负载食管癌酸洗抗原树突状细胞诱导高效特异的抗肿瘤免疫
苏安英,王健, 柴锡庆,门金娥, 张向阳,郑海萍, 田珂,河北工程学院教务处 河北省邯郸市 056038
本课题受河北省科技研究与发展计划项目资助(No.00276168D)
项目负责人:苏安英,056038, 河北省邯郸市,河北工程学院教务处.
收稿日期:2004-04-19 接受日期:2004-05-13
摘要
目的:研究负载食管癌酸洗抗原树突状细胞(DC)诱导的特异性CTL对食管癌细胞的杀伤效应.
, 百拇医药
方法:酸洗涤法获得T.Tn细胞膜抗原多肽，GM-CSF，IL-4和TNF-a体外诱导扩增DC并负载酸洗抗原，制备食管癌抗原特异性CTL;用CytoTox 96TM检测其对T.Tn体外杀伤效应.
结果:负载食管癌抗原肽的DC诱导的特异性CTL对T.Tn的杀伤率达89.4%，显著高于LAK细胞的杀伤率43.9%(P<0.05). 而对MCC803及Hep2肿瘤细胞株无显著杀伤作用(P<0.05).
结论:负载食管癌抗原的DC体外可诱导出高效而特异的抗食管癌效应，提示以DC为中心的肿瘤生物治疗可望提高食管癌综合治疗水平.
苏安英,王健, 柴锡庆,门金娥, 张向阳,郑海萍, 田珂.负载食管癌酸洗抗原树突状细胞诱导高效特异的抗肿瘤免疫.世界华人消化杂志 2004;12(8):1978-1980
, 百拇医药
0 引言肿瘤生物治疗是近年来出现的肿瘤治疗新方法;也是肿瘤治疗的发展趋势.树突状细胞(dendriticcell，DC)是功能最强大的“专职”抗原提呈细胞(antigenpresenting cells，APCs)，具有独特的抗原提呈和激发功能.作为免疫反应的核心和关键.在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用，以DC为中心的肿瘤生物治疗是发展的主要方向之一[1].食管癌的治疗手段包括手术、介入治疗、化疗、生物治疗等，尽管手术技巧不断提高，化疗药物不断更新，生物治疗也进行了积极的探索，但仍然无法彻底解决肿瘤复发与转移的问题.我们用DC负载酸洗脱食管癌细胞表面的抗原多肽，体外诱导食管癌T.Tn抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicT lymphocyte，CTL)，研究其对食管癌T.Tn细胞的杀伤效应.
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料 人食管癌T.Tn和胃癌MGC803细胞株(购自上海市肿瘤研究所)，人肝癌细胞株HepG2(购自中国人民解放军传染病中心)，人外周血来自正常献血员外周静脉血.
1.2 方法 食管癌T.Tn抗原的制备按照文献[2]方法.收集培养中对数生长期的T.Tn细胞，用pH3.3的柠檬酸洗脱液作用50s，然后1 000r/min，5min; 小心收集上清液，置-80°C冻存备用.酸洗后的细胞立即以RPMI1640 培养基洗涤3遍，并继续培养，每24-28h重复洗脱1次，每次保证所收集的细胞在1×109/L以上.所获的酸洗液经SepPakl8去盐柱去盐，然后收集经Centricon-3超离后的滤液.获得T.Tn食管癌抗原多肽，并对酸洗后的细胞进行抗原性检测.用梯度离心法从食管癌患者外周血中分离获得外周血单个核细胞(PBMC)悬于含200mL/L胎牛血清的RPMI1640中，加rhGM-CSF500 kU/L，rhIL-41 000 kU/L在37 °C，50mL/L CO2，条件培养箱中培养.第3 d向DC诱导体系中加入上述食管癌T.Tn抗原，与诱导中的DC孵育，以制备负载食管癌T.Tn抗原的DC.第5 d加入TNF-a100 mg/L，第7d收集已负载抗原的DC与根据文献[3]分离T淋巴细胞混合培养5d，诱导抗原特异性CTL.以负载抗原DC诱导的抗原特异性CTL，LAK细胞、未负载抗原的单纯DC诱导的T淋巴细胞、食管癌T.Tn抗原直接诱导的T淋巴细胞以及未经诱导的T淋巴细胞作为效应细胞、以T.Tn、MGC803、Hep2为靶细胞，效靶比分别在1:12.5、1:25、1:50采用CytoTox96TM试剂盒进行细胞毒性实验.杀伤活性(%)= (实验孔A值-效应细胞孔自发释放A值-靶细胞自发释放A值)/(靶细胞最大释放A值-靶细胞自发释放A值)×100%统计学处理数据以mean±SD表示，采用SPSS软件进行t检验分析.
, 百拇医药
表1 负载酸洗抗原DC诱导的特异性CTL对T.Tn的杀伤作用(%)
, http://www.100md.com
2 结果食管癌T.Tn特异性CTL对酸洗后的T.Tn杀伤率在各个效靶比均较酸洗前显著降低(P<0.01)，同其对无关肿瘤细胞MGC803和Hep2的杀伤率相比无显著差异(P>0.05，表1).负载食管癌T.Tn酸洗抗原DC诱导的CTL对T.Tn有强大的杀伤作用，与LAK细胞相比有非常显著差异(P<0.01). 单纯负载食管癌T.Tn抗原DC及未经DC诱导的T细胞对T.Tn均无显著杀伤作用，与对无关肿瘤HepG2类似(表1).
3 讨论诱导肿瘤特异性CTL是抗肿瘤免疫反应的关键，而CTL的特异性取决于肿瘤抗原的特异性.虽然食管癌特异性抗原尚不明确，然而T淋巴细胞识别的是结合于肿瘤细胞或APC表面与MHC-I类分子多肽结合沟内的抗原多肽.因此，提取这种抗原多肽来诱导CTL，可以实现对肿瘤的特异性免疫.微酸洗涤法可以特异地把该多肽分离出来，而对与MHC-II和其他非MHC结合的抗原无影响，也不会引起多肽结构改变，使酸洗物成分相对单一[4].因此，以微酸洗涤T.Tn细胞方法获取肿瘤抗原能够保留其特异性.我们实验中特异性CTL对酸洗前后的T.Tn杀伤作用的对比也符合此观点.肿瘤细胞低表达或不表达MHC分子和共刺激分子是肿瘤免疫逃逸的主要原因之一，导致抗原不能被有效提呈给T细胞以产生特异性的抗瘤效应.因此激发有效的T细胞介导的抗瘤免疫反应是提高肿瘤免疫治疗效果的关键.单纯的抗原不能活化T淋巴细胞，必须经过APC提呈;因为T淋巴细胞活化需要抗原和辅助分子双信号才能有效地诱导CTL形成，发挥抗瘤效应[5].
, 百拇医药
DC是体内功能最强大的APC，具有独特的抗原提呈和免疫激发功能，在肿瘤细胞和T淋巴细胞间起作枢纽和桥梁作用，因此DC在肿瘤的发生、发展和免疫治疗中发挥着重要的作用[6].肿瘤抗原不被DC提呈就不能有效地诱导出抗瘤免疫;肿瘤组织中的DC分布量与肿瘤的疗效和预后密切相关[7].然而，在肿瘤微环境中，DC数量有限、局部调节DC的活性物质不足以及肿瘤和细胞分泌抑制DC功能的细胞因子等原因，致使DC抗原提呈能力十分有限[8].因此，在体外进行DC诱导、扩增，并负载相应的肿瘤抗原，然后再回输体内，对肿瘤过继免疫治疗显得十分重要，这也是当前研究的热点.我们用食管癌抗原多肽负载DC后诱导食管癌特异性CTL，结果显示其对食管癌T.Tn细胞株的杀伤率可高达89.4%，显著高于LAK细胞的作用，提示DC可有效地捕获、提呈了食管癌抗原并诱导出食管癌抗原特异性CTL，产生高效的抗食管癌效应;实验同时显示该特异性CTL对其他类型的肿瘤细胞株MGC803和HepG2则无显著杀伤作用，提示DC负载食管癌抗原诱导的CTL对食管癌具有高度特异性.这对临床食管癌疫苗的应用提供了一个思路.另外，实验结果显示，单纯食管癌特异性抗原多肽未经DC提呈而直接刺激T淋巴细胞，其诱导的T淋巴细胞对T.Tn无显著杀伤作用，且与未经抗原诱导的T淋巴细胞对T.Tn以及无关肿瘤细胞HepG2的杀伤作用相似，说明未经DC提呈抗原就不能诱导出有效的肿瘤特异性CTL而发挥抗瘤效应，充分显示了DC的抗原提呈作用在抗瘤免疫反应中重要地位.
, 百拇医药
4 参考文献1 Okada H, Tahara H, Shurin MR, Attanucci J, Giezeman-Smits KM,Fellows WK, Lotze MT, Chambers WH, Bozik ME. Bone
marrow-derived dendritic cells pulsed witha tumor-specific peptide elicit effective anti-tumor immunityagainst
intracranial neoplasms. Int J Cancer 1998;78:196-201
2 Storkus WJ, Zeh HJ 3rd, Salter RD, Lotze MT. Identification ofT-cell epitope:rapid isolation of class I-presented peptides
, 百拇医药
from viable cells by mild acid elution. JImmunother 1993;14:94-103
3 巴德年.当代免疫学技术与应用.北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1998:158-167
4 Runnels HA, Moore JC, Jensen PE. A structural transition in classII major histocomatibility complex proteins at mildly
acidic pH. J Exp Med 1996;183:127-136
5 Sigal LJ, Reiser H, Rock KL. The role of B7-1 and B7-2costimulation for the generation of CTL responses in vivo. J
, http://www.100md.com
Immunol 1998;161:2740-2745
6 Angevin E, Andre F, Zitvogel L. Antitumor cellular immunotherapy:the breakthrough of dendritic cells. Bull Cancer
2000;87:107-115
7 Maehara Y, Tomisaki S, Oda S, Kakeji Y, Tsujitani S, Ichiyoshi Y,Akazawa K, Sugimachi K. Lymph node metastasis and
relation to tumor growth potential andlocal immune response in advanced gastric cancer. Int J Cancer
1997;74:224-228
8 Kiertscher SM, Luo J, Dubinett SM, Roth MD. Tumors promote alteredmaturation and early apoptosis of monocyte-
derived dendritic cells. J Immunol 2000;164:1269-1276, http://www.100md.com( 苏安英, 王 健, 柴锡庆, 门金娥, 张向阳, 郑海萍, 田 珂)
本课题受河北省科技研究与发展计划项目资助(No.00276168D)
项目负责人:苏安英,056038, 河北省邯郸市,河北工程学院教务处.
收稿日期:2004-04-19 接受日期:2004-05-13
摘要
目的:研究负载食管癌酸洗抗原树突状细胞(DC)诱导的特异性CTL对食管癌细胞的杀伤效应.
, 百拇医药
方法:酸洗涤法获得T.Tn细胞膜抗原多肽，GM-CSF，IL-4和TNF-a体外诱导扩增DC并负载酸洗抗原，制备食管癌抗原特异性CTL;用CytoTox 96TM检测其对T.Tn体外杀伤效应.
结果:负载食管癌抗原肽的DC诱导的特异性CTL对T.Tn的杀伤率达89.4%，显著高于LAK细胞的杀伤率43.9%(P<0.05). 而对MCC803及Hep2肿瘤细胞株无显著杀伤作用(P<0.05).
结论:负载食管癌抗原的DC体外可诱导出高效而特异的抗食管癌效应，提示以DC为中心的肿瘤生物治疗可望提高食管癌综合治疗水平.
苏安英,王健, 柴锡庆,门金娥, 张向阳,郑海萍, 田珂.负载食管癌酸洗抗原树突状细胞诱导高效特异的抗肿瘤免疫.世界华人消化杂志 2004;12(8):1978-1980
, 百拇医药
0 引言肿瘤生物治疗是近年来出现的肿瘤治疗新方法;也是肿瘤治疗的发展趋势.树突状细胞(dendriticcell，DC)是功能最强大的“专职”抗原提呈细胞(antigenpresenting cells，APCs)，具有独特的抗原提呈和激发功能.作为免疫反应的核心和关键.在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用，以DC为中心的肿瘤生物治疗是发展的主要方向之一[1].食管癌的治疗手段包括手术、介入治疗、化疗、生物治疗等，尽管手术技巧不断提高，化疗药物不断更新，生物治疗也进行了积极的探索，但仍然无法彻底解决肿瘤复发与转移的问题.我们用DC负载酸洗脱食管癌细胞表面的抗原多肽，体外诱导食管癌T.Tn抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicT lymphocyte，CTL)，研究其对食管癌T.Tn细胞的杀伤效应.
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料 人食管癌T.Tn和胃癌MGC803细胞株(购自上海市肿瘤研究所)，人肝癌细胞株HepG2(购自中国人民解放军传染病中心)，人外周血来自正常献血员外周静脉血.
1.2 方法 食管癌T.Tn抗原的制备按照文献[2]方法.收集培养中对数生长期的T.Tn细胞，用pH3.3的柠檬酸洗脱液作用50s，然后1 000r/min，5min; 小心收集上清液，置-80°C冻存备用.酸洗后的细胞立即以RPMI1640 培养基洗涤3遍，并继续培养，每24-28h重复洗脱1次，每次保证所收集的细胞在1×109/L以上.所获的酸洗液经SepPakl8去盐柱去盐，然后收集经Centricon-3超离后的滤液.获得T.Tn食管癌抗原多肽，并对酸洗后的细胞进行抗原性检测.用梯度离心法从食管癌患者外周血中分离获得外周血单个核细胞(PBMC)悬于含200mL/L胎牛血清的RPMI1640中，加rhGM-CSF500 kU/L，rhIL-41 000 kU/L在37 °C，50mL/L CO2，条件培养箱中培养.第3 d向DC诱导体系中加入上述食管癌T.Tn抗原，与诱导中的DC孵育，以制备负载食管癌T.Tn抗原的DC.第5 d加入TNF-a100 mg/L，第7d收集已负载抗原的DC与根据文献[3]分离T淋巴细胞混合培养5d，诱导抗原特异性CTL.以负载抗原DC诱导的抗原特异性CTL，LAK细胞、未负载抗原的单纯DC诱导的T淋巴细胞、食管癌T.Tn抗原直接诱导的T淋巴细胞以及未经诱导的T淋巴细胞作为效应细胞、以T.Tn、MGC803、Hep2为靶细胞，效靶比分别在1:12.5、1:25、1:50采用CytoTox96TM试剂盒进行细胞毒性实验.杀伤活性(%)= (实验孔A值-效应细胞孔自发释放A值-靶细胞自发释放A值)/(靶细胞最大释放A值-靶细胞自发释放A值)×100%统计学处理数据以mean±SD表示，采用SPSS软件进行t检验分析.
, 百拇医药
表1 负载酸洗抗原DC诱导的特异性CTL对T.Tn的杀伤作用(%)
| 效靶比12.5:1 | 效靶比25:1 | 效靶比50:1 | |
| CTL+T.Tn (酸洗前) | 53.5±8.8 | 76.52±8.6 | 89.4±9.5 |
| CTL+T.Tn (酸洗后) | 6.1±1.8 | 7.3±1.9 | 8.6±2.1 |
| CTL+MGC803 | 5.5±1.6 | 8.6±2.1 | 9.3±3.6 |
| CTL+HepG2 | 5.2±1.7 | 7.8±2.4 | 8.8±3.0 |
| LAK+T.Tn | 25.9±5.8 | 36.9±6.2 | 43.9±4.9 |
| DC+T.Tn | 1.6±1.3 | 2.0±1.6 | 2.3±1.8 |
| 抗原+T细胞+T.Tn | 1.2±1.0 | 1.6±1.4 | 2.1±1.6 |
| T细胞+T.Tn | 1.1±0.8 | 1.7±1.0 | 1.6±1.5 |
| T细胞+HepG2 | 1.0±0.6 | 1.1±1.0 | 1.3±0.9 |
, http://www.100md.com
2 结果食管癌T.Tn特异性CTL对酸洗后的T.Tn杀伤率在各个效靶比均较酸洗前显著降低(P<0.01)，同其对无关肿瘤细胞MGC803和Hep2的杀伤率相比无显著差异(P>0.05，表1).负载食管癌T.Tn酸洗抗原DC诱导的CTL对T.Tn有强大的杀伤作用，与LAK细胞相比有非常显著差异(P<0.01). 单纯负载食管癌T.Tn抗原DC及未经DC诱导的T细胞对T.Tn均无显著杀伤作用，与对无关肿瘤HepG2类似(表1).
3 讨论诱导肿瘤特异性CTL是抗肿瘤免疫反应的关键，而CTL的特异性取决于肿瘤抗原的特异性.虽然食管癌特异性抗原尚不明确，然而T淋巴细胞识别的是结合于肿瘤细胞或APC表面与MHC-I类分子多肽结合沟内的抗原多肽.因此，提取这种抗原多肽来诱导CTL，可以实现对肿瘤的特异性免疫.微酸洗涤法可以特异地把该多肽分离出来，而对与MHC-II和其他非MHC结合的抗原无影响，也不会引起多肽结构改变，使酸洗物成分相对单一[4].因此，以微酸洗涤T.Tn细胞方法获取肿瘤抗原能够保留其特异性.我们实验中特异性CTL对酸洗前后的T.Tn杀伤作用的对比也符合此观点.肿瘤细胞低表达或不表达MHC分子和共刺激分子是肿瘤免疫逃逸的主要原因之一，导致抗原不能被有效提呈给T细胞以产生特异性的抗瘤效应.因此激发有效的T细胞介导的抗瘤免疫反应是提高肿瘤免疫治疗效果的关键.单纯的抗原不能活化T淋巴细胞，必须经过APC提呈;因为T淋巴细胞活化需要抗原和辅助分子双信号才能有效地诱导CTL形成，发挥抗瘤效应[5].
, 百拇医药
DC是体内功能最强大的APC，具有独特的抗原提呈和免疫激发功能，在肿瘤细胞和T淋巴细胞间起作枢纽和桥梁作用，因此DC在肿瘤的发生、发展和免疫治疗中发挥着重要的作用[6].肿瘤抗原不被DC提呈就不能有效地诱导出抗瘤免疫;肿瘤组织中的DC分布量与肿瘤的疗效和预后密切相关[7].然而，在肿瘤微环境中，DC数量有限、局部调节DC的活性物质不足以及肿瘤和细胞分泌抑制DC功能的细胞因子等原因，致使DC抗原提呈能力十分有限[8].因此，在体外进行DC诱导、扩增，并负载相应的肿瘤抗原，然后再回输体内，对肿瘤过继免疫治疗显得十分重要，这也是当前研究的热点.我们用食管癌抗原多肽负载DC后诱导食管癌特异性CTL，结果显示其对食管癌T.Tn细胞株的杀伤率可高达89.4%，显著高于LAK细胞的作用，提示DC可有效地捕获、提呈了食管癌抗原并诱导出食管癌抗原特异性CTL，产生高效的抗食管癌效应;实验同时显示该特异性CTL对其他类型的肿瘤细胞株MGC803和HepG2则无显著杀伤作用，提示DC负载食管癌抗原诱导的CTL对食管癌具有高度特异性.这对临床食管癌疫苗的应用提供了一个思路.另外，实验结果显示，单纯食管癌特异性抗原多肽未经DC提呈而直接刺激T淋巴细胞，其诱导的T淋巴细胞对T.Tn无显著杀伤作用，且与未经抗原诱导的T淋巴细胞对T.Tn以及无关肿瘤细胞HepG2的杀伤作用相似，说明未经DC提呈抗原就不能诱导出有效的肿瘤特异性CTL而发挥抗瘤效应，充分显示了DC的抗原提呈作用在抗瘤免疫反应中重要地位.
, 百拇医药
4 参考文献1 Okada H, Tahara H, Shurin MR, Attanucci J, Giezeman-Smits KM,Fellows WK, Lotze MT, Chambers WH, Bozik ME. Bone
marrow-derived dendritic cells pulsed witha tumor-specific peptide elicit effective anti-tumor immunityagainst
intracranial neoplasms. Int J Cancer 1998;78:196-201
2 Storkus WJ, Zeh HJ 3rd, Salter RD, Lotze MT. Identification ofT-cell epitope:rapid isolation of class I-presented peptides
, 百拇医药
from viable cells by mild acid elution. JImmunother 1993;14:94-103
3 巴德年.当代免疫学技术与应用.北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1998:158-167
4 Runnels HA, Moore JC, Jensen PE. A structural transition in classII major histocomatibility complex proteins at mildly
acidic pH. J Exp Med 1996;183:127-136
5 Sigal LJ, Reiser H, Rock KL. The role of B7-1 and B7-2costimulation for the generation of CTL responses in vivo. J
, http://www.100md.com
Immunol 1998;161:2740-2745
6 Angevin E, Andre F, Zitvogel L. Antitumor cellular immunotherapy:the breakthrough of dendritic cells. Bull Cancer
2000;87:107-115
7 Maehara Y, Tomisaki S, Oda S, Kakeji Y, Tsujitani S, Ichiyoshi Y,Akazawa K, Sugimachi K. Lymph node metastasis and
relation to tumor growth potential andlocal immune response in advanced gastric cancer. Int J Cancer
1997;74:224-228
8 Kiertscher SM, Luo J, Dubinett SM, Roth MD. Tumors promote alteredmaturation and early apoptosis of monocyte-
derived dendritic cells. J Immunol 2000;164:1269-1276, http://www.100md.com( 苏安英, 王 健, 柴锡庆, 门金娥, 张向阳, 郑海萍, 田 珂)
