5-FU和抗Fas单抗联合治疗结肠癌的体外实验研究
朱强,刘吉勇, 许洪伟,徐麟, 傅丽娜,山东省立医院消化内科山东省济南市 250021
项目负责人:朱强, 250021, 山东省济南市经5纬7路324号,山东省立医院消化内科. tedqiangzhu@21cn.com
电话:0531-7938911-2355 传真:0531-7904002
收稿日期:2003-06-17 接受日期:2003-10-12
摘要
目的:探讨5-氟尿嘧啶(5-FU)和抗Fas单抗联合治疗结肠癌的效果及其机制.
, 百拇医药
方法:分10 mg/mL5-FU、抗Fas单抗(CH11)1mg/mL、5mg/mL5-FU+0.5 mg/mL抗Fas单抗及空白对照四组，与SW480细胞共培养.MTT法检测SW480细胞的存活率，TUNEL法检测SW480细胞的凋亡率.免疫细胞化学法检测5-FU和抗Fas单抗处理前后，SW480细胞中Bcl-2的变化.
结果:10 mg/mL5-FU、1 mg/mL抗Fas单抗、5mg/mL5-FU+0.5 mg/mL抗Fas单抗均可抑制细胞生长，且均可诱导细胞凋亡，联合作用组诱导效果最明显，其次是5-FU组，抗Fas单抗组诱导效果较差.抗Fas单抗、5-FU均可降低SW480细胞Bcl-2的表达，5-FU与抗Fas单抗对SW480细胞Bcl-2蛋白的表达有协同抑制作用.
结论:5-FU和抗Fas单抗对结肠癌细胞具有协同的增生抑制和诱导凋亡作用，其机制可能是协同抑制Bcl-2蛋白的表达.
, http://www.100md.com
朱强,刘吉勇, 许洪伟,徐麟, 傅丽娜.5-FU和抗Fas单抗联合治疗结肠癌的体外实验研究.世界华人消化杂志 2004;12(2):469-471
0 引言免疫治疗是抗肿瘤治疗的一个重要方面，药物治疗和免疫治疗相结合是抗肿瘤治疗的一个重要研究方向.Fas系统在结肠癌的肿瘤免疫中具有重要作用[1]，针对Fas系统的免疫治疗可能有一定效果.本实验旨在观察治疗结肠癌的首选药物5-氟尿嘧啶(5-FU)和抗Fas单抗对结肠癌细胞株SW480的联合作用及其作用机制.
1 材料和方法
1.1 材料 抗Fas单抗(CH11)购自深圳晶美生物工程有限公司，细胞凋亡原位检测试剂盒为德国BoehringerMannheim公司产品.
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 5-FU和抗Fas单抗联合处理结肠癌细胞 将对数生长期的SW480细胞按1×105/mL接种于96孔培养板，24h后分为10 mg/mL5-FU组、1 mg/mL抗Fas单抗(CH11)组、5mg/mL5-FU+0.5mg/mL抗Fas单抗组及空白对照四组，与SW480细胞共培养.
1.2.2 MTT法检测细胞的增生活性 四组细胞共培养0、24、48、72、96h后，做MTT染色.以每毫升活细胞数为纵坐标，培养时间为横坐标，描绘SW480细胞生长曲线.
1.2.3 TUNEL法检测细胞的凋亡率 将细胞以2×105/mL的密度接种在含小盖玻片的24孔培养板中，24h后分四组，药物与细胞共培养，作用0、24、48、72、96h，取出盖玻片，PBS冲洗3次，用40mL/L多聚甲醛溶液(溶于pH7.4的PBS中)，室温固定30min，TUNEL染色，检测细胞的凋亡率.计数1 000个细胞，TUNEL阳性细胞与总细胞数的比值即为SW480细胞的凋亡率.
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1.2.4 免疫细胞化学法检测处理前后细胞中Bcl-2的变化 将细胞以2×105/mL的密度接种在含小盖玻片的24孔培养板中，24h后分四组药物与细胞共培养72h后，取出盖玻片，PBS冲洗3次，用950mL/L酒精固定20min，免疫细胞化学法检测处理前后细胞中Bcl-2的变化，免疫化学过程参照S-P试剂盒操作说明书.
统计学处理 两个样本均数的比较采用t检验，多个样本均数的比较采用单因素方差分析(F-q检验)，显著性水准a为0.05.
2 结果
2.1三种方法处理后SW480细胞的存活率 10 mg/mL5-FU、1 mg/mL抗Fas单抗、5mg/mL5-FU+0.5 mg/mL抗Fas单抗均可抑制细胞生长，联合作用组抑制效果最明显，其次是5-FU组，抗Fas单抗组抑制效果较差(图1).
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图1(PDF)三种方法处理后SW480细胞的存活率.1: 对照组; 2:抗Fas单抗组;3: 5-FU组; 4: 联合组.
2.2三种方法处理后SW480细胞的凋亡率 10 mg/mL5-FU、1 mg/mL抗Fas单抗、5mg/mL5-FU+0.5 mg/mL抗Fas单抗均可诱导细胞凋亡.在48 h时，5-FU组、抗Fas单抗组、联合组的凋亡率，与空白对照组相比均有统计学差异(P<0.05); 在72h时，联合组的凋亡率、5-FU组和抗Fas单抗组两两相比，均有统计学差异(P<0.05)，联合作用组诱导效果最明显，其次是5-FU组，抗Fas单抗组诱导效果较差(图2).
图2(PDF)三种方法处理后SW480细胞的凋亡率.1: 对照组; 2:抗Fas单抗组;3: 5-FU组; 4: 联合组.
图3 5-FU或抗Fas单抗处理前SW480细胞Bcl-2表达水平(×100).
, 百拇医药
图4 经5-FU或抗Fas单抗处理后SW480细胞Bcl-2表达降低(×100).
2.3药物处理后细胞中Bcl-2的变化 与细胞共培养72h后，抗Fas单抗组、5-FU组和抗Fas单抗+5-FU联合组中，SW480细胞Bcl-2阳性细胞率与空白对照组相比均有统计学差异(P<0.05); 抗Fas单抗组、5-FU组和联合组两两相比，均有统计学差异(P<0.05)，抑制SW480细胞Bcl-2表达的强度由高到低依次是联合组、5-FU组、Fas单抗组.以上结果表明，抗Fas单抗、5-FU均可抑制SW480细胞Bcl-2的表达，5-FU与抗Fas单抗对SW480细胞Bcl-2的表达有协同抑制作用.10 mg/mL5-FU比1 mg/mL抗Fas单抗对SW480细胞Bcl-2表达的抑制作用强(表1)(图3，4).
表1 药物处理后SW480细胞中Bcl-2的变化
, http://www.100md.com
3 讨论Fas系统包括Fas及其配体FasL.Fas系统在结肠癌的发生、发展过程中起着重要的作用，结肠癌细胞可减少其细胞表面Fas表达，逃逸机体免疫系统的监视，避免免疫系统的杀伤;结肠癌细胞还可增加其细胞表面FasL表达，反击机体免疫系统，诱导淋巴细胞凋亡[1].针对结肠癌Fas系统的药物治疗和免疫治疗可能在一定程度上能够治疗结肠癌.
本实验证实，10mg/mL5-FU、1 mg/mL抗Fas单抗、5mg/mL5-FU+0.5 mg/mL抗Fas单抗均可诱导SW480细胞凋亡.1 mg/mL抗Fas单抗与其他两组相比作用较弱，这是因为抗Fas单抗通过与SW480细胞上的Fas相结合，从而诱导细胞发生凋亡.但结肠癌细胞SW480一方面Fas表达较少[2]，另一方面SW480细胞中存在着Fas信号传导障碍[3]，因此单独应用抗Fas抗体诱导肿瘤细胞凋亡效果是有限的.
, http://www.100md.com
在临床上治疗结肠癌时，大剂量5-FU可出现骨髓抑制、胃肠道反应等副作用.本实验将小剂量5-FU和抗Fas单抗联合处理结肠癌细胞SW480发现，尽管5-FU和抗Fas单抗的剂量均减半，但比单独应用5-FU和抗Fas单抗诱导SW480细胞凋亡的作用增强，药物处理后的肿瘤细胞对抗Fas单抗诱导凋亡的敏感性增加.5-FU和抗Fas单抗对诱导SW480凋亡有协同作用，可以降低5-FU的用量，减少副反应的发生.
Fas途径调节细胞凋亡过程与Bcl-2的表达存在某种程度的耦联，Bcl-2的表达可以部分地阻断Fas介导的凋亡[4-5].本实验结果表明，5-FU和抗Fas单抗对SW480细胞Bcl-2蛋白的表达有协同抑制作用，可以降低Bcl-2的表达率，增强Fas信号传导.5-FU还可以诱导SW480细胞表达Fas增加[1]，这也可以解释在诱导SW480细胞凋亡时，5-FU比抗Fas单抗作用明显.
4 参考文献1 Bennett MW, O'ConnellJ, Houston A, Kelly J, O'CullivanGC, Collins JK, Shanahan F. Fas ligand upregulation is an early
, http://www.100md.com
event in colonic carcinogenesis. J ClinPathol 2001;54:598-604
2 朱强,邓长生. 5-氟尿嘧啶对结肠腺癌细胞Fas、FasL表达的影响.中华消化杂志 2002;22:188
3 Lee SH, Shin MS, Lee HS, Bae JH, Lee HK, Kim HS, Kim SY, Jang JJ,Joo M, Kang YK, Park WS, Park JY, Oh RR, Han SY,Lee JH, Kim SH, Lee JY, Yoo NJ. Expressionof Fas and Fas-related molecules in human hepatocellular carcinoma. Hum
Pathol 2001;32:250-256
, 百拇医药
4 Luo X, Budihardjo I, Zou H, Slaughter C, Wang X. Bid, a Bcl-2interacting protein, mediated cytochrome c release from
mitochondria in response to activation ofcell surface death receptors. Cell 1998;94:481-490
5 Vollmers HP, Dammrich J, Hensel F, Ribbert H, Meyer-Bahlburg A,Ufken-Gaul T, von Korff M, Muller-Hermelink HK.
Differential expression of apoptosisreceptors on diffuse and intestinal type stomach carcinoma. Cancer
1997;79:433-440, http://www.100md.com( 朱 强, 刘吉勇, 许洪伟, 徐 麟, 傅丽娜)
项目负责人:朱强, 250021, 山东省济南市经5纬7路324号,山东省立医院消化内科. tedqiangzhu@21cn.com
电话:0531-7938911-2355 传真:0531-7904002
收稿日期:2003-06-17 接受日期:2003-10-12
摘要
目的:探讨5-氟尿嘧啶(5-FU)和抗Fas单抗联合治疗结肠癌的效果及其机制.
, 百拇医药
方法:分10 mg/mL5-FU、抗Fas单抗(CH11)1mg/mL、5mg/mL5-FU+0.5 mg/mL抗Fas单抗及空白对照四组，与SW480细胞共培养.MTT法检测SW480细胞的存活率，TUNEL法检测SW480细胞的凋亡率.免疫细胞化学法检测5-FU和抗Fas单抗处理前后，SW480细胞中Bcl-2的变化.
结果:10 mg/mL5-FU、1 mg/mL抗Fas单抗、5mg/mL5-FU+0.5 mg/mL抗Fas单抗均可抑制细胞生长，且均可诱导细胞凋亡，联合作用组诱导效果最明显，其次是5-FU组，抗Fas单抗组诱导效果较差.抗Fas单抗、5-FU均可降低SW480细胞Bcl-2的表达，5-FU与抗Fas单抗对SW480细胞Bcl-2蛋白的表达有协同抑制作用.
结论:5-FU和抗Fas单抗对结肠癌细胞具有协同的增生抑制和诱导凋亡作用，其机制可能是协同抑制Bcl-2蛋白的表达.
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朱强,刘吉勇, 许洪伟,徐麟, 傅丽娜.5-FU和抗Fas单抗联合治疗结肠癌的体外实验研究.世界华人消化杂志 2004;12(2):469-471
0 引言免疫治疗是抗肿瘤治疗的一个重要方面，药物治疗和免疫治疗相结合是抗肿瘤治疗的一个重要研究方向.Fas系统在结肠癌的肿瘤免疫中具有重要作用[1]，针对Fas系统的免疫治疗可能有一定效果.本实验旨在观察治疗结肠癌的首选药物5-氟尿嘧啶(5-FU)和抗Fas单抗对结肠癌细胞株SW480的联合作用及其作用机制.
1 材料和方法
1.1 材料 抗Fas单抗(CH11)购自深圳晶美生物工程有限公司，细胞凋亡原位检测试剂盒为德国BoehringerMannheim公司产品.
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 5-FU和抗Fas单抗联合处理结肠癌细胞 将对数生长期的SW480细胞按1×105/mL接种于96孔培养板，24h后分为10 mg/mL5-FU组、1 mg/mL抗Fas单抗(CH11)组、5mg/mL5-FU+0.5mg/mL抗Fas单抗组及空白对照四组，与SW480细胞共培养.
1.2.2 MTT法检测细胞的增生活性 四组细胞共培养0、24、48、72、96h后，做MTT染色.以每毫升活细胞数为纵坐标，培养时间为横坐标，描绘SW480细胞生长曲线.
1.2.3 TUNEL法检测细胞的凋亡率 将细胞以2×105/mL的密度接种在含小盖玻片的24孔培养板中，24h后分四组，药物与细胞共培养，作用0、24、48、72、96h，取出盖玻片，PBS冲洗3次，用40mL/L多聚甲醛溶液(溶于pH7.4的PBS中)，室温固定30min，TUNEL染色，检测细胞的凋亡率.计数1 000个细胞，TUNEL阳性细胞与总细胞数的比值即为SW480细胞的凋亡率.
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1.2.4 免疫细胞化学法检测处理前后细胞中Bcl-2的变化 将细胞以2×105/mL的密度接种在含小盖玻片的24孔培养板中，24h后分四组药物与细胞共培养72h后，取出盖玻片，PBS冲洗3次，用950mL/L酒精固定20min，免疫细胞化学法检测处理前后细胞中Bcl-2的变化，免疫化学过程参照S-P试剂盒操作说明书.
统计学处理 两个样本均数的比较采用t检验，多个样本均数的比较采用单因素方差分析(F-q检验)，显著性水准a为0.05.
2 结果
2.1三种方法处理后SW480细胞的存活率 10 mg/mL5-FU、1 mg/mL抗Fas单抗、5mg/mL5-FU+0.5 mg/mL抗Fas单抗均可抑制细胞生长，联合作用组抑制效果最明显，其次是5-FU组，抗Fas单抗组抑制效果较差(图1).
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图1(PDF)三种方法处理后SW480细胞的存活率.1: 对照组; 2:抗Fas单抗组;3: 5-FU组; 4: 联合组.
2.2三种方法处理后SW480细胞的凋亡率 10 mg/mL5-FU、1 mg/mL抗Fas单抗、5mg/mL5-FU+0.5 mg/mL抗Fas单抗均可诱导细胞凋亡.在48 h时，5-FU组、抗Fas单抗组、联合组的凋亡率，与空白对照组相比均有统计学差异(P<0.05); 在72h时，联合组的凋亡率、5-FU组和抗Fas单抗组两两相比，均有统计学差异(P<0.05)，联合作用组诱导效果最明显，其次是5-FU组，抗Fas单抗组诱导效果较差(图2).
图2(PDF)三种方法处理后SW480细胞的凋亡率.1: 对照组; 2:抗Fas单抗组;3: 5-FU组; 4: 联合组.
图3 5-FU或抗Fas单抗处理前SW480细胞Bcl-2表达水平(×100).
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图4 经5-FU或抗Fas单抗处理后SW480细胞Bcl-2表达降低(×100).
2.3药物处理后细胞中Bcl-2的变化 与细胞共培养72h后，抗Fas单抗组、5-FU组和抗Fas单抗+5-FU联合组中，SW480细胞Bcl-2阳性细胞率与空白对照组相比均有统计学差异(P<0.05); 抗Fas单抗组、5-FU组和联合组两两相比，均有统计学差异(P<0.05)，抑制SW480细胞Bcl-2表达的强度由高到低依次是联合组、5-FU组、Fas单抗组.以上结果表明，抗Fas单抗、5-FU均可抑制SW480细胞Bcl-2的表达，5-FU与抗Fas单抗对SW480细胞Bcl-2的表达有协同抑制作用.10 mg/mL5-FU比1 mg/mL抗Fas单抗对SW480细胞Bcl-2表达的抑制作用强(表1)(图3，4).
表1 药物处理后SW480细胞中Bcl-2的变化
| 分组 | Bcl-2阳性细胞率(% mean±SD) |
| 空白对照组 | 81.2±2.74 |
| 抗Fas单抗组 | 65.3±2.68 |
| 5-FU组 | 59.5±3.08 |
| 联合组 | 43.9±1.97 |
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3 讨论Fas系统包括Fas及其配体FasL.Fas系统在结肠癌的发生、发展过程中起着重要的作用，结肠癌细胞可减少其细胞表面Fas表达，逃逸机体免疫系统的监视，避免免疫系统的杀伤;结肠癌细胞还可增加其细胞表面FasL表达，反击机体免疫系统，诱导淋巴细胞凋亡[1].针对结肠癌Fas系统的药物治疗和免疫治疗可能在一定程度上能够治疗结肠癌.
本实验证实，10mg/mL5-FU、1 mg/mL抗Fas单抗、5mg/mL5-FU+0.5 mg/mL抗Fas单抗均可诱导SW480细胞凋亡.1 mg/mL抗Fas单抗与其他两组相比作用较弱，这是因为抗Fas单抗通过与SW480细胞上的Fas相结合，从而诱导细胞发生凋亡.但结肠癌细胞SW480一方面Fas表达较少[2]，另一方面SW480细胞中存在着Fas信号传导障碍[3]，因此单独应用抗Fas抗体诱导肿瘤细胞凋亡效果是有限的.
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在临床上治疗结肠癌时，大剂量5-FU可出现骨髓抑制、胃肠道反应等副作用.本实验将小剂量5-FU和抗Fas单抗联合处理结肠癌细胞SW480发现，尽管5-FU和抗Fas单抗的剂量均减半，但比单独应用5-FU和抗Fas单抗诱导SW480细胞凋亡的作用增强，药物处理后的肿瘤细胞对抗Fas单抗诱导凋亡的敏感性增加.5-FU和抗Fas单抗对诱导SW480凋亡有协同作用，可以降低5-FU的用量，减少副反应的发生.
Fas途径调节细胞凋亡过程与Bcl-2的表达存在某种程度的耦联，Bcl-2的表达可以部分地阻断Fas介导的凋亡[4-5].本实验结果表明，5-FU和抗Fas单抗对SW480细胞Bcl-2蛋白的表达有协同抑制作用，可以降低Bcl-2的表达率，增强Fas信号传导.5-FU还可以诱导SW480细胞表达Fas增加[1]，这也可以解释在诱导SW480细胞凋亡时，5-FU比抗Fas单抗作用明显.
4 参考文献1 Bennett MW, O'ConnellJ, Houston A, Kelly J, O'CullivanGC, Collins JK, Shanahan F. Fas ligand upregulation is an early
, http://www.100md.com
event in colonic carcinogenesis. J ClinPathol 2001;54:598-604
2 朱强,邓长生. 5-氟尿嘧啶对结肠腺癌细胞Fas、FasL表达的影响.中华消化杂志 2002;22:188
3 Lee SH, Shin MS, Lee HS, Bae JH, Lee HK, Kim HS, Kim SY, Jang JJ,Joo M, Kang YK, Park WS, Park JY, Oh RR, Han SY,Lee JH, Kim SH, Lee JY, Yoo NJ. Expressionof Fas and Fas-related molecules in human hepatocellular carcinoma. Hum
Pathol 2001;32:250-256
, 百拇医药
4 Luo X, Budihardjo I, Zou H, Slaughter C, Wang X. Bid, a Bcl-2interacting protein, mediated cytochrome c release from
mitochondria in response to activation ofcell surface death receptors. Cell 1998;94:481-490
5 Vollmers HP, Dammrich J, Hensel F, Ribbert H, Meyer-Bahlburg A,Ufken-Gaul T, von Korff M, Muller-Hermelink HK.
Differential expression of apoptosisreceptors on diffuse and intestinal type stomach carcinoma. Cancer
1997;79:433-440, http://www.100md.com( 朱 强, 刘吉勇, 许洪伟, 徐 麟, 傅丽娜)
