肠道轮状病毒混合感染与其肠道外扩散的关系 欧巧群,姚英民,李 宁
欧巧群,姚英民,李宁,中国人民解放军第一军医大学南方医院儿科广东省广州市 510515
项目负责人 姚英民,510515,广东省广州市第一军医大学南方医院儿科.
电话:020-85140025
收稿日期 2002-07-10 接受日期 2002-07-25
摘要目的:为了了解肠道混合感染在诱发轮状病毒(RV)肠道外扩散中的作用，为临床的防治提供有价值的参考.
方法:健康昆明小鼠灌胃接种产毒性大肠杆菌和/或RV后，处死小鼠，光镜下观察病理变化，各脏器原位杂交、原位PCR检测RV，并与健康小鼠相比较.
, 百拇医药
结果:混合感染组小肠绒毛变短，部分裸露，黏膜腺体肿胀，淋巴细胞和少量粒细胞浸润.肝窦血管扩张充血；肾小球和肾间质充血，肾小管浊肿；心、肺、胰、脑组织未见明显改变.RV组可见小肠绒毛变短，部分裸露，其余各组织器官未见明显镜下改变.混合感染组原位杂交小肠上皮细胞、肾近曲小管上皮细胞呈阳性；原位PCR小肠绒毛刷状缘和肠腺细胞胞质、肾近曲小管和集合上皮细胞胞质、肝细胞胞膜呈阳性，其他呈阴性.
结论:产毒性肠致病菌混合感染也是诱发RV肠道外扩散的重要原因之一.
欧巧群,姚英民,李宁.肠道轮状病毒混合感染与其肠道外扩散的关系.世界华人消化杂志 2002;10(10):1225-1226
0 引言轮状病毒(RV)不仅可以引起胃肠道感染，而且可以扩散到肠道外的组织器官，导致多种并发症，是RV腹泻死亡的重要原因之一
, 百拇医药
[1-3].但是，RV病毒肠道外扩散的机制，其扩散的途径，易感的器官，对靶器官造成的损害，都不清楚.我们利用产毒性大肠杆菌(ETEC)与RV混合感染的动物模型，试图了解肠道混合感染在诱发RV病毒肠道外扩散中的作用，为进一步研究RV肠道外扩散的机制以及临床的防治提供依据.
1 材料和方法1.1 材料 普通级健康昆明小鼠，由第一军医大学动物研究所提供，共24只，雌雄各半，15-16 d龄，质量7.5-9.0g，(平均8.4 g).试验前大便轮状病毒ELISA检测和PAGE电泳均为阴性.RV来源为从流行高峰时期腹泻患儿新鲜粪便中获取，RV抗原ELISA检测，PAGE电泳出现11条特异的条带，形状属于长型.将3份患儿新鲜粪便混合，-37 ℃冻存过夜，4 000 r/min离心，取上清加生理盐水稀释2倍，加青链霉素，4℃过夜，0.22mm微孔虑膜过滤.取少量标本送细菌培养未发现细菌生长.ETEC来源为人源性产毒性大肠杆菌ETEC44813，由第一军医大学流行病学教研室馈送，肉汤培养基培养12 h，密度为1×1013 /L.RV抗原ELISA检测试剂盒由卫生部兰州生物制品研究所提供.原位杂交探针标记试剂盒系GIBOCO产品，原位杂交检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒I.
, 百拇医药
1.2 方法 ETEC接种小鼠参考陈清et al [4]方法，ETEC组12只小鼠强制灌胃法接种ETEC，每只0.4 mL.试验前禁食6 h，试验前30min口服14g/L NaHCO3 0.5 mL ;试验后继续禁食3 h.另外肉汤培养基组(对照组)12只每只接种肉汤培养基，其方法同ETEC组.接种后2 d，ETEC组小鼠出现黏液便，活动减少.接种ETEC后48和72 h分别2次接种RV，A组(ETEC+RV)：ETEC组中6只小鼠灌胃接种RV悬液0.4mL;B组(ETEC)：ETEC组剩下6只小鼠灌胃生理盐水0.4mL;C组(RV)：肉汤培养基组6只小鼠灌胃接种RV悬液0.4 mL；D组(空白对照组):肉汤培养基组6只灌胃生理盐水0.4 mL.接种RV后3 d处死小鼠，按照病理切片常规方法，光镜下观察病理变化.各脏器按照文献[5]方法进行原位杂交和原位PCR检测RV.
2 结果
, 百拇医药
各组动物均未出现腹泻，同时接种ETEC和RV的动物在RV接种后2 d起出现精神差，活动减少，毛松，体重增加较其他组减少或体重下降.其余各组未出现以上情况.
2.1 大便RV抗原ELISA 检测 同时接种了ETEC和RV的实验组6只动物中，有3只在接种RV 后第2、3天大便ELISA阳性，在+-++之间.其余各组未出现阳性.ELISA阳性的大便标本PAGE电泳出现了11条特异的条带，形状属于长型.
2.2 组织形态学检查 ETEC+RV组动物小肠绒毛变短，部分裸露，黏膜腺体肿胀，淋巴细胞和少量粒细胞浸润.肝窦血管扩张充血；肾小球和肾间质充血，肾小管浊肿，心、肺、胰、脑组织未见明显改变.RV组可见小肠绒毛变短，部分裸露，肝、肾、心、肺、胰、脑组织未见明显改变.其余组动物各个组织器官未见明显改变.
2.3 各组织器官原位PCR检测 ETEC+RV组的动物小肠绒毛刷状缘和肠腺细胞胞质染色阳性，肾近曲小管和集合管上皮细胞胞质阳性，肝细胞胞膜阳性.心、脑、胰和肺组织未见着色.原位杂交可见小肠上皮细胞、肾近曲小管上皮细胞呈阳性.其余组动物各个组织器官均为阴性.
, 百拇医药
3 讨论
通常认为，轮状病毒(RV)只侵犯消化系统造成病毒性肠炎，但近年来常有RV肠道外器官感染的报道，并发现其可引起病毒血症[6,7]，且对血液系统造成直接的损害[8]，是何种因素使RV能通过层层防线向全身扩散？有学者曾在8例RV肠道外感染的死亡病例中发现多数患者合并了痢疾杆菌、伤寒杆菌或大肠杆菌感染.我们也报道了一例RV胃肠炎合并了痢疾杆菌感染而死亡的病例[5].侵袭性致病菌可以直接破坏肠黏膜的完整性[9]，而产毒性肠致病菌一般不影响肠黏膜的完整性，但可以导致小肠组织但充血、水肿、细胞变性等明显炎症反应[10]，这些因素削弱了肠黏膜的局部保护功能，使之对微生物对抵抗力下降，为局限在小肠上皮细胞增生的肠病毒扩散到全身创造了条件.另外，直接从患者体内提取病毒接种动物制作丙型肝炎、庚型肝炎是一种常见到方法[11].国内也有人用RV腹泻患儿大便标本成功地感染云南树鼩，但经组织病理检查未发现肠道外感染征象.我们采用产毒性大肠杆菌与RV腹泻患儿大便标本混合感染小鼠，结果显示小鼠小肠、肾脏、肝脏均有受累，而单纯RV感染组小鼠仅见小肠的改变，进一步证实除侵袭性肠致病菌外，产毒性大肠杆菌混合感染也是诱发RV肠道外扩散的重要原因之一.
, 百拇医药
多年来，人们公认RV在小肠绒毛上皮细胞刷状缘内复制为其特征.前期我们在一例RV胃肠炎合并来痢疾杆菌感染而死亡的病例中发现，在小肠黏膜腺体内也检测到RV，本次实验再次证实除小肠绒毛上皮细胞外，小肠腺上皮细胞也是RV感染的靶细胞之一.推测合并了痢疾杆菌、伤寒杆菌或大肠杆菌等致病菌感染，肠黏膜结构的完整性或肠黏膜屏障破坏之后，大量RV由肠黏膜刷状缘向深层迁移，直接进入了富含血管的黏膜层，经周围的血管或淋巴液形成病毒血症向全身扩散.也可在小肠黏膜层腺体内进一步复制、繁殖，经周围的血管或淋巴液形成病毒血症向全身扩散.病毒受体与病毒的宿主范围、组织嗜性有密切关系，是病毒致病性的主要原因之一.体外培养RV常见的细胞系有猴胚肾细胞(MA104)和人类肝细胞(HepG2),说明肾上皮细胞和肝细胞在体外可以支持RV生长、复制、繁殖.据调查，一个肾脏上皮细胞含有105个RV 受体，肾脏近段集合管上皮细胞与小肠上皮细胞在生理学上有着十分相似的同源性.本实验进一步证实一旦人类RV向全身扩散，肝和肾仍然是主要的易感器官，而且直接经原位杂交而不经PCR扩散即可在肾脏内检测出RV，说明肾脏内RV的数量比较多，但是到目前为止，在临床上尚未见到有关肾脏受功能受累的报道，可能与肾脏代偿功能非常强大或RV 为一过性感染有关.
, 百拇医药
4 参考文献1 龚四堂,肖作源.婴幼儿轮状病毒肠炎肠道外多器官损害的临床研究.中国误诊医学杂志 2002;1:159-162
2 张振洪,姚英民.轮状病毒胃肠道外脏器损伤及防治策略.中国急救医学 2002;5:295-296
3 应爱娟,包云光.婴幼儿轮状病毒感染的肝脏损害.实用儿科临床杂志 2000;4:222-223
4 陈清,申洪,俞守义.产毒性大肠杆菌对豚鼠致病性的实验研究.中国人兽共患病杂志 2000;6:48-50
5 李宁,张素娟,姚英民,张传仓.间接原位PCR方法检测组织中轮状病毒.临床与实验病理学杂志 2001;17:82-83
6 欧巧群,李宁,姚英民.轮状病毒致肝功能损害以及与病毒血症的初步研究.世界华人消化杂志 2001;9:476-477
, 百拇医药
7 周最明,梁巧明,杜江,吴秒玲.轮状病毒腹泻患儿病毒血症研究. 中国人兽共患病杂志 2000;1:31-32
8 李旭,赵源.轮状病毒肠炎并血小板减少性紫癜一例.中华儿科杂志1999;12:773
9 徐景野,王仁元,许国章.侵袭性大肠杆菌试验研究 中国卫生检验杂志 2000;4:507-509
10 Al Hasani K, Adler B, Rajakumar K, Sakellaris H. Distribituon and structural variation of the pathogenicity island
in enteric bacterial pathogens. J Med Microbiol 2002;50:780-786
11 许家璋,鞠九龙,杨志国等.庚型肝炎病毒感染中国恒河猴血清学和肝组织学的动态学观察.中华实验和临床病毒
学杂志1999;13:71-73, 百拇医药(肠道轮状病毒混合感染与其肠道外扩散的关系 欧巧群,姚英民,李 宁)
项目负责人 姚英民,510515,广东省广州市第一军医大学南方医院儿科.
电话:020-85140025
收稿日期 2002-07-10 接受日期 2002-07-25
摘要目的:为了了解肠道混合感染在诱发轮状病毒(RV)肠道外扩散中的作用，为临床的防治提供有价值的参考.
方法:健康昆明小鼠灌胃接种产毒性大肠杆菌和/或RV后，处死小鼠，光镜下观察病理变化，各脏器原位杂交、原位PCR检测RV，并与健康小鼠相比较.
, 百拇医药
结果:混合感染组小肠绒毛变短，部分裸露，黏膜腺体肿胀，淋巴细胞和少量粒细胞浸润.肝窦血管扩张充血；肾小球和肾间质充血，肾小管浊肿；心、肺、胰、脑组织未见明显改变.RV组可见小肠绒毛变短，部分裸露，其余各组织器官未见明显镜下改变.混合感染组原位杂交小肠上皮细胞、肾近曲小管上皮细胞呈阳性；原位PCR小肠绒毛刷状缘和肠腺细胞胞质、肾近曲小管和集合上皮细胞胞质、肝细胞胞膜呈阳性，其他呈阴性.
结论:产毒性肠致病菌混合感染也是诱发RV肠道外扩散的重要原因之一.
欧巧群,姚英民,李宁.肠道轮状病毒混合感染与其肠道外扩散的关系.世界华人消化杂志 2002;10(10):1225-1226
0 引言轮状病毒(RV)不仅可以引起胃肠道感染，而且可以扩散到肠道外的组织器官，导致多种并发症，是RV腹泻死亡的重要原因之一
, 百拇医药
[1-3].但是，RV病毒肠道外扩散的机制，其扩散的途径，易感的器官，对靶器官造成的损害，都不清楚.我们利用产毒性大肠杆菌(ETEC)与RV混合感染的动物模型，试图了解肠道混合感染在诱发RV病毒肠道外扩散中的作用，为进一步研究RV肠道外扩散的机制以及临床的防治提供依据.
1 材料和方法1.1 材料 普通级健康昆明小鼠，由第一军医大学动物研究所提供，共24只，雌雄各半，15-16 d龄，质量7.5-9.0g，(平均8.4 g).试验前大便轮状病毒ELISA检测和PAGE电泳均为阴性.RV来源为从流行高峰时期腹泻患儿新鲜粪便中获取，RV抗原ELISA检测，PAGE电泳出现11条特异的条带，形状属于长型.将3份患儿新鲜粪便混合，-37 ℃冻存过夜，4 000 r/min离心，取上清加生理盐水稀释2倍，加青链霉素，4℃过夜，0.22mm微孔虑膜过滤.取少量标本送细菌培养未发现细菌生长.ETEC来源为人源性产毒性大肠杆菌ETEC44813，由第一军医大学流行病学教研室馈送，肉汤培养基培养12 h，密度为1×1013 /L.RV抗原ELISA检测试剂盒由卫生部兰州生物制品研究所提供.原位杂交探针标记试剂盒系GIBOCO产品，原位杂交检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒I.
, 百拇医药
1.2 方法 ETEC接种小鼠参考陈清et al [4]方法，ETEC组12只小鼠强制灌胃法接种ETEC，每只0.4 mL.试验前禁食6 h，试验前30min口服14g/L NaHCO3 0.5 mL ;试验后继续禁食3 h.另外肉汤培养基组(对照组)12只每只接种肉汤培养基，其方法同ETEC组.接种后2 d，ETEC组小鼠出现黏液便，活动减少.接种ETEC后48和72 h分别2次接种RV，A组(ETEC+RV)：ETEC组中6只小鼠灌胃接种RV悬液0.4mL;B组(ETEC)：ETEC组剩下6只小鼠灌胃生理盐水0.4mL;C组(RV)：肉汤培养基组6只小鼠灌胃接种RV悬液0.4 mL；D组(空白对照组):肉汤培养基组6只灌胃生理盐水0.4 mL.接种RV后3 d处死小鼠，按照病理切片常规方法，光镜下观察病理变化.各脏器按照文献[5]方法进行原位杂交和原位PCR检测RV.
2 结果
, 百拇医药
各组动物均未出现腹泻，同时接种ETEC和RV的动物在RV接种后2 d起出现精神差，活动减少，毛松，体重增加较其他组减少或体重下降.其余各组未出现以上情况.
2.1 大便RV抗原ELISA 检测 同时接种了ETEC和RV的实验组6只动物中，有3只在接种RV 后第2、3天大便ELISA阳性，在+-++之间.其余各组未出现阳性.ELISA阳性的大便标本PAGE电泳出现了11条特异的条带，形状属于长型.
2.2 组织形态学检查 ETEC+RV组动物小肠绒毛变短，部分裸露，黏膜腺体肿胀，淋巴细胞和少量粒细胞浸润.肝窦血管扩张充血；肾小球和肾间质充血，肾小管浊肿，心、肺、胰、脑组织未见明显改变.RV组可见小肠绒毛变短，部分裸露，肝、肾、心、肺、胰、脑组织未见明显改变.其余组动物各个组织器官未见明显改变.
2.3 各组织器官原位PCR检测 ETEC+RV组的动物小肠绒毛刷状缘和肠腺细胞胞质染色阳性，肾近曲小管和集合管上皮细胞胞质阳性，肝细胞胞膜阳性.心、脑、胰和肺组织未见着色.原位杂交可见小肠上皮细胞、肾近曲小管上皮细胞呈阳性.其余组动物各个组织器官均为阴性.
, 百拇医药
3 讨论
通常认为，轮状病毒(RV)只侵犯消化系统造成病毒性肠炎，但近年来常有RV肠道外器官感染的报道，并发现其可引起病毒血症[6,7]，且对血液系统造成直接的损害[8]，是何种因素使RV能通过层层防线向全身扩散？有学者曾在8例RV肠道外感染的死亡病例中发现多数患者合并了痢疾杆菌、伤寒杆菌或大肠杆菌感染.我们也报道了一例RV胃肠炎合并了痢疾杆菌感染而死亡的病例[5].侵袭性致病菌可以直接破坏肠黏膜的完整性[9]，而产毒性肠致病菌一般不影响肠黏膜的完整性，但可以导致小肠组织但充血、水肿、细胞变性等明显炎症反应[10]，这些因素削弱了肠黏膜的局部保护功能，使之对微生物对抵抗力下降，为局限在小肠上皮细胞增生的肠病毒扩散到全身创造了条件.另外，直接从患者体内提取病毒接种动物制作丙型肝炎、庚型肝炎是一种常见到方法[11].国内也有人用RV腹泻患儿大便标本成功地感染云南树鼩，但经组织病理检查未发现肠道外感染征象.我们采用产毒性大肠杆菌与RV腹泻患儿大便标本混合感染小鼠，结果显示小鼠小肠、肾脏、肝脏均有受累，而单纯RV感染组小鼠仅见小肠的改变，进一步证实除侵袭性肠致病菌外，产毒性大肠杆菌混合感染也是诱发RV肠道外扩散的重要原因之一.
, 百拇医药
多年来，人们公认RV在小肠绒毛上皮细胞刷状缘内复制为其特征.前期我们在一例RV胃肠炎合并来痢疾杆菌感染而死亡的病例中发现，在小肠黏膜腺体内也检测到RV，本次实验再次证实除小肠绒毛上皮细胞外，小肠腺上皮细胞也是RV感染的靶细胞之一.推测合并了痢疾杆菌、伤寒杆菌或大肠杆菌等致病菌感染，肠黏膜结构的完整性或肠黏膜屏障破坏之后，大量RV由肠黏膜刷状缘向深层迁移，直接进入了富含血管的黏膜层，经周围的血管或淋巴液形成病毒血症向全身扩散.也可在小肠黏膜层腺体内进一步复制、繁殖，经周围的血管或淋巴液形成病毒血症向全身扩散.病毒受体与病毒的宿主范围、组织嗜性有密切关系，是病毒致病性的主要原因之一.体外培养RV常见的细胞系有猴胚肾细胞(MA104)和人类肝细胞(HepG2),说明肾上皮细胞和肝细胞在体外可以支持RV生长、复制、繁殖.据调查，一个肾脏上皮细胞含有105个RV 受体，肾脏近段集合管上皮细胞与小肠上皮细胞在生理学上有着十分相似的同源性.本实验进一步证实一旦人类RV向全身扩散，肝和肾仍然是主要的易感器官，而且直接经原位杂交而不经PCR扩散即可在肾脏内检测出RV，说明肾脏内RV的数量比较多，但是到目前为止，在临床上尚未见到有关肾脏受功能受累的报道，可能与肾脏代偿功能非常强大或RV 为一过性感染有关.
, 百拇医药
4 参考文献1 龚四堂,肖作源.婴幼儿轮状病毒肠炎肠道外多器官损害的临床研究.中国误诊医学杂志 2002;1:159-162
2 张振洪,姚英民.轮状病毒胃肠道外脏器损伤及防治策略.中国急救医学 2002;5:295-296
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4 陈清,申洪,俞守义.产毒性大肠杆菌对豚鼠致病性的实验研究.中国人兽共患病杂志 2000;6:48-50
5 李宁,张素娟,姚英民,张传仓.间接原位PCR方法检测组织中轮状病毒.临床与实验病理学杂志 2001;17:82-83
6 欧巧群,李宁,姚英民.轮状病毒致肝功能损害以及与病毒血症的初步研究.世界华人消化杂志 2001;9:476-477
, 百拇医药
7 周最明,梁巧明,杜江,吴秒玲.轮状病毒腹泻患儿病毒血症研究. 中国人兽共患病杂志 2000;1:31-32
8 李旭,赵源.轮状病毒肠炎并血小板减少性紫癜一例.中华儿科杂志1999;12:773
9 徐景野,王仁元,许国章.侵袭性大肠杆菌试验研究 中国卫生检验杂志 2000;4:507-509
10 Al Hasani K, Adler B, Rajakumar K, Sakellaris H. Distribituon and structural variation of the pathogenicity island
in enteric bacterial pathogens. J Med Microbiol 2002;50:780-786
11 许家璋,鞠九龙,杨志国等.庚型肝炎病毒感染中国恒河猴血清学和肝组织学的动态学观察.中华实验和临床病毒
学杂志1999;13:71-73, 百拇医药(肠道轮状病毒混合感染与其肠道外扩散的关系 欧巧群,姚英民,李 宁)
