DPC4蛋白在不同病理分期的结肠肿瘤中的表达
唐朝晖,邹声泉,华中科技大学同济医学院附属同济医院普外科湖北省武汉市 430030
杨想平,Rheinisch-Westfalische Technische Hochschule生化系
德国亚琛 D-52074
陈启奇,依阿华州立大学病理系 美国依阿华 IA 52242
项目负责人:唐朝晖,430030, 湖北省武汉市解放大道1195号,华中科技大学同济医学院附属同济医院普外科. tangzh45@21cn.com
, http://www.100md.com
电话:027-83663410
收稿日期:2002-01-24 接受日期:2002-02-20
摘要
目的:探讨DPC4基因的突变是否仅仅发生在结肠癌变过程的晚期.
方法:我们通过免疫组织化学法检测了102例经石蜡包埋固定的结肠肿瘤标本，所有标本被分为5期:Ⅰ期(腺瘤，36例);Ⅱ期 (黏膜下癌，8例);Ⅲ期(不伴淋巴结转移的浸润性癌，11例)，Ⅳ期(伴淋巴结转移的浸润性癌，25例);Ⅴ期(伴远处器官、组织转移的浸润性癌，22例).
结果:DPC4蛋白缺失表达率在结肠腺瘤为5.5% (2/36)，在结肠癌中为27% (18/66)，其中在结肠癌Ⅱ期中为12.5% (1/8); 在Ⅲ期中为9% (1/11); 在Ⅳ期中为36% (9/25); 在Ⅴ期中为32% (7/22). 结肠癌和结肠腺瘤的DPC4蛋白缺失表达率相比差异有极显著性(P<0.01).Ⅱ期和Ⅲ期结肠癌的DPC4蛋白缺失率与Ⅳ期和Ⅴ期相比差异有极显著性(P <0.01).
, 百拇医药
结论:DPC4蛋白缺失表达率随着结肠癌的进展而增加，DPC4基因的突变发生在结肠组织癌变过程的晚期.如果结肠组织标本中存在DPC4基因突变，意味该组织可能已恶性变.这将有助于增加对结肠癌的预见性.
唐朝晖,邹声泉, 杨想平,陈启奇. DPC4蛋白在不同病理分期的结肠肿瘤中的表达.世界华人消化杂志 2003;11(10):1645-1646
0 引言结肠癌的发生、发展经过了一个多步骤、多阶段的过程，此过程主要与体内大量的癌基因激活和/或抑癌基因失活的积聚密切相关.最近，一种新的定位于18q21.1位置的抑癌基因DPC4/SMAD4被发现，其在一种与结肠癌癌变过程密切相关的机制-TGF-b信号传导途径中居于中心地位[2].在本试验中我们通过免疫组化的方法观察了处于不同病理学分期的结肠肿瘤中DPC4蛋白的表达情况，旨在探讨该基因的表达与结肠肿瘤生物学的关系及在结肠癌诊断中的意义.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 收集我院1999-05/2001-04102例术后或结肠镜检后经石蜡包埋用于常规病理学检查的结肠肿瘤标本，分5期:I期(腺瘤，36例);II期(黏膜下癌，8例);III期 (不伴淋巴结转移的浸润性癌，11例)，IV期(伴淋巴结转移的浸润性癌，25例);V期(伴远处器官、组织转移的浸润性癌，22例)，其中18例转移至肝脏，3例转移至肺，1例转移至骨.所有病例术前均未行放、化疗.
1.2 方法 5 mm石蜡切片脱蜡至水;微波处理，加DPC4单抗(cloneB8，Santa Cruz公司产品，1:100稀释)，4°C过夜; 生物素化羊抗小鼠IgG(1:200)，30min; ABC试剂(1:100)，6min. DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片.PBS缓冲液作为阴性对照.结果判断: 肿瘤组织中大多数细胞胞质中的强而均一的表达和胞核中灶状表达为阳性;细胞胞质中的弱的表达和胞核中无表达为弱阳性;细胞胞质中和胞核中均无表达为阴性;在后续的分析中阳性和弱阳性加在一起作为阳性与阴性对比.
, 百拇医药
统计学处理 各期结肠肿瘤中DPC4蛋白表达的差异性经x2检验，P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异有极显著性.
2 结果
2.1 免疫组织化学染色 正常的结肠组织，淋巴结，基底层纤维母细胞均有中到重度的DPC4蛋白表达.结肠腺瘤和III期结肠癌显示中度的DPC4表达.部分结肠癌细胞(V期)的胞质和胞核缺失DPC4蛋白的表达，而其周边正常细胞则呈灶状的DPC4表达.
2.2 DPC4蛋白缺失表达率和肿瘤分期 结肠腺瘤中有2例(5.5%，2/36)，而结肠癌中有18例标本(27%，18/66)DPC4蛋白表达阴性.二者的DPC4蛋白缺失表达率相比差异有极显著性(P<0.01). DPC4蛋白缺失表达率随着结肠癌的进展而增加.在结肠癌II期中DPC4蛋白缺失率为12.5% (1/8); 在III期中为9% (1/11); 在IV期中为36% (9/25); 在V期中为32% (7/22). II期和III期结肠癌的DPC4蛋白缺失率与IV期和V期相比差异有极显著性(P<0.01).
, http://www.100md.com
3 讨论结肠癌是一种基因疾病，多种癌基因及抑癌基因与其肿瘤生物学过程有关.包括: p53、DCC的失活;k-ras的突变;c-met、c-ErbB-2的扩增以及微卫星不稳定性等[3-9].DPC4基因定位于染色体18q21.1，最初是在胰腺癌中，随后在结肠癌和胆管癌中相继发现其失活.DPC4基因编码的DPC4蛋白是转化生长因子b(TGF-b)超家族信号传导途径的成员，参与细胞内信号传导.且DPC4在TGF-b信号传导途径中居于中心地位[10-12].
在本研究中，DPC4蛋白表达缺失率在I期中是5.5% (2/36)，在II期中是12.5% (1/8)，在III期中是9% (1/11)，在IV期中是36% (9/25)，在VI期中是32% (7/22)，缺失率随着肿瘤的进展而增加.显然，DPC4基因的突变发生在结肠组织癌变过程的晚期.在胰腺癌中也观察到了这种相似的现象[13-15].这种现象对肿瘤生物学的研究有着重要的意义，因为其再次证明生物学特性的重大改变总是和特定基因的改变强烈的联系在一起.
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在基因水平检测DPC4的突变是比较困难的，因为需要将肿瘤组织显微切割后以获比较纯的肿瘤样本而后分析，故基因水平的检测费时、费力、过程复杂、费用较高.Wilentzet al [16, 17] (2 000)的研究表明DPC4蛋白的免疫组化分析是一种检测DPC4基因改变的特异、敏感的方法.且与基因分析相比还具有以下优点:其允许将基因的改变和组织病理分类直接联系起来;其费用较为经济，操作简便，可检测大量标本;可检测石蜡包埋固定的已存档的病理标本.
4 参考文献1 张振书,张亚历. 中国大肠癌研究进展.世界华人消化杂志 2001; 9:489-494
2 Hahn SA, SchutteM, Hoque AT. DPC4, a candidate tumor suppressor gene at human chromosome18q21.1[J].
, 百拇医药
Science 1996;271:350-353
3 范应方,黄宗海. 结直肠癌基因治疗研究进展.世界华人消化杂志 2001;9:427-430
4 邱健, 姜馨,何文宪. CDKIp27Kip1及其在结(直)肠肿瘤中的研究.世界华人消化杂志 2001;9:209-211
5 李铭, 王灏,郁宝铭, 郑民华.p53基因突变和肿瘤标志物对大肠癌患者预后的影响.世界华人消化杂志 1999;7:425-426
6 乔庆, 吴金生,张静, 马庆久,赖大年. 凋亡相关基因bcl-2,bax在人类大肠腺癌中的表达意义.世界华人消化杂志
1999;7:936-938
7 王青, 吴金生,高德明, 赖大年,马庆久. EGF受体和转化生长因子amRNA在人大肠癌组织的表达意义.世界华人消化杂志
, 百拇医药
1999;7:590-592
8 赖大年,解远峰, 卞玲,要秀. 结肠癌细胞株p16基因甲基化的研究.世界华人消化杂志 1999;7:676-678
9 陈健, 顾红光,林武华, 罗元辉.散发性结直肠癌46例微卫星不稳定性的研究.世界华人消化杂志 2000;8:350-352
10 Wang D, Kanuma T, Mizunuma H, Takama F, Ibuki Y, Wake N, Mogi A,Shitara Y, Takenoshita S. Analysis of specific
gene mutations in the transforming growthfactor-beta signal transduction pathway in human ovarian cancer.Cancer
, 百拇医药
Res 2000;60:4507-4512
11 Venkatasubbarao K, Ahmed MM, Mohiuddin M, Swiderski C, Lee E, GowerWR Jr, Salhab KF, McGrath P, Strodel
W, Freeman JW. Differential expression oftransforming growth factor beta receptors in human pancreatic
adenocarcinoma. Anticancer Res 2000;20:43-51
12 Calonge MJ, Massague J. Smad4/DPC4 silencing and hyperactive Rasjointly disrupt transforming growth factor-beta
, 百拇医药
antiproliferative responses in colon cancercells. J Biol Chem 1999;274:33637-33643
13 Peng B, Fleming JB, Breslin T, Grau AM, Fojioka S, Abbruzzese JL,Evans DB, Ayers D, Wathen K, Wu T, Robertson
KD, Chiao PJ. Suppression of tumorigenesisand induction of p15(ink4b) by Smad4/DPC4 in human pancreatic cancer
cells. Clin Cancer Res 2002;8:3628-3638
14 Chen WB, Lenschow W, Tiede K, Fischer JW, Kalthoff H, Ungefroren H.Smad4/DPC4-dependent regulation of biglycan
, 百拇医药
gene expression by transforming growthfactor-beta in pancreatic tumor cells. J Biol Chem 2002;277:36118-36128
15 Cullingworth J, Hooper ML, Harrison DJ, Mason JO, Sirard C, PatekCE, Clarke AR. Carcinogen-induced pancreatic lesions
in the mouse: effect of Smad4 and Apcgenotypes. Oncogene 2002;21:4696-4701
16 Wilentz RE, Iacobuzio-Donahue CA, Argani P, McCarthy DM, Parsons JL,Yeo CJ, Kern SE, Hruban RH. Loss of expression
, 百拇医药
of Dpc4 in pancreatic intraepithelialneoplasia: evidence that DPC4 inactivation occurs late in neoplasticprogression.
Cancer Res 2000;60:2002-2006
17 Wilentz RE, Su GH, Dai JL, Sparks AB, Argani P, Sohn TA, Yeo CJ,Kern SE, Hruban RH. Immunohistochemical labeling
for dpc4 mirrors genetic status inpancreatic adenocarcinomas : a new marker of DPC4 inactivation. Am JPathol
2000;156:37-43, http://www.100md.com( 唐朝晖, 邹声泉, 杨想平, 陈启奇)
杨想平,Rheinisch-Westfalische Technische Hochschule生化系
德国亚琛 D-52074
陈启奇,依阿华州立大学病理系 美国依阿华 IA 52242
项目负责人:唐朝晖,430030, 湖北省武汉市解放大道1195号,华中科技大学同济医学院附属同济医院普外科. tangzh45@21cn.com
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电话:027-83663410
收稿日期:2002-01-24 接受日期:2002-02-20
摘要
目的:探讨DPC4基因的突变是否仅仅发生在结肠癌变过程的晚期.
方法:我们通过免疫组织化学法检测了102例经石蜡包埋固定的结肠肿瘤标本，所有标本被分为5期:Ⅰ期(腺瘤，36例);Ⅱ期 (黏膜下癌，8例);Ⅲ期(不伴淋巴结转移的浸润性癌，11例)，Ⅳ期(伴淋巴结转移的浸润性癌，25例);Ⅴ期(伴远处器官、组织转移的浸润性癌，22例).
结果:DPC4蛋白缺失表达率在结肠腺瘤为5.5% (2/36)，在结肠癌中为27% (18/66)，其中在结肠癌Ⅱ期中为12.5% (1/8); 在Ⅲ期中为9% (1/11); 在Ⅳ期中为36% (9/25); 在Ⅴ期中为32% (7/22). 结肠癌和结肠腺瘤的DPC4蛋白缺失表达率相比差异有极显著性(P<0.01).Ⅱ期和Ⅲ期结肠癌的DPC4蛋白缺失率与Ⅳ期和Ⅴ期相比差异有极显著性(P <0.01).
, 百拇医药
结论:DPC4蛋白缺失表达率随着结肠癌的进展而增加，DPC4基因的突变发生在结肠组织癌变过程的晚期.如果结肠组织标本中存在DPC4基因突变，意味该组织可能已恶性变.这将有助于增加对结肠癌的预见性.
唐朝晖,邹声泉, 杨想平,陈启奇. DPC4蛋白在不同病理分期的结肠肿瘤中的表达.世界华人消化杂志 2003;11(10):1645-1646
0 引言结肠癌的发生、发展经过了一个多步骤、多阶段的过程，此过程主要与体内大量的癌基因激活和/或抑癌基因失活的积聚密切相关.最近，一种新的定位于18q21.1位置的抑癌基因DPC4/SMAD4被发现，其在一种与结肠癌癌变过程密切相关的机制-TGF-b信号传导途径中居于中心地位[2].在本试验中我们通过免疫组化的方法观察了处于不同病理学分期的结肠肿瘤中DPC4蛋白的表达情况，旨在探讨该基因的表达与结肠肿瘤生物学的关系及在结肠癌诊断中的意义.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 收集我院1999-05/2001-04102例术后或结肠镜检后经石蜡包埋用于常规病理学检查的结肠肿瘤标本，分5期:I期(腺瘤，36例);II期(黏膜下癌，8例);III期 (不伴淋巴结转移的浸润性癌，11例)，IV期(伴淋巴结转移的浸润性癌，25例);V期(伴远处器官、组织转移的浸润性癌，22例)，其中18例转移至肝脏，3例转移至肺，1例转移至骨.所有病例术前均未行放、化疗.
1.2 方法 5 mm石蜡切片脱蜡至水;微波处理，加DPC4单抗(cloneB8，Santa Cruz公司产品，1:100稀释)，4°C过夜; 生物素化羊抗小鼠IgG(1:200)，30min; ABC试剂(1:100)，6min. DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片.PBS缓冲液作为阴性对照.结果判断: 肿瘤组织中大多数细胞胞质中的强而均一的表达和胞核中灶状表达为阳性;细胞胞质中的弱的表达和胞核中无表达为弱阳性;细胞胞质中和胞核中均无表达为阴性;在后续的分析中阳性和弱阳性加在一起作为阳性与阴性对比.
, 百拇医药
统计学处理 各期结肠肿瘤中DPC4蛋白表达的差异性经x2检验，P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异有极显著性.
2 结果
2.1 免疫组织化学染色 正常的结肠组织，淋巴结，基底层纤维母细胞均有中到重度的DPC4蛋白表达.结肠腺瘤和III期结肠癌显示中度的DPC4表达.部分结肠癌细胞(V期)的胞质和胞核缺失DPC4蛋白的表达，而其周边正常细胞则呈灶状的DPC4表达.
2.2 DPC4蛋白缺失表达率和肿瘤分期 结肠腺瘤中有2例(5.5%，2/36)，而结肠癌中有18例标本(27%，18/66)DPC4蛋白表达阴性.二者的DPC4蛋白缺失表达率相比差异有极显著性(P<0.01). DPC4蛋白缺失表达率随着结肠癌的进展而增加.在结肠癌II期中DPC4蛋白缺失率为12.5% (1/8); 在III期中为9% (1/11); 在IV期中为36% (9/25); 在V期中为32% (7/22). II期和III期结肠癌的DPC4蛋白缺失率与IV期和V期相比差异有极显著性(P<0.01).
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3 讨论结肠癌是一种基因疾病，多种癌基因及抑癌基因与其肿瘤生物学过程有关.包括: p53、DCC的失活;k-ras的突变;c-met、c-ErbB-2的扩增以及微卫星不稳定性等[3-9].DPC4基因定位于染色体18q21.1，最初是在胰腺癌中，随后在结肠癌和胆管癌中相继发现其失活.DPC4基因编码的DPC4蛋白是转化生长因子b(TGF-b)超家族信号传导途径的成员，参与细胞内信号传导.且DPC4在TGF-b信号传导途径中居于中心地位[10-12].
在本研究中，DPC4蛋白表达缺失率在I期中是5.5% (2/36)，在II期中是12.5% (1/8)，在III期中是9% (1/11)，在IV期中是36% (9/25)，在VI期中是32% (7/22)，缺失率随着肿瘤的进展而增加.显然，DPC4基因的突变发生在结肠组织癌变过程的晚期.在胰腺癌中也观察到了这种相似的现象[13-15].这种现象对肿瘤生物学的研究有着重要的意义，因为其再次证明生物学特性的重大改变总是和特定基因的改变强烈的联系在一起.
, http://www.100md.com
在基因水平检测DPC4的突变是比较困难的，因为需要将肿瘤组织显微切割后以获比较纯的肿瘤样本而后分析，故基因水平的检测费时、费力、过程复杂、费用较高.Wilentzet al [16, 17] (2 000)的研究表明DPC4蛋白的免疫组化分析是一种检测DPC4基因改变的特异、敏感的方法.且与基因分析相比还具有以下优点:其允许将基因的改变和组织病理分类直接联系起来;其费用较为经济，操作简便，可检测大量标本;可检测石蜡包埋固定的已存档的病理标本.
4 参考文献1 张振书,张亚历. 中国大肠癌研究进展.世界华人消化杂志 2001; 9:489-494
2 Hahn SA, SchutteM, Hoque AT. DPC4, a candidate tumor suppressor gene at human chromosome18q21.1[J].
, 百拇医药
Science 1996;271:350-353
3 范应方,黄宗海. 结直肠癌基因治疗研究进展.世界华人消化杂志 2001;9:427-430
4 邱健, 姜馨,何文宪. CDKIp27Kip1及其在结(直)肠肿瘤中的研究.世界华人消化杂志 2001;9:209-211
5 李铭, 王灏,郁宝铭, 郑民华.p53基因突变和肿瘤标志物对大肠癌患者预后的影响.世界华人消化杂志 1999;7:425-426
6 乔庆, 吴金生,张静, 马庆久,赖大年. 凋亡相关基因bcl-2,bax在人类大肠腺癌中的表达意义.世界华人消化杂志
1999;7:936-938
7 王青, 吴金生,高德明, 赖大年,马庆久. EGF受体和转化生长因子amRNA在人大肠癌组织的表达意义.世界华人消化杂志
, 百拇医药
1999;7:590-592
8 赖大年,解远峰, 卞玲,要秀. 结肠癌细胞株p16基因甲基化的研究.世界华人消化杂志 1999;7:676-678
9 陈健, 顾红光,林武华, 罗元辉.散发性结直肠癌46例微卫星不稳定性的研究.世界华人消化杂志 2000;8:350-352
10 Wang D, Kanuma T, Mizunuma H, Takama F, Ibuki Y, Wake N, Mogi A,Shitara Y, Takenoshita S. Analysis of specific
gene mutations in the transforming growthfactor-beta signal transduction pathway in human ovarian cancer.Cancer
, 百拇医药
Res 2000;60:4507-4512
11 Venkatasubbarao K, Ahmed MM, Mohiuddin M, Swiderski C, Lee E, GowerWR Jr, Salhab KF, McGrath P, Strodel
W, Freeman JW. Differential expression oftransforming growth factor beta receptors in human pancreatic
adenocarcinoma. Anticancer Res 2000;20:43-51
12 Calonge MJ, Massague J. Smad4/DPC4 silencing and hyperactive Rasjointly disrupt transforming growth factor-beta
, 百拇医药
antiproliferative responses in colon cancercells. J Biol Chem 1999;274:33637-33643
13 Peng B, Fleming JB, Breslin T, Grau AM, Fojioka S, Abbruzzese JL,Evans DB, Ayers D, Wathen K, Wu T, Robertson
KD, Chiao PJ. Suppression of tumorigenesisand induction of p15(ink4b) by Smad4/DPC4 in human pancreatic cancer
cells. Clin Cancer Res 2002;8:3628-3638
14 Chen WB, Lenschow W, Tiede K, Fischer JW, Kalthoff H, Ungefroren H.Smad4/DPC4-dependent regulation of biglycan
, 百拇医药
gene expression by transforming growthfactor-beta in pancreatic tumor cells. J Biol Chem 2002;277:36118-36128
15 Cullingworth J, Hooper ML, Harrison DJ, Mason JO, Sirard C, PatekCE, Clarke AR. Carcinogen-induced pancreatic lesions
in the mouse: effect of Smad4 and Apcgenotypes. Oncogene 2002;21:4696-4701
16 Wilentz RE, Iacobuzio-Donahue CA, Argani P, McCarthy DM, Parsons JL,Yeo CJ, Kern SE, Hruban RH. Loss of expression
, 百拇医药
of Dpc4 in pancreatic intraepithelialneoplasia: evidence that DPC4 inactivation occurs late in neoplasticprogression.
Cancer Res 2000;60:2002-2006
17 Wilentz RE, Su GH, Dai JL, Sparks AB, Argani P, Sohn TA, Yeo CJ,Kern SE, Hruban RH. Immunohistochemical labeling
for dpc4 mirrors genetic status inpancreatic adenocarcinomas : a new marker of DPC4 inactivation. Am JPathol
2000;156:37-43, http://www.100md.com( 唐朝晖, 邹声泉, 杨想平, 陈启奇)
