关键词：蝮蛇抗栓酶 烫伤 丙二醛 乳酸脱氢酶 肌酸泊酶谷-草转氨酶
[摘 要] 本研究针对烧伤后血液呈高凝状态，加重组织损害的特点，利用家兔25%TBSA Ⅲ°烫伤模型，采用蝮蛇抗栓酶治疗，观察脂质过氧化产物丙二醛(MDA)及血清酶学变化，结果显示：蝮蛇抗栓酶能明显减轻烧伤早期脂质过氧化损害；对烧伤后继发性组织损伤有保护作用。
The Effect of Ahylysantinfarctase (Svate) on TissueCell Injury at the Early Stage of Burn He Quanyong, et al. The 3rd AffiliatedHospital of Hunan Medical University 410013
[Abstract] Rabbits with 25%TBSA full-thickness burn produced by immersing theexposed area of the animal 's back into 97oC boiling water for 13 seconds, were treatedwith Svate. The levels of malondialdehyde (MDA), lactic dehydrogenase (LDH), creatinkinase CK) and glutamic-oxalacetic transaminase (GOT) were measured at 5 minutes beforescald and 2, 6, 12, 24, 48 hours after scald. This study suggested that Svate hadsignificant protective effect on secondary tissue cell injury post burn.
[Key words] Svate MDA GOT CK LDH scald
严重烧伤早期血液呈高凝状态，导致微循环瘀滞，微血栓形成，组织灌注不良，加重烧伤后组织细胞损伤，是多器官功能不全的病理基础。本实验选用蝮蛇抗栓酶对家兔烫伤休克模型进行试验治疗，观察对抗高凝状态、疏通微循环是否能减轻烧伤早期组织损伤。
材料方法
一、实验动物及分组 实验采用纯种雄性大耳白兔40只，体重2.5±0.3kg，随机分成4组，每组10只，即：烫伤输液组(B组)；烫伤输液加蝮蛇抗栓酶治疗组(S组)；烫伤输液加山莨菪碱治疗组(A组)；烫伤输液加地塞米松治疗组(D组)。
二、动物模型及处理 实验前按常规喂养半月，观察动物有无足癣、感冒、食欲不振等症状，有者剔除不用。实验前1小时将兔背去毛，去毛面积约占总体表面积的25%，在氯胺酮(30mg/kg.i m)加戊巴比妥钠(15mg/kg.iv)复合麻醉下先行右侧颈静脉插管，接好输液装置。伤前5分钟采血作为自身对照血样，采血后回输等量的乳酸钠林格氏液。将动物去毛区浸入沸水(97℃)中13秒钟造成约25% TBSA Ⅲ度烫伤(经病检证实)，然后仰卧位固定于兔架上。伤后15分钟开始给予输液及相应药物治疗，各组林格氏液按Parkland公式计算输入，在S组中蝮蛇抗栓酶按0.02 U/kg/24hr加入50毫升林格氏液中滴入(约4小时滴完)，在A组中654-2按10mg/kg/24hr分为两次静脉注射，在D组中地塞米松按5mg/kg/24hr分为两次静脉注射，各组药物在伤后24小时后重复给一次。
三、样本采集及处理 各组动物分别于伤前5分钟及伤后2小时、6小时、12小时、24小时、48小时经颈静脉插管处采血4毫升，采血后回输等量林格氏液，迅速将采集的血液置于消毒的离心试管内，在室温下静置24小时后3000 rpm离心10分钟，分离血清，将得到的血清装入有盖塑料离心管内于-20℃冰箱内保存。
四、观察指标及检测方法 1.MDA含量测定：采用比色法(MDA药盒)测定； 2.LDH CK GOT酶活性测定：采用酶动力学法(药盒)测定。
五、实验仪器及试剂 1.SPECTRONIC-501自动生化分析仪：美国产； 2.LDH CK GOT 药盒：台湾元生公司产品；3.MDA 药盒：南京建成生物工程研究所产品； 4.蝮蛇抗栓酶：辽宁抚顺青峰制药厂生产； 5.盐酸山莨菪碱：江苏省东台市制药厂生产； 6.地塞米松：湖南制药厂生产。
六、统计学处理方法 所有数据均应用INSTAT统计软件进行方差分析及多个样本均数的两两比较(成组t检验)，数值以X±SD表示，以P<0.05为差异显著标准，P<0.01为差异非常显著标准。
实验结果
1.血清MDA含量变化 各组MDA含量在烫伤后24小时内均升高，但与自身伤前比较差异无显著性(P>0.05)。伤后48小时上升较明显，与自身伤前比较，B、A组差异有显著性(P<0.05)：D组差异极度显著(P<0.001):S组(P>0.05)，S组与B组比较，在48小时两者差异显著(P<0.05)。各组比较见表1。
2.血清CK活性变化 B组CK活性在伤后2小时明显升高，在伤后48小时内呈持续上升趋势，与自身伤前比较，在伤后6小时差异显著 (P<0.05)：12小时、24小时及48小时差异极度显著(P<0.001)，S组、A组和D组CK活性均显著低于B组，S组和A组CK值大致相当，各组比较见表2。
3.热损伤后血清GOT活性的变化 B组GOT活性在热损伤后2小时明显升高(P<0.05),在48小时内持续上升。S组GOT活性上升幅度明显低于B组，各组组内组间比较见表3。
表 1 MDA含量变化
| 时间 | 伤 前 | 伤后2小时 | 6小时 | 12小时 | 24小时 | 48小时 |
| B组 | 3.78±0.28 | 4.36±0.67 | 3.98±0.5 | 4.11±0.52 | 4.05±0.21 | 5.68±0.98*** |
| S组 | 3.57±0.49 | 3.69±0.29# | 3.46±0.35# | 3.33±0.35# | 3.82±0.35### | 4.18±0.48### |
| A组 | 3.49±0.43 | 4.56±0.52 | 4.08±0.45 | 3.67±0.29 | 3.77±0.49 | 5.16±0.73* |
| D组 | 3.47±0.31 | 3.68±0.20# | 3.51±0.37 | 3.61±0.42# | 4.04±0.39# | 4.87±0.22**# |
与B组比较 #P<0.05; ## P<0.01; ### P<0.001
表2 热损伤后CK活性变化
| 时间 | 伤 前 | 伤后2小时 | 6小时 | 12小时 | 24小时 | 48小时 |
| B组 | 860.0±234 | 5246±1041 | 11290±3937* | 17506±6865*** | 16961±6171*** | 286410±5754*** |
| S组 | 908.8±277 | 3128±1153 | 4580±1392*### | 5409±1895**### | 6249±2618**## | 5744±1827**###++ |
| A组 | 983.8±260 | 2297±1000 | 3547±1372### | 4152±1706### | 6132±3262**## | 7365±1289***### |
| D组 | 887.2±266 | 2945±983 | 4562±1301*### | 6554±2411***## | 10334±2070*** | 1331±2694***### |
与 B组比较 # P<0.05: ##P<0.01:### P<0.001 与 D组比较 +P<0.05: ++ P<0.01
表3 热损伤后GOT活性变化
| 时间 | 伤 前 | 伤后2小时 | 6小时 | 12小时 | 24小时 | 48小时 |
| B组 | 24.0±7.2 | 94.8±23.4 | 137.0±29.8*** | 141.0±18.9** | 163.8±21.9** | 196.0±34.7*** |
| S组 | 26.8±8.3 | 35.0±22.9# | 52.8±33.5 | 49.4±39.5 | 50.0±18.5 | 41.6±12.8# |
| A组 | 25.6±7.8 | 38.8±17.9 | 75.8±35.7 | 100.6±29.6*++ | 105.6±21.2** | 120.8±32.7***++ |
| D组 | 23.0±8.2 | 74.0±26.8 | 107.0±33.2 | 124.6±31.3***#+++ | 130.8±20.1*** | 38.0±35.7***+++ |
与B组比较 #P<0.05: ## P<0.01: ### P<0.001
与S组比较 +P<0.05: ++ P<0.01: +++ P<0.001
表4 热损伤后血清LDH活性变化
| 时间 | 伤 前 | 伤后2小时 | 6小时 | 12小时 | 24小时 | 48小时 |
| B组 | 68.0±26.5 | 282.7±93.9* | 333.3±80.1** | 308.8±101.3* | 346.2±110.7** | 393.0±121*** |
| S组 | 71.8±26.3 | 169.0±34.2* | 165.6±51.1* | 190.2±55.6** | 166.0±58.3* | 143.0±31.2## |
| A组 | 79.8±20.5 | 207.8±72.1 | 266.2±86.0* | 303.4±108.4**+++ | 291.0±108.9**+++ | 309.8±54.7***++ |
| D组 | 76.4±20.5 | 229.±72.3 | 236.6±119.1** | 274.0±62.0***+++ | 320.4±835***+++ | 380.6±65.9 ***+++ |
与B组比较 #P<0.05:## P<0.01: ### P<0.001.
与S组比较 +P<0.05:++ P0.01: +++ p<0.001.
4.热损伤后血清LDH活性变化 B组LDH活性在热损伤后2小时明显升高，在48小时内持续上升，S组上升幅度最低，且在48小时明显下降，接近正常水平。A组与D组LDH活性变化稍低于B组，各组组内及组间比较见表4。
讨 论
严重烧伤后可发生广泛的血管内皮细胞损伤、血管内溶血、心肌损伤、胃肠粘膜屏障损害、免疫抑制、超高代谢等多种继发性损伤[1] 。其原因复杂，当前认为，补体、白细胞、氧自由基和某些细胞因子在烧伤后组织细胞损伤中起较重要作用[2] ，严重烧伤后不仅局部出现微循环淤滞，而且全身血液粘滞度增高呈高凝状态，引起组织器官灌注不良，是导致组织细胞损伤的重要诱因[3] ，以往的研究表明抗凝药或溶栓药均能改善血液高粘滞综合征所致的损害。提示：在严重烧伤后应用抗凝血药或溶栓药治疗有可能使烧伤后继发性组织细胞损伤减轻[3] 。
一、热损伤后MDA含量变化及其意义 MDA为细胞膜脂质成分——多价不饱和脂肪酸的氧化分解产物，当体内形成的氧自由基(OFR)不能及时被清除时，就会发生脂质过氧化反应。目前已确认：缺血、再灌注、补体激活、吞噬细胞激活是OFR产生的重要途经。严重烧伤的病理过程往往要经历这些环节。本实验观察到，家兔严重烫伤后尽管给与了积极地抗休克治疗，仍然存在有明显的脂质过氧化反应，伤后48小时血清MDA含量明显升高，这与有关文献报道基本一致[4] 。但是，MDA含量为什么在伤后48小时才明显升高?推测其原因可能有：1.经补液抗休治疗后，烧伤淤滞带逐步恢复血液灌流，这一过程相当于一个缺血再灌注过程，使自由基产生增加；2.严重烧伤后发生菌血症，内毒素血症[5] ，使得烧伤炎症反应加剧，OFR的产生更多；3.急性期反应蛋白(ARP)在伤后逐步增高，其中CRP可升高达伤前的1000倍，CRP可与变性蛋白结合，激活补体[6，7，8，9] ，引起自由基产生。另外，创面毒性物质回吸收以及超氧化物歧化酶活性下降[4] 也与之相关。
烧伤后早期MDA含量升高，表明体内存在脂质过氧化反应，说明氧化性损伤是造成烧伤早期损伤的原因之一。
二、热损伤后血清CK、LDH、GOT活性的变化及其意义 CK、GOT、LDH广泛存在于组织细胞内，当发生组织细胞损害时，这些酶可释放出来，导致血清酶活性上升[10] ，本实验观察到：烧伤早期(伤后1小时)血清中这些酶活性即明显升高，且在伤后48小时内呈不断上升趋势，其原因可能有：1.热力直接损伤局部的血管内皮细胞，红细胞，及其它组织细胞，使细胞内酶漏入血中，可能是导致烧伤早期血清酶活性升高的重要原因[1] 。2.烧伤后补体系统激活，除有直接的膜攻击作用外，还介导白细胞活化，大量的氧自由基形成，造成局部或全身性血管内皮细胞损伤[2] 。3.热损伤后PLA2活性升高，PLA2可水解膜磷脂破坏细胞膜结构，引起白细胞的溶酶体酶释放，也是造组织细胞损伤的原因[11] 。4.热损伤早期血浆内皮素(ET)水平升高[12] ，可导致心肌损害引起血清酶活性增高。此外，内毒素血症可直接损伤血管内皮细胞，还可刺激单核巨噬细胞产生大量的肿瘤坏死因子(TNF)，引起组织损伤[13] 。
烧伤后血清早期CK、COT、LDH活性增高，表明确有组织细胞破坏，增高越明显，组织细胞损伤就越严重。
三、蝮蛇抗栓酶对烧伤早期组织损伤的影响 蝮蛇抗栓酶[14，15] 是从蝮蛇毒液中提取并纯化得到的精氨酸酯酶制剂，是分子量为3000-5000的糖蛋白，有类似凝血酶样作用(又称之为类血酶)，但与凝血酶又有很大差别，相似之处是都可使纤维蛋白原转变为纤维蛋白多聚体，不同之处是：类血酶所生成的多聚体其单体只能首尾相聚合，不能侧面聚合形成交连，是一种脆弱的可溶性微凝块，很容易被继发的纤溶作用所清除，再者，类血酶对纤维蛋白原有直接降解作用，使血液造成一种脱纤维蛋白原状态，类血酶还可使凝血酶原转变成为更难激活的中间体而起抗凝作用。由于其具有明显的抗凝、促纤溶作用，广泛用于脑血栓形成，高粘血症的治疗，并获得满意疗效[16，17，18，19] 。本实验观察到，蝮蛇抗栓酶能明显抑制烧伤血清MDA含量的升高及LDH、GOT、CK活性升高，提示抗栓酶对热损伤有保护作用其作用机制可能有：1.烧伤早期凝血系统被激活，血液呈高凝状态，烧伤局部微循环淤滞，重者有微血栓形成[1，3] ，蝮蛇抗栓酶能明显的降低血液纤维蛋白原，使PGI2/TXA2比值增高，及抑制凝血酶，抑制血小板聚集，促纤溶[20] 。结果使全血粘滞度降低，烧伤后循环淤滞得到改善，缺血再灌注损伤减轻。2.严重烧伤后红细胞变形能力明显下降，有明显的血管这内溶血[1] ，蝮蛇抗栓酶能增强红细胞的变形能力，并使其表面负电荷增强，使红细胞解聚，血管内溶血减轻[21，22] 。3.蝮蛇抗栓酶可使超氧化物歧化酶(SOD)活性升高，有助于氧自由基的清除[22] ，也可能是其抗损伤作用的机制之一。抗栓酶是否抑制补体系统的活化，白细胞的活化及内毒素血症，尚不清楚，有待深入研究。
应指出的是，蝮蛇抗栓酶是一种蛋白质，可引起过敏反应，在人体应用时要做皮试，另外，制剂不纯时，蛇毒中的其它成分(神经毒素，激肽释放酶)可造成不良影响，可能影响实验结果。目前，抗栓酶-3是较为理想的制剂[23] 。
本实验结果表明蝮蛇抗栓酶具有减轻烧伤早期组织细胞损伤的作用，为临床应用提供了新的理论根据。
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