慢性乙肝与HBV阳性肝癌患者树突状细胞表型和功能检测
王健,苏安英, 柴锡庆,门金娥, 田珂,张向阳, 郑海萍,河北工程学院教务处 河北省邯郸市 056038
河北省科技研究与发展计划项目资助,No. 00276168D
项目负责人:王健, 056038, 河北省邯郸市,河北工程学院教务处.
收稿日期:2004-08-23 接受日期:2004-09-24
摘要
目的:探讨慢性HBV感染者与HBV阳性肝癌患者DC的表型和功能及其与免疫耐受的关系.
, http://www.100md.com
方法:选择慢性HBV感染者25例、HBV阳性肝癌患者11例及正常人15名，从外周血中分离单个核细胞，用细胞贴壁法富集DC，流式细胞术测定DCHLAⅡ和共刺激分子的表达，同位素掺入法测定DC的抗原提呈能力，ELISA方法测定抗原提呈过程中Th1和Th2类细胞因子的水平.
结果:慢性HBV感染者与HBV阳性肝癌患者HLAⅡ和共刺激分子的表达水平、抗原提呈能力和Th1类细胞因子的水平均低于正常(P<0.05)其中肝癌患者尤为明显，而Th2类细胞因子的水平与正常相似(P>0.05).
结论:慢性HBV感染与HBV阳性肝癌患者免疫耐受与DC的缺陷有关.
王健,苏安英, 柴锡庆,门金娥, 田珂,张向阳, 郑海萍.慢性乙肝与HBV阳性肝癌患者树突状细胞表型和功能检测.世界华人消化杂志 2004;12(8):2008-2010
, 百拇医药
0 引言乙肝病毒(hepatitisB virus，HBV)是一种非细胞病变病毒，但可诱发慢性肝炎、肝硬化和肝癌.病毒和宿主的免疫反应在慢性HBV感染和肝癌发生的过程中起关键作用.树突状细胞(dendriticcells，DC)是最有效的专职性抗原提呈细胞，能激活静止T淋巴细胞，诱导一系列免疫反应，清除病原体[1].用HBV转基因小鼠研究发现，虽然淋巴细胞的功能相似，但DC的功能却明显低于正常[2].提示慢性HBV感染及肝癌的发生可能与DC有关，我们探讨慢性HBV感染者和HBV阳性肝癌患者DC的表型和抗原提呈能力，以阐明慢性HBV感染及肝癌发生的机制.
1 材料和方法
1.1 材料 按照中华医学会修订的“病毒性肝炎防治方案”，选择慢性HBV感染者25例，男18例，女7例，年龄20-47(平均29.3±6.0岁);HBV阳性肝癌患者11例，男8例，女3例，年龄29-57(平均39.3±9.5岁);另选健康志愿者15名，男9名，女6名，年龄19-39(平均29.2±6.7岁).1 mo内未接受免疫调节剂及核苷类抗病毒药治疗.淋巴细胞分离液由中国医学科学院天津血液所生产，RPMI1640和AIM-V培养基购自GibcoCo，GM-CSF,IL-4，TNFa，IL-2，FITC标记的HLA-DR和CD1a，PE标记的CD80和CD86单抗及其对照，IFNg，IL-10和IL-12检测试剂盒均购自深圳晶美生物工程公司，PHA、丝裂霉素C购自SigmaCo，基因工程HBsAg由华北制药集团有限公司提供，尼龙毛购自上海化纤九厂，3H-TdR购自法国NENDuPont公司.FACS Calibar流式细胞仪由美国BecktonDickson公司生产，液闪仪由美国Backman公司生产，IMx全自动定量免疫分析系统由美国雅培制药有限公司生产，其余均为国产仪器.
, 百拇医药
1.2 方法 各指标检测严格按说明书要求操作.
统计学处理 计量资料以(mean±SD)表示，组间比较用t检验，P<0.05，则可认为组间的差别具有统计学意义.
2 结果
2.1 DC表型 慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者DC表面HLA-DR，CD83和CD86的表达水平较正常低，且后者尤甚(P<0.05，表1)而CD1a的表达与正常无明显不同(P>0.05)，提示其HLAⅡ和共刺激分子的表达水平较低，处于不成熟状态，可能影响其抗原提呈能力.
表1 慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者DC表面共刺激分子和MHCⅡ分子的表达(%)
, 百拇医药
2.2DC抗原提呈能力 用3H-TdR掺入法测定DC的提呈抗原的能力，发现慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者DC的刺激指数低于正常，而后者更低(P<0.05，表2)提示其抗原提呈能力较正常低，诱导特异性免疫反应的能力低下.
表2 DC抗原提呈能力和抗原提呈过程中细胞因子的分泌水平
, 百拇医药
2.3细胞因子水平 慢性乙肝患者DC提呈抗原的过程中，IFNg和IL-12的水平低于正常，即Th1类细胞因子的水平较低，HBV阳性肝癌患者水平最低(P<0.05，表2)，而IL-10的水平与正常相似(P>0.05)，即Th2类细胞因子的水平无明显改变.提示慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者的DC诱导细胞免疫反应的能力较低，而对体液免疫可能无明显影响.
3 讨论乙肝病毒(hepatitisB virus，HBV)只能在活细胞内以复制的方式进行繁殖，感染HBV后容易慢性化，甚至导致肝硬化和原发性肝癌.而清除HBV主要依赖细胞免疫，特别是细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicT lymphocytes，CTL)通过清除HBV感染的细胞和Th1细胞分泌细胞因子而清除HBV[3].树突状细胞(dendriticcells，DC)是体内功能最强的专职性抗原提呈细胞，也是惟一能激活初始型T细胞，诱发原发性免疫反应的细胞.Kurose et al [2]发现HBV转基因小鼠MHCⅡ和CD86的表达水平明显低于正常，导致DC功能缺陷，使T淋巴细胞处于无能状态，造成慢性HBV感染和免疫耐受，用同系DC进行过继免疫，则能打破免疫耐受，诱发特异性CTL反应，清除HBV.另有报道发现慢性HBV和HCV感染者及其阳性肝癌患者DC的HLA-DR，CD83和CD86的表达水平低于正常[4]，因此DC的功能与慢性HBV感染甚至原发性肝癌的发生密切相关.
, 百拇医药
我们所获DC纯度与文献[3]报道的相似.结果显示慢性HBV感染者与HBV阳性的肝癌患者DC的HLA-DR和共刺激分子的表达水平及提呈抗原的能力较正常细胞低下，而后者尤为显著.由此推断HBV感染可导致体内DC提呈抗原的能力降低，不能充分激活T淋巴细胞，诱发CTL反应，使感染容易慢性化.若进一步降低还可能使机体免疫监视功能严重缺陷，导致肝癌的发生.实验发现HBV转基因小鼠DC提呈抗原的能力低下，而且与Ia表达低下呈正相关，用IFNg可以提高DC提呈抗原的能力[2].另有报道慢性HBV和HCV感染者DC诱导混合性淋巴细胞反应的能力低下[4]，与本研究所观察的结果相似.我们还观察了DC提呈抗原的过程中Th1和Th2类细胞因子的水平，结果表明慢性HBV感染者与HBV阳性肝癌患者DC提呈抗原过程中，Th1类细胞因子IFNg，IL-12的水平较正常低，其中肝癌患者更为明显，而Th2类细胞因子IL-10无明显差别.Ninomiya et al [3]也发现肝细胞癌患者DC诱导同种混合性淋巴细胞反应过程中IL-10和IL-12的水平较正常低.同时有研究发现慢性HBV和HCV感染者DC在抗原提呈过程中，Th1类细胞因子IFNg和IL-12的水平低于正常，而Th2类细胞因子IL-10与正常无明显差别[5]，均与本研究的结果相似.提示HBV感染者DC诱导特异性免疫反应的能力低下，造成对HBV感染的免疫耐受，使感染慢性化甚至导致原发型肝细胞癌的发生.
, 百拇医药
4 参考文献1 Thery C, Amigorena S. The cell biology of antigen presentation indendritic cells. Curr Opin Immunol 2001;13:45-51
2 Kurose K, Akbar SM, Yamamoto K, Onji M. Production of antibody tohepatitis B surface antigen(anti-HBs) by murine
hepatitis B virus carriers:neonataltolerance versus antigen presentation by dendritic cells. Immunology
1997;92:494-500
, 百拇医药
3 Ninomiya T, Akbar SM, Masumoto T, Horiike N, Onji M. Dendriticcells with immature phenotype and defective function
in the peripheral blood from patients withhepatocellular carcinoma. J Hepatol 1999;31:323-331
4 Kakumu S, Ito S, Ishikawa T, Mita Y, Tagaya T, Fukuzawa Y, YoshiokaK. Decreased function of peripheral blood
dendritic cells in patients withhepatocellular carcinoma with hepatitis B and C virus infection. JGastroenterol Hepatol
2000;15:431-436
5 Bender A, Sapp M, Schuler G, Steinman RM, Bhardwaj N. Improvedmethods for the generation of dendritic cells from
nonproliferating progenitors in humanblood. J Immunol Methods 1996;196:121-135, http://www.100md.com( 王 健, 苏安英, 柴锡庆, 门金娥, 田 珂, 张向阳, 郑海萍)
河北省科技研究与发展计划项目资助,No. 00276168D
项目负责人:王健, 056038, 河北省邯郸市,河北工程学院教务处.
收稿日期:2004-08-23 接受日期:2004-09-24
摘要
目的:探讨慢性HBV感染者与HBV阳性肝癌患者DC的表型和功能及其与免疫耐受的关系.
, http://www.100md.com
方法:选择慢性HBV感染者25例、HBV阳性肝癌患者11例及正常人15名，从外周血中分离单个核细胞，用细胞贴壁法富集DC，流式细胞术测定DCHLAⅡ和共刺激分子的表达，同位素掺入法测定DC的抗原提呈能力，ELISA方法测定抗原提呈过程中Th1和Th2类细胞因子的水平.
结果:慢性HBV感染者与HBV阳性肝癌患者HLAⅡ和共刺激分子的表达水平、抗原提呈能力和Th1类细胞因子的水平均低于正常(P<0.05)其中肝癌患者尤为明显，而Th2类细胞因子的水平与正常相似(P>0.05).
结论:慢性HBV感染与HBV阳性肝癌患者免疫耐受与DC的缺陷有关.
王健,苏安英, 柴锡庆,门金娥, 田珂,张向阳, 郑海萍.慢性乙肝与HBV阳性肝癌患者树突状细胞表型和功能检测.世界华人消化杂志 2004;12(8):2008-2010
, 百拇医药
0 引言乙肝病毒(hepatitisB virus，HBV)是一种非细胞病变病毒，但可诱发慢性肝炎、肝硬化和肝癌.病毒和宿主的免疫反应在慢性HBV感染和肝癌发生的过程中起关键作用.树突状细胞(dendriticcells，DC)是最有效的专职性抗原提呈细胞，能激活静止T淋巴细胞，诱导一系列免疫反应，清除病原体[1].用HBV转基因小鼠研究发现，虽然淋巴细胞的功能相似，但DC的功能却明显低于正常[2].提示慢性HBV感染及肝癌的发生可能与DC有关，我们探讨慢性HBV感染者和HBV阳性肝癌患者DC的表型和抗原提呈能力，以阐明慢性HBV感染及肝癌发生的机制.
1 材料和方法
1.1 材料 按照中华医学会修订的“病毒性肝炎防治方案”，选择慢性HBV感染者25例，男18例，女7例，年龄20-47(平均29.3±6.0岁);HBV阳性肝癌患者11例，男8例，女3例，年龄29-57(平均39.3±9.5岁);另选健康志愿者15名，男9名，女6名，年龄19-39(平均29.2±6.7岁).1 mo内未接受免疫调节剂及核苷类抗病毒药治疗.淋巴细胞分离液由中国医学科学院天津血液所生产，RPMI1640和AIM-V培养基购自GibcoCo，GM-CSF,IL-4，TNFa，IL-2，FITC标记的HLA-DR和CD1a，PE标记的CD80和CD86单抗及其对照，IFNg，IL-10和IL-12检测试剂盒均购自深圳晶美生物工程公司，PHA、丝裂霉素C购自SigmaCo，基因工程HBsAg由华北制药集团有限公司提供，尼龙毛购自上海化纤九厂，3H-TdR购自法国NENDuPont公司.FACS Calibar流式细胞仪由美国BecktonDickson公司生产，液闪仪由美国Backman公司生产，IMx全自动定量免疫分析系统由美国雅培制药有限公司生产，其余均为国产仪器.
, 百拇医药
1.2 方法 各指标检测严格按说明书要求操作.
统计学处理 计量资料以(mean±SD)表示，组间比较用t检验，P<0.05，则可认为组间的差别具有统计学意义.
2 结果
2.1 DC表型 慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者DC表面HLA-DR，CD83和CD86的表达水平较正常低，且后者尤甚(P<0.05，表1)而CD1a的表达与正常无明显不同(P>0.05)，提示其HLAⅡ和共刺激分子的表达水平较低，处于不成熟状态，可能影响其抗原提呈能力.
表1 慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者DC表面共刺激分子和MHCⅡ分子的表达(%)
| 分组 | n | HLA-DR | CD1a | CD83 | CD86 |
| 正常人组 | 15 | 53.29±3.65 | 12.75±3.19 | 33.61±3.32 | 39.12±3.54 |
| 慢乙肝组 | 25 | 33.69±3.26 | 11.43±3.42 | 19.74±2.79 | 19.87±3.13 |
| 患肝癌组 | 13 | 15.98±2.87 | 10.88±2.99 | 9.89±1.88 | 10.02±2.01 |
, 百拇医药
2.2DC抗原提呈能力 用3H-TdR掺入法测定DC的提呈抗原的能力，发现慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者DC的刺激指数低于正常，而后者更低(P<0.05，表2)提示其抗原提呈能力较正常低，诱导特异性免疫反应的能力低下.
表2 DC抗原提呈能力和抗原提呈过程中细胞因子的分泌水平
| 组别 | n | 刺激指数(cpm) | IL-12(pg/mL) | IL-10(pg/mL) | IFNg(pg/mL) |
| 正常人组 | 15 | 15.2±3.8 | 811.9±306.5 | 412.7±163.9 | 739.1±154.5 |
| 慢乙肝组 | 25 | 9.3±2.6 | 499.3±238.6 | 376.1±123.2 | 419.87±113.1 |
| 患肝癌组 | 13 | 4.8±2.8 | 214.9±131.8 | 359.8±132.9 | 108.2±52.1 |
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2.3细胞因子水平 慢性乙肝患者DC提呈抗原的过程中，IFNg和IL-12的水平低于正常，即Th1类细胞因子的水平较低，HBV阳性肝癌患者水平最低(P<0.05，表2)，而IL-10的水平与正常相似(P>0.05)，即Th2类细胞因子的水平无明显改变.提示慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者的DC诱导细胞免疫反应的能力较低，而对体液免疫可能无明显影响.
3 讨论乙肝病毒(hepatitisB virus，HBV)只能在活细胞内以复制的方式进行繁殖，感染HBV后容易慢性化，甚至导致肝硬化和原发性肝癌.而清除HBV主要依赖细胞免疫，特别是细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicT lymphocytes，CTL)通过清除HBV感染的细胞和Th1细胞分泌细胞因子而清除HBV[3].树突状细胞(dendriticcells，DC)是体内功能最强的专职性抗原提呈细胞，也是惟一能激活初始型T细胞，诱发原发性免疫反应的细胞.Kurose et al [2]发现HBV转基因小鼠MHCⅡ和CD86的表达水平明显低于正常，导致DC功能缺陷，使T淋巴细胞处于无能状态，造成慢性HBV感染和免疫耐受，用同系DC进行过继免疫，则能打破免疫耐受，诱发特异性CTL反应，清除HBV.另有报道发现慢性HBV和HCV感染者及其阳性肝癌患者DC的HLA-DR，CD83和CD86的表达水平低于正常[4]，因此DC的功能与慢性HBV感染甚至原发性肝癌的发生密切相关.
, 百拇医药
我们所获DC纯度与文献[3]报道的相似.结果显示慢性HBV感染者与HBV阳性的肝癌患者DC的HLA-DR和共刺激分子的表达水平及提呈抗原的能力较正常细胞低下，而后者尤为显著.由此推断HBV感染可导致体内DC提呈抗原的能力降低，不能充分激活T淋巴细胞，诱发CTL反应，使感染容易慢性化.若进一步降低还可能使机体免疫监视功能严重缺陷，导致肝癌的发生.实验发现HBV转基因小鼠DC提呈抗原的能力低下，而且与Ia表达低下呈正相关，用IFNg可以提高DC提呈抗原的能力[2].另有报道慢性HBV和HCV感染者DC诱导混合性淋巴细胞反应的能力低下[4]，与本研究所观察的结果相似.我们还观察了DC提呈抗原的过程中Th1和Th2类细胞因子的水平，结果表明慢性HBV感染者与HBV阳性肝癌患者DC提呈抗原过程中，Th1类细胞因子IFNg，IL-12的水平较正常低，其中肝癌患者更为明显，而Th2类细胞因子IL-10无明显差别.Ninomiya et al [3]也发现肝细胞癌患者DC诱导同种混合性淋巴细胞反应过程中IL-10和IL-12的水平较正常低.同时有研究发现慢性HBV和HCV感染者DC在抗原提呈过程中，Th1类细胞因子IFNg和IL-12的水平低于正常，而Th2类细胞因子IL-10与正常无明显差别[5]，均与本研究的结果相似.提示HBV感染者DC诱导特异性免疫反应的能力低下，造成对HBV感染的免疫耐受，使感染慢性化甚至导致原发型肝细胞癌的发生.
, 百拇医药
4 参考文献1 Thery C, Amigorena S. The cell biology of antigen presentation indendritic cells. Curr Opin Immunol 2001;13:45-51
2 Kurose K, Akbar SM, Yamamoto K, Onji M. Production of antibody tohepatitis B surface antigen(anti-HBs) by murine
hepatitis B virus carriers:neonataltolerance versus antigen presentation by dendritic cells. Immunology
1997;92:494-500
, 百拇医药
3 Ninomiya T, Akbar SM, Masumoto T, Horiike N, Onji M. Dendriticcells with immature phenotype and defective function
in the peripheral blood from patients withhepatocellular carcinoma. J Hepatol 1999;31:323-331
4 Kakumu S, Ito S, Ishikawa T, Mita Y, Tagaya T, Fukuzawa Y, YoshiokaK. Decreased function of peripheral blood
dendritic cells in patients withhepatocellular carcinoma with hepatitis B and C virus infection. JGastroenterol Hepatol
2000;15:431-436
5 Bender A, Sapp M, Schuler G, Steinman RM, Bhardwaj N. Improvedmethods for the generation of dendritic cells from
nonproliferating progenitors in humanblood. J Immunol Methods 1996;196:121-135, http://www.100md.com( 王 健, 苏安英, 柴锡庆, 门金娥, 田 珂, 张向阳, 郑海萍)
