一、增殖细胞核抗原基因反义RNA表达质粒的

    构建及对人胃癌细胞的抑瘤效应

    戴林 张学庸 惠宏襄 王成济 樊代明

    【摘要】 目的 观察增殖细胞核抗原(PCNA)基因反义RNA表达质粒对人胃癌细胞生长特性的影响，探讨其抗肿瘤作用。方法 用DNA重组方法将人PCNA基因反向克隆到真核表达质粒pDOR-neo中，构建成人PCNA基因真核表达质粒pDR-PCNA，用脂质体介导转染人胃癌细胞系SGC-7901。结果 经G418筛选获得转染细胞SGC/PCNA，与亲本细胞相比，其生长速度减慢，RNA、蛋白质的生物合成受到抑制，S期、G2/M期DNA含量降低。结论 PCNA基因反义RNA对胃癌细胞的生长具有明显的抑制作用。

    【主题词】 胃肿瘤 细胞株 增殖细胞核抗原 RNA，反义 基因治疗

    增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助因子，在DNA复制、细胞增殖及细胞周期调控中发挥重要作用。PCNA在许多肿瘤组织中都有高表达，并随肿瘤浸润深度增加及转移，其表达呈明显上升趋势。Sakakura等用18-mer PCNA反义ODN抑制了多种胃癌细胞系的生长。提示PCNA与肿瘤发生、发展关系密切，有可能成为肿瘤基因治疗的靶点。为研究PCNA基因与胃癌的关系，探索胃癌基因治疗的靶基因，我们构建了人PCNA基因反义RNA真核表达质粒，并观察其对人胃癌细胞的抑瘤效应。

    材料与方法

    ⒈基因与载体：pT7hPCNA质粒由美国冷泉港分子生物学实验室Waga博士惠赠，在其表达载体p30382XT的Xbal、BamHI位点间插有人PCNA基因。真核细胞表达质粒pDOR-neo由英国皇家癌症研究会Morgenstem博士惠赠。

    ⒉主要试剂：Lipofect amineTM脂质体药盒购自Gibco公司，G418购自Sigma公司，[α-32p]UTP购自北京福瑞公司，限制性内切酶、连接酶购自华美生物技术有限公司。

    ⒊质粒制备：DNA片段回收、DNA连接、细菌转化及基因鉴定参照《分子克隆实验指南》进行。

    ⒋DNA转染：用Lipofect AMINETM介导将空载质粒pDOR-neo及重组质粒pDR-PCNA转染至人胃癌细胞SGC-7901(由军事医学科学院毒物药物研究所引入)，分别命名为SGC/neo和SGC/PCNA，并以SGC-7901作为阴性对照。转染72小时后，用G418(400μg/ml)筛选3周，挑取单个抗性细胞在G418(100μg/ml)下常规培养扩增 ......