck),丙烯酰胺(sigma),N,N`-亚甲双丙烯酰胺(sigma),BSA(中山),APES(武汉博士德),TWEEN(国产),Tris碱(北京化学试剂公司),b-巯基乙醇(国产),溴酚兰(sigma),HEPES(boehringer mannheim),十二烷基磺酸钠(SDS)(santa cruz),MUC1单克隆粘蛋白抗体(深圳晶美公司)、Werstern 二抗(辣根过氧化酶标记的抗羊IgG,北京中山),蛋白标准品(Sigma),Western blot 发光试剂盒(NENTM美国),显影液、定影液(国产)、PVDF膜(boehringer mannheim),胶片(FUJI 日本).
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    1.2 方法

    1.2.1 标本来源、固定、保存 取外科手术或腹腔镜下摘除之胆囊标本,立即置于-70℃超低温冰箱或液氮中存放并进行分类、登记,结石按外科学进行分类,筛选出胆固醇结石54例、胆红素结石38例、腺瘤性息肉24例;对照组胆囊标本24例,对照组取自远离息肉1-2cm部位.

    1.2.2 黏膜组织匀浆及样品的制备 将组织放入10ml离心管,加入细胞裂解液1ml(Tris·Cl 50ml,PH8.0,1M,5M NaCl 30m1,NP-40 10m1,0.5M EDTA 4m1,0.5M去氧胆酸钠10m1,100mM PMSF10m1用时现加),2mg/ml Leupeptin 5m1,2mg/ml Aprotinin 2.5m1,0.5M焦磷酸钠10m1,10%SDS10m1(用时现加),三蒸水定容至1.0ml,充分匀浆,4℃离心12000rpm10min,去上清分装成20m1/管;蛋白分析仪测浓度,再加入三蒸水使每管浓度为20mg/ml,再加入等体积的加样缓冲液(10%SDS2.0 ml,甘油1.0ml,0.5molTris-HCl (PH6.8)1.6ml,β-巯基乙醇0.5ml,溴酚蓝2mg,三蒸水至10ml)混匀备用;用前煮沸5min,短暂离心,按每孔60ug蛋白上样.
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    1.2.3 电泳 垂直电泳槽中加入分离胶(三蒸水4ml,30%聚丙烯酰胺3.3ml,1.5M Tris2.5ml, 10%SDS 100ml,10%APS100ml,最后加10%TEMED 4ml,占下3/4),用注射器注入浓缩胶(浓度和成分同前,分别为:3.4,0.83,0.63, 50ml,50ml,5ml),插上梳子,室温聚合1h.待胶完全聚合后取下梳子,用滤纸吸净样品空孔的液体,将待测样本制成终浓度为6g/L的上样样本,与上样缓冲液等体积混匀,煮沸5min,短暂离心,按每孔60ug蛋白上样,每样上两块平行胶,按对照组、胆红素、胆固醇、腺瘤息肉胆囊组织、蛋白质标准品顺序上样30ml/孔;上样完毕后电泳槽中加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mmol/L Tris 3.03g,192mmol/L 甘氨酸14.42g,0.1%SDS 1g,PH8.0),预电泳电压先以80v恒压进行,待溴酚蓝指示剂入分离胶后将电压改为120v恒压,电泳至溴酚蓝指示剂到底边处停止电泳,取下凝胶.
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    1.2.4 电转膜 电泳完毕将胶取下做好标记,按以下顺序,塑料孔板-海绵-滤纸-电泳凝胶-PVDF膜-海绵-滤纸-海绵-塑料孔板,放于电转移液中(甘氨酸11.26g,Tris 2.42g,20%甲醇 500ml ,PH8.0)转膜,80mA恒流电转移15-20h .

    1.2.5 杂交 取下电转移的PVDF膜,0.01mol/L PBS洗膜3次,置于1%BSA/PBST中40C封闭过夜;加1:200稀释的第一抗,37℃恒温孵育2h,取出PVDF膜用1×PBST漂洗15min×1次,5min×4次,加辣根过氧化酶标记的相应二抗(1:1000稀释),37℃恒温孵育1h, PBST漂洗1×15min、4×5min.

    1.2.6 检测、制片 取NEN化学发光试剂A、B液各1ml放入玻璃培养皿中混匀,放入PVDF膜约40s后蛋白条带均匀发光后取出,放入暗盒使X线胶暴光0.5-3min,取出胶片放入显影液中显影,清水冲洗后放入定影液中20-30min,取出胶片清水冲洗30min,凉干观察结果.
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    1.2.7 Western-blot杂交分析 所得结果扫入计算机用GL Doc2000图像分析系统进行光密度测定,数据处理用t 检验.

    2 结果用以上方法得到了背景干净、目标带清晰、非特异性结合少的X线片.将翻拍出的黑白照片用GL Doc2 000图像分析系统进行光密度测定,连续测量三次取平均值,并对得出四个标本的平均值加标准差(c±s)进行分析, 结果分别为正常胆囊组:34.29±6.06; 胆红素结石组:142.11±38.49;胆固醇结石组:39.72±11.46;胆囊息肉组:174.59±41.6.

    不同疾病的胆囊黏膜MUC1粘蛋白含量不一样,相同胆囊疾病MUC1粘蛋白的含量也有差别,其中以对照组胆囊黏膜内表达量最低,胆固醇结石胆囊标本、胆红素结石胆囊标本渐增高,而以胆囊腺瘤样息肉黏膜腺细胞内MUC1粘蛋白表达量最高,不同疾病之间MUC1粘蛋白Odu值应用t检验有显著差异,P <0.05,而相同疾病黏膜间粘蛋白的含量无显著差异(P >0.05).
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    3 讨论MUC1粘蛋白广泛存在于胃肠胆道、呼吸道、泌尿生殖道、乳腺等上皮腺细胞中,是具有大分子量的具有寡糖链的糖蛋白,主要具有保护和润滑作用[1-4],在组织和血液中还有细胞黏附作用、参与细胞间通讯和信息传递、维持细胞的极性、抗感染作用、参与受体作用及生殖等[5-7];研究发现,上述组织在由正常细胞向肿瘤细胞演变过程中,粘蛋白的结构、数量、分布、功能等诸多方面都发生一些变化[8],通过对其变化规律的研究可以使我们更好地认识肿瘤的发生、发展及预后,为进一步探讨粘蛋白与肿瘤的关系和治疗提供实验证据,因此准确特异地检测粘蛋白含量及分布规律具有重要意义.

    粘蛋白与胆囊疾患 正常情况下MUC1粘蛋白在胆囊黏膜的表达是有限的,但当发生癌变时其表达也发生变化:表达量可成倍增加、在细胞表面分布的极性消失、结构发生改变,出现新的抗原表位等[9-12];在癌变之前,粘蛋白的变化对胃肠道黏膜的影响过程可能是:正常胃肠道黏膜→增生→化生→不典型增生,这被认为是癌前期病变的发展模式[13,14];大多数学者认为,胃的肠化上皮细胞中含硫酸黏液者容易恶变,对胆囊肠上皮化生的研究发现,化生细胞内含有硫酸黏液,说明胆囊黏膜肠上皮化生是胆囊癌癌前病变[14].回顾性研究发现,各型单纯增生存在于胆石病或胆囊炎的黏膜;不典型增生和癌发生于单纯增生/肠化及不典型增生的背景上;胆囊癌是通过单纯增生、不典型增生一系列变化最后形成原位癌[14] ;而Laitio[15]在观察粘蛋白的表达规律时发现在肿瘤标本中,细胞中粘蛋白的数量随着分化程度的增加而下降,也说明MUC1粘蛋白在已经发生恶变的标本也随着恶性程度增加而表达阳性率也增加的规律[16];对单纯不典型增生来讲,随着不典型增生程度的增加,粘蛋白(主要是非硫酸和中性粘蛋白)的数量却明显下降,有丝分裂像上皮伪层的增加和染色加深,粘蛋白的类型也随之发生变化[15],MUC1粘蛋白的糖基化不完全、异常分布、异位表达是恶性及恶性变的特点[17].
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    我们的免疫组化和Western-blot研究同时显示,MUC1粘蛋白在从正常黏膜到癌变之间经历有规律的变化:胆固醇结石组的粘蛋白表达阳性率高于对照组胆囊,胆红素结石粘蛋白表达阳性率高于胆固醇结石黏膜,腺瘤样息肉的又高于胆红素的;而相同疾病的黏膜标本之间粘蛋白的含量虽有差别但不明显(P >0.05),而不同疾病之间粘蛋白的含量差别非常显著(P <0.01);我们还用组化方法检测了相同疾病之间在增生、肠化、不典型增生情况下粘蛋白的表达量的差别,结果显示,随着病情的进展其表达水平也随之升高,说明MUC1基因核心蛋白骨架的表达与胆囊肿瘤的发生、发展有密切关系,若MUC1粘蛋白表达明显升高则提示组织的恶性变趋势 [7,18,19](但是胆囊以外的胆道系统MUC1粘蛋白的表达情况与胆囊并不完全一致[20]),提示其有可能作为预测、检测肿瘤的标志物之一[21,22].

    关于实验方法 通过文献[23,24]检索,在原有方法基础上结合我们自己的条件建立了更方便使用的检测MUC1粘蛋白的方法,该方法利用特异性抗MUC1粘蛋白抗体和辣根过氧化物酶标记的三抗和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的相应蛋白质(MUC1粘蛋白,抗原)结合来鉴定MUC1粘蛋白,此方法既敏感且能特异性地检查出极其微量粘蛋白的存在,本法的要点是:样品的制备:(1) 取新鲜置于-70℃或液氮中未固定的组织标本140-200mg/样本,( 秤取标准要一致,如均取全层或取去掉浆膜结缔组织层的标本) ;(2) 匀浆要充分;(3) 测蛋白质浓度三次取其平均值;(4)加样及加水要准确至0.1ml;关于电泳:配胶试剂加样要准确,否则影响胶的质量就会影响电泳效果;关于电转膜:PVDF膜应与分离胶大小相宜、相贴紧密,中间不能留有气泡,否则结果的条带上会出现圆形缺损或使条带中断;杂交:将转移的PVDF膜置于带封条槽的塑料口服药袋内,放入适当稀释的一抗(4ml),轻轻挤出气泡、密封药袋、放淤托盘内置恒温37℃脱色摇床内进行杂交,这样可大大节省抗体;Buffer冲洗要充分,否则杂带多、背景脏而不清晰.分析:所得结果扫入计算机进行图像分析,测平均光密度ODu值.
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