关键词：无细胞真皮基质；复合皮；皮肤移植
[摘 要] 目的：通过动物实验方法，探讨一种适合薄的自体断层皮片或培养表皮细胞膜片生长的真皮床，使两者结合成为复合皮，以期为临床应用。方法：将异体鼠的全厚皮切制成厚0.3mm的中厚皮片，先后经1MNaCl溶液去表皮、0.1%戊二醛交联、0.5%SDS脱真皮细胞、0.25%胰蛋白酶再消化及冷冻干燥处理，清除皮肤中具有抗原性的所有细胞成分，而较完整地保留了无免疫源性的细胞外基质蛋白和胶原，制得无细胞真皮基质(ADM)。与薄的自体断层皮片(厚0.1mm)一起制成复合皮移植于创面上。结果：术后2周见复合皮成活率高。组织学检查证实ADM血管化良好，宿主细胞如成纤维细胞可长入ADM中。长期观察证实无明显瘢痕形成及挛缩畸形，后期收缩轻；表面平滑，质地柔软，有弹性，无水疱形成及排异反应。结论：目前认为，表皮—真皮复合皮是一种较为理想的真皮替代物。
Preparationand Application of Rat Allo-ADM (Acellular Dermal Matrix)
Fu Hongbin
(Shandong Provincial Hospital 250021 Huo Menghua, Zhang Yuntao Shandong Medical University250012)
[Abstract] Objective: To investigate anappropriate method for the preparation of allo-ADM for clinical use. Method:Split-thickness allograft, 0.3 mm thick, was obtained from rat's full-thickness skin witha dermatome. Donor skin was treated with 1 M NaCl, 0.1% glutaraldehyde, 0.5% SDS and 0.25%trypsin successively. The resulting acellular dermal matrix was then freeze-dried in afreeze-dryer. The processing technique removed all the cellular components from the allograft, which showed antigenicity; retained non-immunogenic, extracellular tissuematrix and collagen more completely and resulted in an acellular dermal matrix. Compositeskin (CS), combined ADM with thin split-thickness autograft (0.1 mm thick) was implantedon open wound. Results: 2 weeks after implantation, CS exhibited a high percentage ofsurvival. Histological evaluation of biopsy demonstrated good neo-vascularization of ADM,infiltration of host cell (such as fibroblast) and no specific immuno response. Long-termobservation showed smooth appearance, soft and elastic texture, no blister, no undesirablescarring and contracture. Conclusion: ADM is an ideal dermal substitute.
[Key words] Acellular dermal Matrix Composite skin Skintransplantation
大面积深度烧伤的治疗过程中，早期切除烧伤坏死组织、皮肤移植可明显缩短患者的住院时间，减少感染等并发症，提高生存率和生存质量[1-6] 。然而坏死组织切除后，可供移植的自体皮肤常常不足，临床上常需反复切取自体皮肤，制成刃厚皮或微粒皮来覆盖创面；80年代中后期兴起的表皮细胞体外培养技术，可使20cm2 的皮肤在2周～3周内扩大到1.9m2 以上，足以覆盖全身创面。
真皮是皮肤的重要组成部分，在皮肤愈合、生长、抗菌和防御感染方面发挥着重要的作用。但成年哺乳类动物的真皮是不能自发再生的，在缺乏移植存活的真皮基质时，成纤维细胞只能合成不成熟的基质，此种基质经改建后即形成瘢痕组织[8] 。由此可见，皮肤中的表皮细胞可通过自身的增殖逐步完成创面的上皮化过程，而真皮化过程目前尚难以完成，创面愈合后形成大量的瘢痕组织(即瘢痕愈合)，导致瘢痕挛缩。故真皮的替代问题成为制约创面处理更加棘手的问题。为此我们研制了一种适合薄的自体断层皮片(Split-thickness Autograft,STAG)或培养表皮细胞膜片生长的真皮床，并使两者结合制成复合皮(Composite Skin,CS)移植于创面上，通过动物实验探讨其临床应用的可行性。
一、材料与方法
(一) 实验动物：Sprague-Dawley(SD)系成年大白鼠8只，体重350g～500g，雌雄不限(山东医科大学实验动物中心提供)。
(二) 试剂：0.1%戊二醛(glutaraldehyde)缓冲液(上海化学试剂厂产品)；0.25胰蛋白酶(trypsin)(美国Gibco产品)；1MNaCl溶液；0.5%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)(Serva 公司产品)；PBS溶液(pH7.4,0.01mol/L)。
(三) 实验设备：超净工作台(上海医学设备厂)；SHZ88-1型台式水浴恒温振荡器(江苏太仓市光明实验分析仪器厂)；冷冻干燥机(Freeze-Dryer)(美国FTS公司产品)；消化瓶；鼓式取皮机；皮片制网机。
(四) 实验步骤：概括为以下三个方面。
1.ADM的制备：取大白鼠全厚皮，将其反置于鼓式取皮机上，切制成厚0.3mm的中厚皮片；以皮片制网机将其制成细网状，再切制成3cm×3cm大小的皮片。将皮片置消化瓶中，加1MNaCl溶液，置恒温振荡器中，34℃，持续振荡，浸泡24小时。轻轻剥离表皮层，加0.1%戊二醛缓冲液，浸泡5分钟后取出，加0.5%SDS溶液，浸泡2小时。PBS溶液漂洗，置0.25%胰蛋白酶溶液中消化20分钟，大量的PBS溶液反复多次漂洗。沥干后入深低温冰箱快速冷冻，置冷冻干燥机上，持续12小时左右，皮片干燥后，密封于无菌塑料袋中备用。
2.ADM的水化：以PBS溶液漂洗冷冻干燥后的ADM，然后置于PBS溶液中浸泡30分钟后即可使用。
3.ADM的应用：取大白鼠6只，3%戊巴比妥钠30mg/kg体重，行腹腔注射全身麻醉。切取大白鼠背部全厚皮肤，在头、尾侧分别制成3cm×3cm大小的两处创面，达深筋膜表面，分别作为对照区(C)和试验区(T)。将全厚皮置于鼓式取皮机上，反取成厚0.1mm的薄STAG。将水化后的ADM真皮面向下平铺于尾侧创面上，将薄STAG移植于ADM上，形成复合皮(CS)。头侧创面上仅移植薄STAG，边缘与皮肤行间断缝合，留长线打包加压包扎。ADM的制备、水化和应用均在严格无菌条件下进行。
(五) 观察指标：1.ADM以10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，组织切片，行HE、Masson染色。ADM粉碎后行细菌培养；2.ADM移植后2周首次打开包扎，观察CS成活情况及其大小，并取活检，标本以10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，组织切片，HE染色，以后每2周重复一次；3.皮肤弹性通过与周围正常皮肤比较，粗略估计其占正常皮肤弹性的百分比。外观评价分为好、一般、差三个级别。
二、结 果
SDS处理后的ADM呈乳白色，形成基底膜和真皮两个面，其中基底膜面有光泽，比真皮面光滑，富有弹性与正常皮肤相近；经冷冻干燥及水化处理后，其手感较酥软，弹性略有减退，厚度增加。将ADM粉碎后进行细菌培养，无细菌生长。HE染色证实真皮中的所有细胞成分被完全祛除；Masson染色证实ADM中的纤维成分无变性坏死，排列规整。
ADM移植后2周首次打开包扎时，见创面均已愈合，CS成活率均在90%以上，质地较柔软。自体皮片与真皮连接不够牢固，取活检时可发生分离，真皮与深筋膜愈合牢固，不能推移。至4周时，自体皮片与真皮连接牢固，愈合成为一体。至6周时，真皮与深筋膜愈合变得较为疏松。第八周时真皮与深筋膜间即形成较完整的滑膜样组织，可出现明显的推移。CS移植后无充血、水肿，无毛发再生，表面光滑，无水疱形成，质地柔软，未出现明显挛缩。至8周时植皮区外观与脱毛后的鼠皮无明显差异，与对照区比较CS后期收缩明显减轻(见表1)。
表1 复合皮移植区(T)与薄STAG移植区(C)效 果 对 比
| 评估 指标 | T/C | |||
| 2周 | 4周 | 8周 | 12周 | |
| 弹性 外观 | 25/25 | 50/25 | 50/20 | 80/20 |
| 一般/一般 | 好/一般 | 好/差 | 好/差 | |
三、讨 论
皮肤由表皮和真皮构成。在创面处理过程中，仅仅使其上皮化是远远不够的，还应同时提供尽量多的真皮组织，使其真皮化。只有这样，才能最大限度地减轻瘢痕的形成及挛缩畸形。烧伤后瘢痕形成和挛缩的程度与自体皮片中真皮的含量成反比。薄的断层皮片正是由于缺乏足够的真皮成分而导致瘢痕形成和挛缩畸形[7] 。异体皮或异种皮移植于创面后，可暂时封闭创面，并存活一段时间，但由于其自身的免疫原性，最终会被宿主的免疫系统所识别而排异[9] 。引起排异反应的抗原物质即存在于异体细胞的细胞膜上，排异过程正是针对异体表皮细胞和真皮中的成纤维细胞、血管内皮细胞等细胞成分[10，11] 。排异反应除损伤细胞外，也使胶原束及其排列顺序受到损伤；真皮的非细胞成分—细胞外基质蛋白和胶原(即AcellularDermal Matrix,ADM)则相对无免疫活性，可永久存在于宿主机体上[12] 。由此推动了异体或异种皮肤无细胞化的研制和开发。
制备ADM的过程主要包含5个步骤：1.去表皮，应用1M NaCl溶液，可使锚状纤维与基底细胞的半桥粒相分离，在保留基底膜的同时祛除表皮。2.交联反应，经戊二醛交联的皮肤，基质蛋白上-NH2 与戊二醛-CHO发生交联反应，使其抗原性降低，不易被宿主体内的胶原酶所降解。但应严格控制交联的时间和浓度，否则将引起ADM理化性质的改变，移植后会出现像戊二醛皮的“占位性”现象；交联反应应安排在去表皮后进行，否则引起去表皮困难。3.脱真皮细胞，采用0.5%SDS处理皮肤。它是一种破膜剂，可使细胞发生破裂溶解，在不损伤细胞外基质的前提下，清除真皮中的所有细胞成分。Wainwright[13] 和Walter[14] 制备ADM时均将0.5%SDS的作用时间定为1小时，而我们发现1小时并不能完全祛除真皮中的细胞成分，特别是附件成分，欲达到此目的，需2小时之久。4.胰蛋白酶再消化，可更有效地祛除真皮中的细胞碎片。5.冷冻干燥处理，可使ADM的抗原性下降，结构更加疏松，易于宿主细胞长入，更利于长期储存。
Takami[15] 等应用Dispase II和TritonX-100处理SD鼠全厚皮片，制成的ADM需两期移植手术完成创面的覆盖，一期手术移植ADM，2周后ADM出现广泛血管化，二期移植自体皮肤。我们制备的ADM与薄STAG复合移植形成复合皮，仅需一期手术即可覆盖创面。在ADM尚未血管化之前，表层上皮细胞生存所需的营养物质主要来自经ADM渗透的组织液，故在ADM上应打许多致密的小孔，一方面利于营养物质的渗透，另一方面有利于SDS更有效地渗入到组织中，发挥脱细胞作用，亦有利于SDS的清洗；同时ADM的厚度应严格控制在0.3～0.4mm之间，使复合皮的厚度不超过0.5mm。如制备的ADM比较厚时，宜采用二期移植手术，以保证表皮的成活。
高渗盐水处理的ADM保留了基底膜复合物。电镜下基底膜可分为三层[16] ：邻近基底细胞的透明层、中间的致密层和与真皮连接的网状层。半桥粒凭借基底细胞内的张力丝，横跨透明层的固定丝、致密层内的Ⅳ型胶原及层粘连蛋白以及网状层的锚状纤维将表皮固定于真皮上。正常皮肤的上皮和真皮的连接便是依靠基底膜及其上广泛分布的半桥粒。临床上应用的取皮方法，其厚度均达基底膜以下的平面，所以在复合皮的上层内已包含有基底膜复合物，在此情况下，ADM中的基底膜意义并不大，可能有一定的负面影响，但对培养的表皮细胞膜片及微粒皮移植，则具有重要的意义，后两者移植后形成非常脆弱的皮肤，正是由于缺乏基底膜的缘故[17] 。在我们的复合皮移植实验中，早期出现的上层皮片与ADM连接不牢固，可能与基底膜的存在有关，组织学检查亦证实CS两层之间存在有明显的分界，，至第八周时变得不明显。将ADM埋植于皮下，2周后组织学检查见ADM的基底膜面与皮下组织间形成一明显的间隙，而真皮面则与皮下组织粘合无间隙。有人认为ADM可为宿主提供足够的，排列规整的胶原基质。胶原束的正确排列和弹力纤维的存在是真皮发挥正常功能所必要的，肉芽组织和瘢痕组织正是以胶原的排列紊乱和弹力的纤维的缺乏为其特征[18] 。在ADM中自创面基底移入的纤维母细胞仍保存有产生成熟基质的能力[13] 。
实验表明：ADM与薄STAG复合移植于创面上成活率高，质地柔软有弹性，表面平滑，无水疱形成，远期无明显瘢痕形成及挛缩畸形，后期收缩轻。组织学检查证实胶原排列整齐，血管化程度良好，可见宿主细胞如成纤维细胞长入，无排异反应，是一种较为理想的永久真皮替代物。然而，ADM中缺乏皮肤附件，亦无神经支配，对其功能肯定会有一定的影响。ADM通透性强，易干燥，抗感染能力差，无论一期还是二期手术均需要有良好的覆盖物，这些都限制其在临床上的应用，有待于进一步研究和改进。
参 考 文 献
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