胃癌相关蛋白GCRG213在胃癌细胞中特异性表达
王卫华,吴本俨, 伍银桥,尤纬缔,中国人民解放军总医院南楼消化科北京市 100853
国家自然科学基金资助课题,No.30370635
项目负责人:吴本俨,100853, 北京市复兴路28号,中国人民解放军总医院南楼消化科. weihua_wang1981@hotmail.com
电话:010-66935470 传真:010-66937393
收稿日期:2004-08-25 接受日期:2004-09-24
摘要
, 百拇医药
目的:观察来源于胃癌高表达基因GCRG213抗体在两种不同细胞的表达情况，评价GCRG213抗体的肿瘤特异性.
方法:应用免疫印迹方法对GCRG213抗体在胃癌细胞SGC-7901和胃上皮细胞HFE-145的表达进行比较分析.
结果:GCRG213抗体与胃癌SGC-7901细胞蛋白免疫结合后在相应大小位置有一清晰的特异性条带，而与胃上皮HFE-145细胞蛋白免疫结合后则无特异性条带出现，GCRG213抗体与两种细胞蛋白的结合存在明显差异.
结论:GCRG213抗体具有很强的肿瘤特异性.
, 百拇医药
王卫华,吴本俨, 伍银桥,尤纬缔. 胃癌相关蛋白GCRG213在胃癌细胞中特异性表达.世界华人消化杂志 2005;13(1):80-81
0 引言GCRG213是本实验室应用荧光标记的mRNA差异显示技术从我国人胃窦部腺癌组织、癌旁组织和正常胃黏膜组织筛选并克隆出的一条胃癌高表达基因序列，利用原核表达系统，我们高水平地表达了人GCRG213-Thio融合蛋白，并制备了GCRG213多克隆抗体[1].进一步研究GCRG213抗体在肿瘤细胞株和正常细胞株的表达以及胃癌组织、癌旁组织和正常胃组织的表达是验证此抗体特异性的重要步骤.为此，我们应用Westernblotting方法对分别起源于胃腺癌和胃上皮细胞的两种不同细胞系与GCRG213抗体结合的特异性进行了检测.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 兔抗胃癌相关蛋白GCRG213抗体由本实验室伍银桥博士制备并保存;胃上皮细胞株HFE-145，由美国Ashktorab教授馈赠;胃癌细胞株SGC-7901，购自上海细胞生物研究所;胎牛血清，RMPI1640培养基和胰蛋白酶均购自Gibco公司;RIPA裂解缓冲液，配方见分子克隆;Westernblotting发光试剂为SantaCruz公司产品;HRP-羊抗兔IgG购自北京中山生物技术公司;硝酸纤维素膜为Promega公司产品;Bio-RadMini电泳系列.
1.2 方法 胃癌SGC-7901细胞和胃上皮HFE-145细胞培养在含100mL/L胎牛血清的RMPI1640培养基中，3d换液/次，5d传代/次，无污染.细胞贴壁生长面积达培养瓶底部面积的90%且细胞生长状态良好时，2.5g/L胰蛋白酶消化并收集细胞，用RIPA裂解缓冲液分别裂解两种细胞.配制120g/L聚丙烯酰胺凝胶，各取细胞蛋白420ug进行SDS-PAGE，电泳结束后用2.5g/L考马斯亮蓝R-250染色，观察蛋白含量.用Bio-RadMini电泳仪在冰上将细胞蛋白转移至硝酸纤维素膜上，100V，1.5 h.用50g/L脱脂奶粉，4°C封闭过夜.次日，加兔抗GCRG213血清(1:500稀释)室温反应1h后，TBST洗膜.加HRP-羊抗兔IgG(1:10000稀释)室温反应45min;TBS洗膜.最后加入化学发光试剂，置室温3min后，X片显影，定影.
, 百拇医药
2 结果胃癌SGC-7901细胞和胃上皮HFE-145细胞经RIPA裂解缓冲液裂解后，其蛋白浓度均为28g/L.进行SDS-PAGE检测，显示均有多条蛋白条带(图1)，且各条带大小基本一致.经大肠杆菌表达的GCRG213-Thio融合蛋白Mr29 400.GCRG213抗体与胃癌SGC-7901细胞蛋白免疫结合后在相应大小位置有一清晰的特异性条带;而与胃上皮HFE-145细胞蛋白免疫结合后则无特异性条带出现(图2).经过重复实验，GCRG213多克隆抗体与胃癌SGC-7901细胞蛋白免疫结合后的特异性条带始终清晰可见.
图1(PDF)胃癌细胞和胃上皮细胞裂解产物的SDS-PAGE分析.1:Marker;2:胃癌SGC-7901细胞蛋白;3:胃上皮细胞HFE-145蛋白.
图2(PDF)胃癌细胞和胃上皮细胞蛋白的免疫印迹分析.1:Marker;2:胃癌细胞SGC-7901蛋白;3:胃上皮细胞HFE-145蛋白.
, 百拇医药
3 讨论胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一[2-9]，寻找胃癌相关基因对研究胃癌的发生发展有重要意义.资料表明各种癌基因、抑癌基因如ras、bcl-2、c-met、p53、p16、APC等参与胃癌的发生发展及演进过程，对胃癌的诊断和治疗有一定的参考意义[10-12]，但胃癌发生发展的完整的分子机制远未阐明，尚未发现公认的、临床适用的胃癌分子标志物[13].GCRG213基因是我们应用荧光标记的mRNA差异显示技术，从人胃窦部低分化腺癌组织中筛选并克隆出一条有意义的差异序列，其在癌旁组织和癌组织的表达明显高于正常组织[14-15].研究GCRG213基因功能可能有助于阐明癌变的机制，协助肿瘤的诊断、治疗和预后判断.为了进一步验证GCRG213抗体的肿瘤特异性，将其分别与胃癌SGC-7901细胞蛋白和胃上皮HFE-145细胞蛋白进行免疫印迹分析.结果表明，GCRG213抗体与胃癌SGC-7901细胞蛋白免疫结合后在相应位置有一清晰的特异性条带，而与胃上皮HFE-145细胞蛋白免疫结合后则无特异性条带出现，结果重复性好，说明该抗体有很强的肿瘤特异性.GCRG213抗体的Westernblotting分析实验结果与GCRG213基因原位杂交和Northern印迹实验结果相一致.
, 百拇医药
总之，GCRG213抗体验证实验的成功进一步证实了GCRG213基因与胃癌生物学行为的密切联系.下一步我们准备制备GCRG213单克隆抗体，用于GCRG213基因的功能研究和其在胃癌发生发展阶段中的作用，以期为胃癌临床诊断和治疗提供帮助.
4 参考文献1 伍银桥,王孟薇, 吴本俨,王刚石, 尤纬缔,王卫华. 兔抗胃癌相关蛋白GCRG213抗体的制备及鉴定.细胞与分子免疫学杂志
2004;20:174-177
2 Sun L, Wang X. Effects of allicin on both telomerase activity andapoptosis in gastric cancer SGC-7901 cells. World J
, 百拇医药
Gastroenterol 2003;9:1930-1934
3 Zhao GH, Li TC, Shi LH, Xia YB, Lu LM, Huang WB, Sun HL,Zhang YS.Relationship between inactivation of p16 gene and
gastric carcinoma. World J Gastroenterol2003;9:905-909
4 Zhao XH, Gu SZ, Liu SX, Pan BR. Expression of estrogen receptor andestrogen receptor messenger RNA in gastric
carcinoma tissues. World J Gastroenterol2003;9:665-669
, http://www.100md.com
5 Chen H, Wang LD, Guo M, Gao SG, Guo HQ, Fan ZM, Li JL. Alterationsof p53 and PCNA in cancer and adjacent tissues
from concurrent carcinomas of the esophagusand gastric cardia in the same patient in Linzhou, a high incidencearea
for esophageal cancer in northern China.World J Gastroenterol 2003;9:16-21
6 王孟薇,杨少波, 张子其,祝庆孚, 王刚石,李晖, 姚晨,吴本俨, 尤纬缔.老年人胃癌前黏膜癌变的胃镜随访.世界华人消
, 百拇医药
化杂志2003;11:1279-1281
7 沈波, 朱金水.胃癌供血及其动脉介入化疗的研究进展.世界华人消化杂志 2003;11:1425-1428
8 Ding YB, Chen GY, Xia JG, Zang XW, Yang HY, Yang L. Association ofVCAM-1 overexpression with oncogenesis, tumor
angiogenesis and metastasis of gastriccarcinoma. World J Gastroenterol 2003;9:1409-1414
9 Li HX, Chang XM, Song ZJ, He SX. Correlation between expression ofcyclooxygenase-2 and angiogenesis in human
, http://www.100md.com
gastric adenocarcinoma. World JGastroenterol 2003;9:674-677
10 李宏武,单吉贤. HGF/SFc-met 基因信号异常与胃肠道恶性肿瘤.世界华人消化杂志 2003;11:1749-1751
11 李贵新,李国庆, 赵常在,徐功立.胃癌组织端粒酶hTRT与抑癌基因p53和p16 表达的关系.世界华人消化杂志
2002;10:591-593
12 Lee HW, Lee SS, Lee SJ, Um HD. Bcl-w is expressed in a majority ofinfiltrative gastric adenocarcinomas and suppresses
the cancer cell death by blockingstress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinaseactivation.Cancer Res
, 百拇医药
2003;5:1093-1100
13 郝冬梅,孙秀菊, 郑志红,贺光, 马鸣超,徐惠绵, 王梅先,孙开来.胃癌癌前病变相关基因的筛查及表达研究.世界华人消
化杂志 2003;11:6-9
14 伍银桥,王刚石, 王孟薇,吴本俨, 尤纬缔,王卫华. 胃癌相关基因GCRG213在大肠杆菌中的表达及重组蛋白纯化.解放军
医学杂志 2004;29:406-408
15 Wang GS, Wang MW, Wu BY, Liu XB, You WD, Yang XY. A gene encodingan apurinic/apyrimidinic endonuclease-like
protein is up-regulated in human gastriccancer. World J Gastroenterol 2003;9:1196-1201
编辑 张海宁, http://www.100md.com( 王卫华, 吴本俨, 伍银桥, 尤纬缔)
国家自然科学基金资助课题,No.30370635
项目负责人:吴本俨,100853, 北京市复兴路28号,中国人民解放军总医院南楼消化科. weihua_wang1981@hotmail.com
电话:010-66935470 传真:010-66937393
收稿日期:2004-08-25 接受日期:2004-09-24
摘要
, 百拇医药
目的:观察来源于胃癌高表达基因GCRG213抗体在两种不同细胞的表达情况，评价GCRG213抗体的肿瘤特异性.
方法:应用免疫印迹方法对GCRG213抗体在胃癌细胞SGC-7901和胃上皮细胞HFE-145的表达进行比较分析.
结果:GCRG213抗体与胃癌SGC-7901细胞蛋白免疫结合后在相应大小位置有一清晰的特异性条带，而与胃上皮HFE-145细胞蛋白免疫结合后则无特异性条带出现，GCRG213抗体与两种细胞蛋白的结合存在明显差异.
结论:GCRG213抗体具有很强的肿瘤特异性.
, 百拇医药
王卫华,吴本俨, 伍银桥,尤纬缔. 胃癌相关蛋白GCRG213在胃癌细胞中特异性表达.世界华人消化杂志 2005;13(1):80-81
0 引言GCRG213是本实验室应用荧光标记的mRNA差异显示技术从我国人胃窦部腺癌组织、癌旁组织和正常胃黏膜组织筛选并克隆出的一条胃癌高表达基因序列，利用原核表达系统，我们高水平地表达了人GCRG213-Thio融合蛋白，并制备了GCRG213多克隆抗体[1].进一步研究GCRG213抗体在肿瘤细胞株和正常细胞株的表达以及胃癌组织、癌旁组织和正常胃组织的表达是验证此抗体特异性的重要步骤.为此，我们应用Westernblotting方法对分别起源于胃腺癌和胃上皮细胞的两种不同细胞系与GCRG213抗体结合的特异性进行了检测.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 兔抗胃癌相关蛋白GCRG213抗体由本实验室伍银桥博士制备并保存;胃上皮细胞株HFE-145，由美国Ashktorab教授馈赠;胃癌细胞株SGC-7901，购自上海细胞生物研究所;胎牛血清，RMPI1640培养基和胰蛋白酶均购自Gibco公司;RIPA裂解缓冲液，配方见分子克隆;Westernblotting发光试剂为SantaCruz公司产品;HRP-羊抗兔IgG购自北京中山生物技术公司;硝酸纤维素膜为Promega公司产品;Bio-RadMini电泳系列.
1.2 方法 胃癌SGC-7901细胞和胃上皮HFE-145细胞培养在含100mL/L胎牛血清的RMPI1640培养基中，3d换液/次，5d传代/次，无污染.细胞贴壁生长面积达培养瓶底部面积的90%且细胞生长状态良好时，2.5g/L胰蛋白酶消化并收集细胞，用RIPA裂解缓冲液分别裂解两种细胞.配制120g/L聚丙烯酰胺凝胶，各取细胞蛋白420ug进行SDS-PAGE，电泳结束后用2.5g/L考马斯亮蓝R-250染色，观察蛋白含量.用Bio-RadMini电泳仪在冰上将细胞蛋白转移至硝酸纤维素膜上，100V，1.5 h.用50g/L脱脂奶粉，4°C封闭过夜.次日，加兔抗GCRG213血清(1:500稀释)室温反应1h后，TBST洗膜.加HRP-羊抗兔IgG(1:10000稀释)室温反应45min;TBS洗膜.最后加入化学发光试剂，置室温3min后，X片显影，定影.
, 百拇医药
2 结果胃癌SGC-7901细胞和胃上皮HFE-145细胞经RIPA裂解缓冲液裂解后，其蛋白浓度均为28g/L.进行SDS-PAGE检测，显示均有多条蛋白条带(图1)，且各条带大小基本一致.经大肠杆菌表达的GCRG213-Thio融合蛋白Mr29 400.GCRG213抗体与胃癌SGC-7901细胞蛋白免疫结合后在相应大小位置有一清晰的特异性条带;而与胃上皮HFE-145细胞蛋白免疫结合后则无特异性条带出现(图2).经过重复实验，GCRG213多克隆抗体与胃癌SGC-7901细胞蛋白免疫结合后的特异性条带始终清晰可见.
图1(PDF)胃癌细胞和胃上皮细胞裂解产物的SDS-PAGE分析.1:Marker;2:胃癌SGC-7901细胞蛋白;3:胃上皮细胞HFE-145蛋白.
图2(PDF)胃癌细胞和胃上皮细胞蛋白的免疫印迹分析.1:Marker;2:胃癌细胞SGC-7901蛋白;3:胃上皮细胞HFE-145蛋白.
, 百拇医药
3 讨论胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一[2-9]，寻找胃癌相关基因对研究胃癌的发生发展有重要意义.资料表明各种癌基因、抑癌基因如ras、bcl-2、c-met、p53、p16、APC等参与胃癌的发生发展及演进过程，对胃癌的诊断和治疗有一定的参考意义[10-12]，但胃癌发生发展的完整的分子机制远未阐明，尚未发现公认的、临床适用的胃癌分子标志物[13].GCRG213基因是我们应用荧光标记的mRNA差异显示技术，从人胃窦部低分化腺癌组织中筛选并克隆出一条有意义的差异序列，其在癌旁组织和癌组织的表达明显高于正常组织[14-15].研究GCRG213基因功能可能有助于阐明癌变的机制，协助肿瘤的诊断、治疗和预后判断.为了进一步验证GCRG213抗体的肿瘤特异性，将其分别与胃癌SGC-7901细胞蛋白和胃上皮HFE-145细胞蛋白进行免疫印迹分析.结果表明，GCRG213抗体与胃癌SGC-7901细胞蛋白免疫结合后在相应位置有一清晰的特异性条带，而与胃上皮HFE-145细胞蛋白免疫结合后则无特异性条带出现，结果重复性好，说明该抗体有很强的肿瘤特异性.GCRG213抗体的Westernblotting分析实验结果与GCRG213基因原位杂交和Northern印迹实验结果相一致.
, 百拇医药
总之，GCRG213抗体验证实验的成功进一步证实了GCRG213基因与胃癌生物学行为的密切联系.下一步我们准备制备GCRG213单克隆抗体，用于GCRG213基因的功能研究和其在胃癌发生发展阶段中的作用，以期为胃癌临床诊断和治疗提供帮助.
4 参考文献1 伍银桥,王孟薇, 吴本俨,王刚石, 尤纬缔,王卫华. 兔抗胃癌相关蛋白GCRG213抗体的制备及鉴定.细胞与分子免疫学杂志
2004;20:174-177
2 Sun L, Wang X. Effects of allicin on both telomerase activity andapoptosis in gastric cancer SGC-7901 cells. World J
, 百拇医药
Gastroenterol 2003;9:1930-1934
3 Zhao GH, Li TC, Shi LH, Xia YB, Lu LM, Huang WB, Sun HL,Zhang YS.Relationship between inactivation of p16 gene and
gastric carcinoma. World J Gastroenterol2003;9:905-909
4 Zhao XH, Gu SZ, Liu SX, Pan BR. Expression of estrogen receptor andestrogen receptor messenger RNA in gastric
carcinoma tissues. World J Gastroenterol2003;9:665-669
, http://www.100md.com
5 Chen H, Wang LD, Guo M, Gao SG, Guo HQ, Fan ZM, Li JL. Alterationsof p53 and PCNA in cancer and adjacent tissues
from concurrent carcinomas of the esophagusand gastric cardia in the same patient in Linzhou, a high incidencearea
for esophageal cancer in northern China.World J Gastroenterol 2003;9:16-21
6 王孟薇,杨少波, 张子其,祝庆孚, 王刚石,李晖, 姚晨,吴本俨, 尤纬缔.老年人胃癌前黏膜癌变的胃镜随访.世界华人消
, 百拇医药
化杂志2003;11:1279-1281
7 沈波, 朱金水.胃癌供血及其动脉介入化疗的研究进展.世界华人消化杂志 2003;11:1425-1428
8 Ding YB, Chen GY, Xia JG, Zang XW, Yang HY, Yang L. Association ofVCAM-1 overexpression with oncogenesis, tumor
angiogenesis and metastasis of gastriccarcinoma. World J Gastroenterol 2003;9:1409-1414
9 Li HX, Chang XM, Song ZJ, He SX. Correlation between expression ofcyclooxygenase-2 and angiogenesis in human
, http://www.100md.com
gastric adenocarcinoma. World JGastroenterol 2003;9:674-677
10 李宏武,单吉贤. HGF/SFc-met 基因信号异常与胃肠道恶性肿瘤.世界华人消化杂志 2003;11:1749-1751
11 李贵新,李国庆, 赵常在,徐功立.胃癌组织端粒酶hTRT与抑癌基因p53和p16 表达的关系.世界华人消化杂志
2002;10:591-593
12 Lee HW, Lee SS, Lee SJ, Um HD. Bcl-w is expressed in a majority ofinfiltrative gastric adenocarcinomas and suppresses
the cancer cell death by blockingstress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinaseactivation.Cancer Res
, 百拇医药
2003;5:1093-1100
13 郝冬梅,孙秀菊, 郑志红,贺光, 马鸣超,徐惠绵, 王梅先,孙开来.胃癌癌前病变相关基因的筛查及表达研究.世界华人消
化杂志 2003;11:6-9
14 伍银桥,王刚石, 王孟薇,吴本俨, 尤纬缔,王卫华. 胃癌相关基因GCRG213在大肠杆菌中的表达及重组蛋白纯化.解放军
医学杂志 2004;29:406-408
15 Wang GS, Wang MW, Wu BY, Liu XB, You WD, Yang XY. A gene encodingan apurinic/apyrimidinic endonuclease-like
protein is up-regulated in human gastriccancer. World J Gastroenterol 2003;9:1196-1201
编辑 张海宁, http://www.100md.com( 王卫华, 吴本俨, 伍银桥, 尤纬缔)
